Thử nghiệm môi trường nuôi cấy vi khuẩn mutans streptococci và lactobacilli

Nghiên cứu có mục tiêu nhằm phân lập được chủng thuộc nhóm mutans streptococci và lactobacilli từ mẫu lâm sàng là nước bọt lấy từ bệnh nhân sâu răng và xác định môi trường đặc trưng và chọn lọc cho các nhóm vi khuẩn này.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 THỬ NGHIỆM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI KHUẨN MUTANS STREPTOCOCCI VÀ LACTOBACILLI Cao Hữu Tiến*, Nguyễn Thị Thu Hiền*, Vũ Thị Lan Hương* TĨM TẮT Mục đích: Phân lập chủng thuộc nhóm mutans streptococci lactobacilli từ mẫu lâm sàng nước bọt lấy từ bệnh nhân sâu xác định môi trường đặc trưng chọn lọc cho nhóm vi khuẩn Phương pháp nghiên cứu: Mẫu nước bọt từ bệnh nhân có sâu thu thập, sau phân lập vi khuẩn làm Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa khảo sát để định danh vi khuẩn, sau ni cấy thử nghiệm lên số mơi trường khác Kết quả: Phân lâp hai chủng L1 L2 thuộc lactobacilli hai chủng S1 S3 thuộc nhóm mutans streptococci Mật độ tế bào lactobacilli môi trường Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) môi trường Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) tương đương Mật độ khuẩn lạc môi trường Mitis Salivarius Bacitracin Agar nhiều mật độ khuẩn lạc môi trường Mitis Salivarius Agar Kết luận: Mơi trường thích hợp cho lactobacilli Rogosa SL Lactobacilli MRS, môi trường Rogosa SL chọn lọc cho lactobacilli miệng thành phần muối Rogosa SL vượt mức cho phép phân lập lactobacilli từ sữa Môi trường chọn lọc cho mutans streptococci Mitis Salivarius Bacitracin Agar Từ khóa: sâu răng, lactobacilli, mutans streptococci ABSTRACT BACTERIAL CUTURE MEDIA FOR MUTANS STREPTOCOCCI AND LACTOBACILLI Cao Huu Tien, Nguyen Thi Thu Hien, Vu Thi Lan Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No - 2012: 210 - 219 Objectives: To isolate strains of mutans streptococci and lactobacilli from saliva samples of patients suffering from tooth decay and determine the selective media for those group of bacteria Methods: Bacteria are isolated from salivary samples collecting from tooth decay patients Morphological, physiological and biochemical characteristics are observed to identify bacteria, and then inoculated to test onto variety of culture media Results: Two strains of lactobacilli (L1, L2) and two strains of group of mutans streptococci (S1, S3) have isolated Lactobacilli cell density on Lactobacilli MRS Broth (1,1x109 N/ml) and Rogosa SL Broth (0,85x109 N/ml) is equivalent The density of colonies on Mitis Salivarius Bacitracin Agar is more than the density of colonies on Mitis Salivarius Agar Conclusions: Culture media for lactobacilli are Rogosa SL and Lactobacilli MRS, however, Rogosa SL is more selective for oral lactobacilli because high salt content in Rogosa SL is not suitable for isolating lactobacilli from milk Selective media for mutans streptococci is Mitis Salivarius Bacitracin Agar Key words: caries, lactobacilli, mutans streptococci * Bộ môn Sức khỏe miệng – Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: BS Cao Hữu Tiến, ĐT: 0909464212 Email: caohuutien@gmail.com 210 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâu bệnh khởi phát thời gian dài trước nhìn thấy lâm sàng, việc đánh giá sâu giai đoạn sớm sang thương chưa nhìn thấy quan trọng Xác định nguy sâu bệnh nhân giúp đảm bảo mức dự phòng điều trị thích hợp Một phương pháp đánh giá nguy sâu thường sử dụng đếm số lượng mutans streptococci lactobacilli nước bọt Tuy nhiên, để làm xét nghiệm phải dựa vào kit làm sẵn hãng nước ngồi với chi phí cao gây khó khăn cho việc ứng dụng, đặc biệt nghiên cứu khoa học Chính để có mơi trường ni cấy chọn lọc tự làm hai nhóm vi khuẩn phục vụ cho nghiên cứu nha khoa ứng dụng lâm sàng điều cần thiết Mục tiêu đề tài phân lập chủng thuộc nhóm mutans streptococci lactobacilli từ mẫu lâm sàng nước bọt lấy từ bệnh nhân bị sâu răng, sau tham khảo, tìm hiểu mơi trường mà chủng có khả diện xác định môi trường đặc trưng chọn lọc cho chủng vi khuẩn khảo sát Nghiên cứu Y học Dung dịch hydrogen peroxide 30% chai màu nâu, tránh ánh sáng Phẩm nhuộm Gram Môi trường Mitis Salivarius Agar (MSA) (MT1) Mitis Salivarius Bacitracin Agar (MSB) (MT2): mơi trường MSA có bổ sung 20% saccharose 0.2 units/ml Bacitracin Mitis Salivarius Bacitracin Broth (MT3) Rogosa SL Agar (MT4) Rogosa SL Agar có bổ sung 0,5% CaCO3 (MT4’) Rogosa SL Broth (MT5) Môi trường tổng hợp Lactobacilli MRS Agar (MT6) Môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) Môi trường Luria-Bertani (LB) (MT8) Môi trường Phenol Red Mannitol Broth (MT9) Môi trường Blood Agar (Thạch máu) (MT10) Phương pháp thực * Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm: Thu mẫu từ bệnh nhân VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện nghiên cứu Dụng cụ Bình ủ kỵ khí Phân lập vi khuẩn làm Giữ giống Pipetman 1000, 100 Pipet 1.0ml, 10.0ml Tủ cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vơ trùng, kính hiển vi, kính lúp,… Hóa chất Một số hóa chất cần thiết cho mơi trường ni cấy Anaerocult® A (của hãng MERCK KGaA) chứa thành phần hóa học mà kết hợp với oxy nhanh chóng hồn tồn, tạo mơi trường khơng có O2 (kỵ khí) bầu khơng khí CO2 dùng để ni kỵ khí Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Chọn chủng để thử nghiệm nuôi cấy Kết luận Mẫu nước bọt Mẫu nước bọt lấy từ bệnh nhân có sâu Cách lấy mẫu Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 211 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Trong vòng 90 phút trước thu thập nước bọt, u cầu nhóm đối tượng cho nước bọt khơng ăn uống thứ gì, khơng nhai kẹo cao su, không đánh sử dụng nước súc miệng Thời gian lấy nước bọt vào khoảng 30 đến 11 sáng Các bước thực hiện: Cho đối tượng ngồi thẳng tư thoải mái, đầu nghiêng nhẹ phía trước Quan sát chọn khuẩn lạc vi khuẩn rời rạc khác nhau, có vòng phân giải CaCO3 xung quanh khuẩn lạc mọc mơi trường MT4’ Sau tiếp tục cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT4 nhiều lần thu khuẩn lạc đồng hình thái Giữ giống mơi trường MT10 Đối với mutans streptococci Kích thích tiết nước bọt cách cho nhai mẫu paraffin Tương tự lactobacilli, tiến hành trải môi trường MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, điều kiện kỵ khí (5-10%CO2) Thu nhận đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ Tương tự lactobacilli, cấy ria sang đĩa Petri chứa môi trường MT2 Giữ giống môi trường MT10 Nước bọt thu thập ống nghiệm tiệt trùng Phương pháp khảo sát đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập Ngay trước thu mẫu nước bọt, yêu cầu đối tượng nuốt lần cuối tất lượng nước bọt có miệng Thời gian thu thập phút Khảo sát khả di động Mẫu bảo quản tủ đông đá Đối với lactobacilli, chủng nuôi cấy lỏng môi trường MT5, ủ 35±10C, 72 điều khiện kỵ khí; với mutans streptococci, chủng ni cấy MT3, ủ 37±10C, 48 giờ, điều kiện kỵ khí Dùng que cấy khử trùng lấy vi khuẩn dùng pipetman hút huyền phù tế bào vi khuẩn nuôi cấy 2-3 ngày, để vào miếng lame sạch, đặt miếng lamelle lên cho khơng tạo bọt khí Quan sát kính hiển vi vật kính x10, sau chuyển sang quan sát vật kính x40 Mẫu nước bọt pha lỗng theo dãy thập phân Phương pháp ni kỵ khí Xếp đĩa Petri ống nghiệm vào bình kỵ khí Lấy 35ml nước đổ lên Anaerocult® A cho chảy đều, sau nhanh chóng bỏ vào bình kỵ khí đậy nắp lại Chú ý không 15-20 giây Anaerocult ® A có tác dụng sau màu sắc Anaerocult ® A chuyển từ màu trắng sang màu xanh dương Phân lập làm chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt Đối với lactobacilli Pha loãng mẫu nước muối 0,9% vô trùng Dùng pipetman hút 0,1ml mẫu độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 vào đĩa Petri có chứa môi trường MT4’, tiến hành trải que gạt Mỗi độ pha loãng trải đĩa liên tiếp Ủ 35±10C, 72 điều khiện kỵ khí (510%CO2), ta thu nhận đĩa có khuẩn lạc mọc riêng lẻ 212 Nhuộm Gram(1) Nhuộm tím kết tinh (Crystal violet) phút Nhuộm Lugol phút Rửa nước Tẩy alcol cách để nghiêng tiêu bản, cho alcol chảy từ từ mép phiến kính Quan sát mép giọt alcol vừa màu tím Rửa nước Nhuộm bổ sung Safranin Fuchsin từ 10 – 30 giây Rửa nước Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Để mẫu khô tự nhiên xem kính hiển vi (x100) Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase(7) Tiến hành: Đối với lactobacilli, chủng nuôi cấy lỏng môi trường MT4, ủ 35±10C, 72 điều khiện kỵ khí Đối với mutans streptococci, chủng nuôi cấy MT2, ủ 37±10C, 48 giờ, điều kiện kỵ khí Thử nghiệm phiến kính: dùng que cấy lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặt miếng lame Dùng pipet nhựa hút H2O2 30% nhỏ giọt lên sinh khối vi sinh vật lame Ghi nhận sủi bọt có Chủng dùng làm đối chứng E.coli Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) có tượng sủi bọt khí O2 tạo ra, ngược lại (-) khơng có sủi bọt khí Thử nghiệm khả lên men đường Mannitol Tiến hành: Cấy chủng vào ống môi trường MT9 ống nghiệm chuẩn bị que cấy vòng từ chủng làm môi trường chon lọc Sau cấy, ủ 35±10C 72 giờ, 5-10% CO2 lactobacilli 37±10C 48 giờ, 5-10%CO2 mutans streptococci Đọc kết quả: Khả lên men chủng đánh giá dựa vào sinh acid Sinh acid (+) môi trường với chất thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại mơi trường có mà đỏ sinh acid (-) Phương pháp dựng đường tương quan mật độ tế bào OD550nm - Chủng đại diện cho lactobacilli đem nuôi cấy lỏng môi trường MT8, ủ 35±10C 72 giờ, 5-10% CO2 - Pha loãng huyền phù tế bào lactobacilli cho thu huyền phù có OD550nm đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 ghi nhận Nghiên cứu Y học số đo thực tế Pha loãng mẫu theo dãy thập phân cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để xuất khuẩn lạc riêng lẻ bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số đếm tính tốn - Hút 0,1ml dịch vi khuẩn độ pha lỗng thích hợp vào đĩa Petri có chứa mơi trường MT6 tiến hành cấy trải Ủ 35±10C, 72 điều kiện kỵ khí (5-10% CO2) Sau đếm số khuẩn lạc đĩa Petri độ pha loãng để xác định mật độ tế bào (N/ml) huyền phù này, ghi nhận kết - Tính giá trị log(N/ml) cho giá trị mật độ N/ml tương ứng với giá trị OD550nm * Cách tính: Số khuẩn lạc (N) xác định cách đếm (25 ≤ N ≤ 300) Mật độ tế bào (N/ml) số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) 1ml mẫu ( N / ml )  Với chọn N n1vf1   ni vf i N: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa ni: Số lượng đĩa Petri cấy độ pha loãng thứ i v: Thể tích dịch mẫu sử dụng để cấy trải vào đĩa (0,1ml) fi: Độ pha loãng tương ứng Tính log(N/ml) - Vẽ đường biểu diễn log(N/ml) (trục tung) theo OD550nm (trục hồnh) theo chương trình vẽ biểu đồ Microsoft Excel 2003 Phương pháp so sánh mật độ tế bào môi trường Đối với lactobacilli Nuôi cấy lỏng lactobacilli hai môi trường MT5 MT7 Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc chủng lactobacilli cấy sang ống nghiệm có chứa khoảng 15ml môi trường MT5 MT7, ủ 35±10C, 72 điều kiện kỵ khí (5-10%CO2) Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 213 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Sau tiến hành pha lỗng dịch mẫu cho OD550nm có giá trị nằm khoảng 0,1-0,5 Ghi nhận giá trị OD550nm hệ số pha loãng Từ giá trị OD550nm thu được, thay vào phương tình đường thẳng suy từ đồ thị Ta giá trị Log(N/ml) Từ Log(N/ml), ta tính N/ml Mật độ tế bào có 1ml = N/ml x hệ số pha loãng Đối với mutans streptococci Kết phân lập hai chủng có vòng phân giải CaCO3, kí hiệu L1, L2 Cả hai chủng có khuẩn lạc tròn, ướt Tuy nhiên khuẩn lạc L1 lồi, có màu trắng sữa; khuẩn lạc L2 có màu trắng đục nhơ hình nón (bảng 3.1) Bảng 3.1: Đặc điểm khuẩn lạc chủng L1, L2 Chủng vi khuẩn L1 L2 Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc tròn, lồi, màu trắng sữa, ướt nhầy Khuẩn lạc tròn, nhơ lên hình nón, màu trắng đục, ướt Sử dụng đĩa Petri có ngăn phần, phần chứa mơi trường để so sánh mật độ Nuôi cấy chủng mutans streptococci phân lập hai môi trường MT1 MT2 Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc chủng S1 cấy đường thẳng lên hai mơi trường đĩa Petri có ngăn phần Ủ 37±10C, 48 điều kiện kỵ khí (510%CO2) Sau quan sát diện khuẩn lạc hai môi trường KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập sơ vi khuẩn từ mẫu nước bọt Phân lập lactobacilli Theo nghiên cứu số tác Johannes Van Houte cs (1972)(9); P.W.Caufield cs (2007)(4)…, lactobacilli phân lập từ nước bọt, mảng bám bề mặt biểu mô miệng môi trường thạch Rogosa SL Rogosa SL môi trường cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho lactobacilli, muối sodium acetate, ammonium citrate ức chế phát triển hầu hết vi sinh vật, bao gồm Streptococcus Việc bổ sung acid acetic giúp phát triển lactobacilli tốt ức chế vi khuẩn khác Lactobacilli trực khuẩn có khả sinh acid lactic nên có khả làm tan CaCO3 Từ lý trên, để phát khẳng định tốt hơn, phân lập lactobacilli từ mẫu lâm sàng nước bọt bệnh nhân sâu môi trường thạch Rogosa SL có bổ sung 0,5% CaCO3 214 Hình 1: Khuẩn lạc chủng L1 L2 Phân lập mutans streptococci Tương tự, phân lập mutans streptococci môi trường chọn lọc cho mutans streptococci Mitis Salivarius Bacitracin Agar Mơi trường có Crystal violet Trypan blue ức chế hầu hết trực khuẩn Gram âm hầu hết vi khuẩn Gram dương trừ Streptococcus, cung cấp nguồn đường (sucrose) dồi cho q trình chuyển hóa, đặc biệt Bacitracin kháng sinh cho phép chọn lọc mutans streptococci Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Trên môi trường phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu nước bọt, kí hiệu S1,S2, S3 Đặc điểm chủng S1, S2, S3 mô tả bảng 3.2 Bảng 3.2: Đặc điểm khuẩn lạc chủng S1, S2 S3 Chủng vi Nghiên cứu Y học khuẩn S1 S2 S3 Khuẩn lạc nhỏ, tròn lồi, cứng, ăn sâu vào thạch, có lớp bóng sáng bề mặt khuẩn lạc Khuẩn lạc lớn, màu xanh nhạt, mờ đục Khuẩn lạc nhỏ, cứng, tròn lồi Đặc điểm khuẩn lạc Hình 2: Khuẩn lạc chủng S1, S2 S3 Khảo sát đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập Đối với lactobacilli Sau nuôi cấy lỏng hai chủng L1 L2 môi trường MT5 35±10C, 72 điều kiện kỵ khí Tiến hành khảo sát khả di động đặc tính Gram hai chủng L1 L2 Nhận thấy, chủng L1 vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương có khả di động; chủng L2 vi khuẩn hình que, dạng chuỗi, Gram dương không di động (bảng 3.3) Bảng 3.3: Các đặc điểm tế bào chủng L1 L2 Chủng vi khuẩn L1 L2 Hình dạng tế bào Khả di Gram động Hình que, dạng chuỗi + + Hình que, dạng đơn + Hình 3: Nhuộm Gram chủng L1 L2 Đặc điểm hai chủng L1 L2 giống với đặc điểm lactobacili theo lý thuyết trực khuẩn hình que Gram dương Đối với mutans streptococci Tương tự lactobacilli, sau nuối cấy 37±10C, 48 điều kiện kỵ khí Tiến hành khảo sát khả di động đặc tính Gram ba chủng S1, S2 S3 Kết thu ba Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 215 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học chủng có tế bào hình cầu, Gram dương, không di động (bảng 4) Bảng 4: Các đặc điểm tế bào chủng S1, S2 S3 Chủng vi khuẩn Hình dạng tế bào S1 S2 S3 Hình cầu, dạng chuỗi Hình cầu, dạng đơi Hình cầu, dạng chuỗi - + + + Khả Gram di động Hình 3.4: Nhuộm Gram chủng S1, S2 S3 Từ kết khảo sát đặc điểm tế bào chủng S1, S2và S3, nhận thấy đặc điểm ba chủng phù hợp với đặc điểm mutans streptococci theo lý thuyết vi khuẩn hình cầu dạng đơn, đôi hay chuỗi, Gram dương không di động Thử nghiệm nghiệm sinh hóa Thử nghiệm catalase Cả chủng L1, L2 cho kết thử nghiệm catalase âm tính E.coli L1 Chủng S2 cho kết thử nghiệm catalase dương tính Hai chủng S1 S3 cho kết thử nghiệm catalase âm tính Từ thử nghiệm Catalase cho kết chủng S2 dương tính So với đặc điểm nhóm mutans streptococci catalase âm tính, S2 khơng thuộc nhóm mutans streptococci E.coli L2 Hình 5: Thử nghiệm catalase chủng L1 L2 216 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 E.coli S1 Nghiên cứu Y học E.coli S2 E.coli S3 Hình 6: Thử nghiệm catalase chủng S1, S2 S3 Cả bốn chủng L1, L2, S1, S3 có khả lên men đường mannitol sinh acid làm chất thị phenol đỏ chuyển màu vàng Điều chứng tỏ chủng có khả sinh acid từ lên men đường Từ đặc điểm tế bào khảo sát được, kết thử nghiệm sinh hóa với đặc điểm lactobacilli mutans streptococci theo lý thuyết, kết thu được: - Chủng L1 L2 thuộc lactobacilli - Chủng S1 S3 thuộc nhóm mutans streptococci Chọn chủng L1 đại diện cho lactobacilli chủng S1 đại diện cho mutans streptococci để thử nghiệm nuôi cấy môi trường Thử nghiệm nuôi cấy môi trường khác Đối với chủng thuộc lactobacilli Chúng nuôi cấy lỏng chủng L1 môi trường Lactobacilli MRS Broth, để dựng đường tương quan mật độ tế bào OD550nm Kết đo mật độ quang ống nghiệm để dựng đồ thị bảng 3.5 Bảng 5: Kết đo OD550nm để dựng đường tương quan Ống nghiệm OD550nm OD 1,275 1,381 1,469 0,106 0,194 1,587 0,312 1,693 1,778 0,418 0,503 Ống nghiệm 1: Môi trường (MT7) Ống nghiệm 2,3,4,5,6: Dịch khuẩn pha loãng Bảng 6: Số liệu OD550nm Log(N/ml) Số khuẩn lạc Độ pha loãng -4 10 10-4 10-4 -5 10 10-5 10-6 OD 0,106 0,194 0,312 0,418 0,503 Đĩa 26 113 285 28 162 70 N/ml Đĩa 29 127 >300 32 176 67 log(N/ml) 2,8x10 1,2x107 6,45 7,08 2,9x10 7,46 1,7x108 6,9x108 8,23 8,84 Từ số liệu bảng 3.6, dùng chương trình vẽ đồ thị phần mềm Microsoft Excel, dựng đồ thị tương quan mật độ tế bào Log(N/ml) OD550nm y = 5.8136x + 5.8276 R2 = 0.984 8.5 Log(N/ml) Thử nghiệm khả lên men đường Mannitol Khả lên men chủng đánh giá dựa vào sinh acid Sinh acid (+) môi trường với chất thị phenol đỏ chuyển thành màu vàng, ngược lại mơi trường có màu đỏ sinh acid (-) 7.5 6.5 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD550nm Hình 7: Biểu đồ tương quan log (N/ml) OD550nm Phương trình đường thẳng: Y = 5,8136X + 5,8276 Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 217 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học Sau nuôi cấy lỏng chủng L1 hai môi trường MT5 MT7 sau 72 giờ, đo mật độ quang OD550nm thu kết bảng 3.7 Bảng 7: Kết đo OD550nm chủng L1 hai môi tường MT5 MT7 Môi trường MT5 MT7 OD550nm (Mơi trường) OD550nm (Dịch khuẩn pha lỗng) OD Số lần pha loãng 0,974 1,335 1,275 1,655 0,361 10 0,380 10 Dựa vào đồ thị đường tương quan log(N/ml) OD550nm phương trinh đường thẳng, chúng tơi tính mật độ tế bào chủng L1 hai môi trường MT5 MT7 Kết thu bảng 3.8 Bảng 8: Kết OD550nm Log(N/ml) chủng L1 hai môi trường MT5 MT7 Môi trường Giá trị OD Log(N/ml) N/ml MT5 MT7 0,361 0,380 7,93 8,04 0,85x109 1,1x109 Với kết này, mật độ tế bào lactobacilli môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) (1.1x109 N/ml) lớn môi trường Rogosa (MT5) (0,85x109 N/ml), nhiên không đáng kể Điều cho thấy thành phần dinh dưỡng hai môi trường Rogosa SL Lactobacilli MRS nhìn chung tương tự Về giá trị kinh tế, môi trường Rogosa SL thành phần tryptone có giá cao peptone Lactobacilli MRS Đối với chủng thuộc nhóm mutans streptococci Chủng S1 nuôi cấy trên hai môi trường MT1 MT2, sau 48 thu kết hình 3.8 bảng 3.9 Bảng Mật độ chủng S1 hai môi trường MT1 MT2 Môi trường MT1 MT2 Mật độ chủng S1 ++ ++++ MT1 Hình 8: Mật độ chủng S1 hai môi trường MT1 MT2 Mật độ khuẩn lạc môi môi trường MT2 nhiều mật độ khuẩn lạc môi trường MT1, điều cho thấy bổ sung 20% saccharose 0,2 Units/ml Bacitracin giúp cho chọn lọc mutans streptococci cao KẾT LUẬN Từ mẫu nước bọt phân lâp hai chủng L1 L2 thuộc lactobacilli hai chủng S1 S3 thuộc nhóm mutans streptococci Mật độ tế bào lactobacilli môi trường Lactobacilli MRS Broth (1.1x109 N/ml) môi trường Rogosa SL (8.5x108 N/ml) tương đương Môi trường Rogosa SL chọn lọc cho lactobacilli miệng mơi trường Lactobacilli MRS thành phần muối Rogosa SL vượt mức cho phép phân lập lactobacilli từ sữa Mật độ khuẩn lạc môi môi trường Mitis Salivarius Bacitracin Agar nhiều mật độ khuẩn lạc môi trường Mitis Salivarius Agar Khi bổ sung 20% saccharose khả phục hồi mutans streptococci tốt 0,2 Units/ml Bacitracin giúp cho mơi trường mang tính chọn lọc mutans streptococci TÀI LIỆU THAM KHẢO 218 MT2 Bộ môn vi sinh (2007) Thực tập vi sinh sở Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Bộ môn xét nghiệm (2002) Vi sinh y học Đại học Y Dược TP.HCM Burgess RC(1988), Dental Caries, Can Fam Physician Vol 34 10pp Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Caufield PW, Li Y, Dasanayake A and Saxena D (2007) Diversity of lactobacilli in the oral cavities of young women with dental caries Caries Res; 41 (1): 2-8 Doi:10.1159/000096099 Elen RP, Fillery ED, and Banting DW (1980) Comparison of Selective Broth and Plating Methods for Isolation of Streptococcus mutans from Root Surface Dental Plaques Journal of Clinical Microbiology, 5pp Nishikawara F, Nomura Y, Imai S, Senda A, Hanada N (2007) Evaluation of Cariogenic Bacteria, European Journal of Dentistry, 4pp 10 Nghiên cứu Y học Trần Linh Thước (2009) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm Nhà xuất giáo dục Trần Linh Thước, Lê Thị Thúy Ái, Nguyễn Mỹ Phi Long (2009) Thực tập vi sinh Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Van Houte J, Gibbons RJ, and Pulkkinen AJ (1972) Ecology of Human Oral Lactobacilli, American Society for Microbiology, 7pp Wade WG, Aldred MJ and Walker DM (1986) An improved medium for isolation of Streptococcus mutans, The Pathological Society of Great Britain and Ireland, 6pp Hội nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch 2012 219 ... cho lactobacilli chủng S1 đại diện cho mutans streptococci để thử nghiệm nuôi cấy môi trường Thử nghiệm nuôi cấy môi trường khác Đối với chủng thuộc lactobacilli Chúng nuôi cấy lỏng chủng L1 môi. .. tế bào môi trường Đối với lactobacilli Nuôi cấy lỏng lactobacilli hai môi trường MT5 MT7 Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc chủng lactobacilli cấy sang ống nghiệm có chứa khoảng 15ml môi trường. .. Broth (MT5) Môi trường tổng hợp Lactobacilli MRS Agar (MT6) Môi trường Lactobacilli MRS Broth (MT7) Môi trường Luria-Bertani (LB) (MT8) Môi trường Phenol Red Mannitol Broth (MT9) Môi trường Blood