Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 trên nuôi cấy tế bào vero ở quy mô phòng thí nghiệm

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm cung cấp các thông số về môi trường nuôi cấy virut, tinh sạch, bất hoạt virut sử dụng formaldehyde và tinh chế virut nhằm tìm ra quy trình sản xuất vắcxin EV71 có chất lượng, hiệu quả và mang tính thực tiễn.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮCXIN PHÕNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG EV71 TRÊN NI CẤY TẾ BÀO VERO Ở QUY MƠ PHÕNG THÍ NGHIỆM Vũ Hồng Nga*; Lương Thùy Dương*; Nguyễn Bích Thủy* Đỗ Tuấn Đạt*; Nguyễn Thu Vân* TĨM TẮT Từng cơng đoạn quy trình sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 nuôi cấy tế bào Vero tối ưu hóa nhằm tìm thơng số ổn định đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt Một số nghiên cứu quan trọng tiến hành để tìm quy trình sản xuất phù hợp nghiên cứu nuôi cấy virut; tinh sạch, cô đặc bất hoạt virut Siêu ly tâm gradient đường sucrose để thử phân đoạn có kháng nguyên tinh khiết Kết để xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất ổn định tối ưu Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số * Từ khóa: Vắcxin EV71; Quy trình cơng nghệ; Tế bào Vero ESTABLISHMENT OF PROCEDURE FOR VERO CELL ENTEROVIRUS 71 VACCINE PRODUCTION IN LABORATORY SCALE SUMMARY Each step of the procedure for Vero cell Enterovirus 71 vaccine production has been optimized in order to find consistent parameter for best quality products Several pivotal researches have been done for finding the most suitable production procedure such as a cell culture media was screened for virus propagation; research for finding of clarification, concentration and inactivation procedures, research for collecting purified virus by sucrose gradient ultracentrifugation The results will be basics for establishment of the most consistent and optimal vaccine production procedure at the Company for Vaccine and Biological production No * Key words: Technological process; EV71 vaccine; Vero cell ĐẶT VẤN ĐỀ Virut đường ruột týp 71 (EV71) nguyên gây dịch tay chân miệng nghiêm trọng trẻ em châu Á năm gần với bệnh cảnh thần kinh cấp tính bao gồm: liệt mềm giống bại liệt, viêm não, viêm màng não vô khuẩn, phù phổi Các bệnh EV71 gây thường để lại di chứng thần kinh nghiêm trọng có tỷ lệ tử vong cao EV71 lần phân lập California (Mỹ) vào năm 1969, thuộc chi * Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số 1, Hà Nội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Đồn Huy Hậu 50 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 virut đường ruột, họ Picornaviridea Genom EV71 ARN đơn dương gồm khoảng 7.500 nucleotit Protein cấu trúc bao gồm VP1, VP2, VP3 VP4; hạt virut gây nhiễm VP0 tách thành VP4 VP2 Trong nghiên cứu dịch tễ, phân tử hai protein cấu trúc VP1 VP4 dùng để xác định nhóm gen, EV71 chia thành nhóm gen (A, B C) phân chia nhỏ với 11 nhóm gen (A, B1-B5, C1-C5) Gần đây, chủng lưu hành Malaysia, Singapore, Đài Loan, Thái Lan Trung Quốc thuộc nhóm gen B5, C4 Việt Nam chủng EV71 thuộc nhóm gen C4 C5 Do đó, vắcxin EV71 hiệu phải tạo kháng thể trung hòa bảo vệ chéo nhóm gen khác Nghiên cứu phát triển vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 cách hiệu để phòng bệnh chủ động Vì vậy, loạt vắcxin phòng tay chân miệng EV71 nghiên cứu vắcxin hạt virut bất hoạt nhiệt formaldehyde; vắcxin tiểu thể dạng virut (virus-like particles-VLP), protein tái tổ hợp vùng VP1, vắcxin ADN vùng VP1, vắcxin peptide vùng tạo kháng thể trung hòa, vector vi khuẩn hay virut biểu VP1 vắcxin EV71 sống giảm độc lực thích ứng tế bào Vero Kết chung cho thấy: vắcxin bất hoạt toàn virut cho tính sinh miễn dịch cao so với vắcxin VP1 tái tổ hợp vắcxin ADN Công nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 nghiên cứu Công ty Vắcxin Sinh phẩm số 1, cơng nghệ sử dụng dòng tế bào thường trực Vero để nhân ni virut, từ tinh chế kháng nguyên đặc hiệu Nghiên cứu nhằm mục tiêu: Cung cấp thông số môi trường nuôi cấy virut, tinh sạch, bất hoạt virut sử dụng formaldehyde tinh chế virut nhằm tìm quy trình sản xuất vắcxin EV71 có chất lượng, hiệu mang tính thực tiễn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng virut Chủng virut đường ruột týp 71 0822 phân lập từ bệnh nhi mắc tay chân miệng Việt Nam, tách dòng cấy truyền chủng liên tiếp tế bào Vero Hiệu giá chủng 107 TCID 50/ml Tế bào Tế bào Vero (ATCC-CCL81) Trung tâm Lưu trữ Ngân hàng Tế bào gốc châu Âu cung cấp Kiểm tra chất lượng, an tồn dòng tế bào dòng tế bào thường trực Quy trình nuôi cấy chuẩn bị tế bào Vero Tế bào Vero đời 139 từ điều kiện bảo quản ngân hàng tế bào sản xuất cấy chuyển đến đời 142 môi trường MEM, bổ sung huyết động vật Xác định hình thái số lượng tế bào bề mặt chai nuôi cấy phương pháp quan sát kính hiển vi đảo pha đếm số lượng tế bào Quy trình gây nhiễm ni cấy virut Chủng EV71 sản xuất gây nhiễm vào chai tế bào Vero kín lớp Các điều kiện gây nhiễm khác bao gồm môi trường, nhiệt độ nuôi cấy virut liều virut gây nhiễm Quy trình tinh sạch, bất hoạt đặc virut Quy trình tinh đặc virut tìm hiểu hiệu thu hoạch virut sau ly tâm sử dụng loại màng lọc, màng cô đặc khác Đánh giá trình bất hoạt sau sử dụng loại hóa chất điều kiện bất hoạt khác Đánh giá hiệu bất hoạt tế bào Vero Quy trình tinh chế virut 53 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Quy trình pha bán thành phẩm cuối Công thức pha bán thành phẩm cuối chất lượng vắcxin đánh giá qua kết kiểm tra chất lượng tính sinh miễn dịch vắcxin thành phẩm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Quy trình ni cấy chuẩn bị tế bào Vero Q trình ni cấy phải tn thủ theo hướng dẫn nuôi cấy tế bào cho sản xuất vắcxin Tế bào Vero cấy chuyển từ đời bảo quản ngân hàng tế bào sản xuất - đời 139 đến đời 142, đời cấy chuyển cuối trước gây nhiễm virut Đếm số lượng tế bào chai nuôi cấy quan sát tế bào kín lớp kính hiển vi đảo pha Đây cách thức để đánh giá chất lượng tế bào sau nuôi cấy (dữ liệu không công bố) Xác định tỷ lệ tách tế bào qua lần cấy chuyển, số ngày nuôi cấy cần thiết để đạt số lượng tế bào Quy trình ni cấy virut Điều kiện nuôi cấy virut tối ưu yếu tố định đến hiệu giá thu hoạch virut sau gây nhiễm Các tham số điều kiện nuôi cấy virut bao gồm: môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, liều virut gây nhiễm * Môi trường nhiệt độ nuôi cấy virut: Môi trường nuôi cấy giai đoạn nuôi cấy virut tế bào mơi trường khơng có huyết động vật nhằm đảm bảo sản phẩm cuối không chứa protein huyết động vật theo yêu cầu Tổ chức Y tế Thế giới Khảo sát tìm mơi trường ni cấy virut khơng chứa huyết động vật, đảm bảo virut hiệu giá virut cao Hiệu giá kháng nguyên virút EU Tinh chế virut EV71 phương pháp siêu ly tâm gradient đường sucrose Phương pháp định lượng kháng nguyên EV71 thử nghiệm ELISA, định lượng protein đo mật độ quang bước sóng 280 nm, điện di gel SDS-PAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử dùng để đánh giá hiệu quy trình tinh chế Nhiệt độ nuôi cấy 35°C 90 80 Nhiệt độ nuôi cấy 37°C 70 60 50 40 30 20 10 DMEM MEM LH3E Mơi trường ni cấy virút M199 Hình 1: Hiệu giá kháng nguyên virut thu sau gây nhiễm môi trường nuôi cấy DMEM, MEM, LH3E, M199 nhiệt độ nuôi cấy 35C 37C Môi trường nuôi cấy MEM cho hiệu giá virut cao điều kiện nuôi cấy 35C 37C Nuôi cấy virut 37C cho hiệu giá kháng nguyên virut cao nhiệt độ nuôi cấy 35C hầu hết môi trường nuôi cấy Lựa chọn môi trường MEM môi trường nuôi cấy virut nhiệt độ nuôi cấy virut 37C điều kiện giúp đạt hiệu giá virut cao * Liều virut gây nhiễm thời gian ni cấy: Mỗi loại tế bào có độ nhạy cảm với virut khác Nghiên cứu liều gây nhiễm khác EV71 tế bào vero cần thiết nhằm mục đích tìm liều gây nhiễm thích hợp cho hiệu giá tối đa sản xuất vắcxin Khảo sát liều virut gây nhiễm nhằm tìm liều gây nhiễm tối ưu cho hiệu giá virut cao Trong nghiên cứu này, liều gây nhiễm khác khảo sát 1; 54 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 0,1; 0,01 0,001 TCID50/tế bào Liều gây nhiễm tính theo đơn vị hiệu giá TCID50 EV71 Bảng 1: Kết gây nhiễm EV71 nồng độ virut 1; 0,1; 0,01; 0,001 MOI thời điểm gặt 24; 36; 48; 60 hoạt hoàn toàn sử dụng formaldehyde với nồng độ 1/2000 37oC sau ngày Quy trình tinh chế virut 400 1.8 350 1.6 300 1.4 OD (TCID50/tế bào) 24 36 48 60 10 6,25 105,75 - - 5,75 - - 6,5 250 1.2 (TCID50/ml) 0.1 10 10 0.01 105,75 106,25 106,75 - 0.001 104.75 105,75 106,5 106 200 0.8 150 0.6 100 0.4 50 0.2 Liều gây nhiễm 0,1: lượng virut gây nhiễm cao gây tượng tế bào bị hủy hoại nhanh nên virut đạt hiệu giá cao sau 24 gây nhiễm, đến thời điểm 36 sau gây nhiễm, hiệu giá virut giảm tế bào bị hủy hoại hồn tồn, khơng chất cho virut nhân lên Liều gây nhiễm 0,01 0,001: lượng virut gây nhiễm thấp nên hiệu giá virut thu sau 24 gây nhiễm không cao, nhiên, hiệu giá virut tăng dần theo thời gian sau gây nhiễm đạt đỉnh vào thời điểm 48 sau gây nhiễm Kết cho thấy: liều gây nhiễm 0,01 sau 48 cho kết khả quan Vậy quy trình gây nhiễm EV71 vào tế bào Vero sử dụng liều gây nhiễm 0,01 TCID50/tế bào thích hợp nhất, hiệu giá virut đạt cao khơng lãng phí chủng Phân đoạn 10 can ELISA OD280 Hình 2: Kết siêu ly tâm tinh chế virut Ở phân đoạn 1, 2, 4, xác định hiệu giá kháng nguyên phương pháp ELISA có giá trị cao nhất, đồng thời lẫn protein tạp khác (giá trị OD280 thấp) Quy trình tinh sạch, bất hoạt cô đặc virut Hỗn dịch virut sau thu hoạch ly tâm để loại xác tế bào lọc để loại bỏ tạp chất Sau trình tinh sạch, cô đặc bất hoạt hỗn dịch virut (dữ liệu không công bố) Kết cho thấy: màng lọc 0,8 µm màng siêu lọc 50K phù hợp để tinh cô đặc EV71 Virut bất Hình 3: Hình ảnh điện di gel SDS-PAGE 1- Chuẩn trọng lượng phân tử; 2- Mẫu trước siêu ly tâm; 3,4- Mẫu sau siêu ly tâm Kết chạy điện di SDS-PAGE khẳng định, sản phẩm sau trình siêu ly tâm có độ tinh khiết cao, chứa protein tạp 55 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Khảo sát cơng đoạn quy trình sản xuất vắcxin EV71 ni cấy tế bào Vero để tìm thông số tối ưu ổn định, đảm bảo chất lượng sản phẩm Đây sở để xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 4: Hình ảnh virut đường ruột týp 71 sau tinh chế Cùng với kết xác định hàm lượng ADN tế bào tồn dư hình ảnh virút sau tinh chế kính hiển vi điện tử cho thấy: siêu ly tâm gradient đường sucrose cho kháng nguyên virut có độ tinh khiết cao, thích hợp để pha chế vắcxin Quy trình pha bán thành phẩm cuối Sau tinh chế, pha kháng nguyên virut với công thức khác Kết kiểm tra chất lượng tính sinh miễn dịch vắcxin thành phẩm định công thức pha bán thành phẩm cuối tối ưu (dữ liệu không công bố) Công thức pha bán thành phẩm cuối lựa chọn tiếp tục áp dụng quy trình sản xuất vắcxin EV71 nuôi cấy tế bào Vero Chang JY, Chang CP, Tsai HHP, Lee CD, Lian WC, et al Selection and characterization of vaccine strain for Enterovirus 71 vaccine development Vaccine 2012, 30, pp.703-711 Lee MS, Chang LY Development of enterovirus 71 vaccines Expert Rev Vaccines 2010, 9, pp.149-156 Liu CC, Guo MS, Lin FHY, Hsiao KN, Chang KHW, et al Purification and characterization of EV71 viral particles produced from Vero cell grown in a serum-free microcarrier bioreactor system PLoS ONEdoi 2011, 10.1371/Journalpone.0020005 Huang ML, Ho MS, Lee MS Enterovirus 71 vaccine: when will it be available? J Formos Med Assoc 2011, 110, pp.425-427 Solomon T, Lewthwarte P, Perera D, Cordosa MJ, McMinn P, et al Virology, epidemiology, pathogenesis and control of enterovirus 71 Lancet Infect Dis 2010, 10, pp.778-790 KẾT LUẬN Ngµy nhËn bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 15/11/2012 Ngày giao th¶o in: 6/12/2012 56 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 57 ... ni cấy tế bào Vero để tìm thông số tối ưu ổn định, đảm bảo chất lượng sản phẩm Đây sở để xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin phòng bệnh tay chân miệng EV71 Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh... lượng, an tồn dòng tế bào dòng tế bào thường trực Quy trình ni cấy chuẩn bị tế bào Vero Tế bào Vero đời 139 từ điều kiện bảo quản ngân hàng tế bào sản xuất cấy chuyển đến đời 142 môi trường MEM,... bị tế bào Vero Q trình ni cấy phải tn thủ theo hướng dẫn nuôi cấy tế bào cho sản xuất vắcxin Tế bào Vero cấy chuyển từ đời bảo quản ngân hàng tế bào sản xuất - đời 139 đến đời 142, đời cấy chuyển