Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC THỨ PHÁT T790M TRÊN GEN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ KHÁNG VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Trần Quốc Đạt Trường Đại học Y Hà Nội Khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có xuất đột biến kháng thuốc thứ phát T790M sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị với thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase (TKI, tyrosine kinase inhibitor) EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) Các bệnh nhân xác định trước có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 L858R) gen EGFR Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 gen EGFR 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ xác định có dấu hiệu đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI DNA tách chiết từ mẫu mô sinh thiết lại để xác định đột biến T790M exon 20 gen EGFR, kỹ thuật giải trình tự gen truyền thống kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Mutation System) với độ nhạy cao khoảng 0,01% áp dụng để xác định đột biến.Kết cho thấy phát 5/11 (45%) bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M exon 20 gen EGFR, trường hợp xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS trường hợp phát kỹ thuật Scorpions ARMS Đây nghiên cứu bước đầu, cần có nghiên cứu với cỡ mẫu nghiên cứu lớn để đưa kết toàn diện Từ khóa: Ung thư phổi khơng tế bào nhỏ, Kháng TKI, Đột biến T790M I ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, toàn giới Việt biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với Nam, ung thư phổi loại ung thư phổ biến EGFR TKI có tỷ lệ đáp ứng với thuốc EGFR TKI cao, 60%, kéo dài thời có tỷ lệ tử vong cao [1], với 80 90% thể khơng tế bào nhỏ, lại thể tế gian sống bệnh khơng tiến triển (PFS) trung bình tháng [4] Tuy nhiên, áp lực bào nhỏ.Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR (epidermal growth factor receptor) chọn lọc tế bào khối u với thuốc, sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào trở lại hầu hết bệnh nhân có đáp ứng tốt nhỏ [2] Ung thư phổi khơng tế bào nhỏ có đột ban đầu, thể tình trạng “trơ” tế bào khối u với thuốc [5] Y học ghi nhận số biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc ức chế tyrosine kinase EGFR (EGFR TKI), cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc EGFR TKI; có xuất số đột biến sở cho liệu pháp điều trị trúng đích [3] Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân ung thư phổi phân tử EGFR (đột biến T790M exon 20, đột biến L747S D761Y không tế bào nhỏ giai đoạn muộn mang đột exon 19, đột biến T854A exon 21…), Địa liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: huytihinhda@yahoo.com Ngày nhận: 10/10/2015 Ngày chấp thuận: 26/02/2016 40 khuếch đại gen cMET (gen mã hóa thụ yếu tố phát triển tế bào gan), chuyển dạng biểu mô - trung mô chuyển từ dạng không tế bào nhỏ sang dạng tế bào nhỏ Đột biến thứ phát T790M exon 20 gen EGFR TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 đánh 50% trường hợp [6; 7] Chẩn đốn phân tử thơng qua tái sinh thiết khối u để xác định giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo tiêu chuẩn Jackman cộng [9] chế kháng thuốc từ lựa chọn hướng điều trị cho bệnh nhân đóng vai trò quan Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội trọng Có nhiều kỹ thuật phát đột biến kháng thuốc T790M exon 20 gen EGFR độ nhạy kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tế bào ung thư mẫu mô Hai kỹ thuật sử dụng phổ biến giải trình tự gen Scorpion ARMS Kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành cạnh tranh không phát đột biến gen mẫu mơ có tế bào đột biến Kỹ thuật Scorpions ARMS có độ nhạy cao phát đột biến gen EGFR alen đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ, giá thành cao [8] Đề tài thực với mục tiêu: Xác định đột biến T790M gen EGFR bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Mẫu mô sinh thiết lại khối tế bào 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ thu thập Bệnh viện K Trung ương, Bệnh viện Hữu Nghị Bệnh viện Bạch Mai Các bệnh nhân chẩn đốn xác định ung thư phổi biểu mơ tuyến giai đoạn từ IIIB IV dựa vào đặc điểm lâm sàng kết mô bệnh học Bệnh nhân xét nghiệm gen EGFR mẫu mô sinh thiết lần trước điều trị đích xác định có đột biến đáp ứng với với thuốc ức chế EGFRTKI (6 bệnh nhân có đột biến đoạn điển hình LREA exon 19 bệnh nhân có đột biến L858R exon 21), ngồi không phát thêm đột biến khác gen EGFR Bệnh nhân sử dụng thuốc ức chế EGFRTKI, theo dõi đáp ứng thuốc TCNCYH 99 (1) - 2016 Phương pháp - Kỹ thuật tách chiết DNA: mẫu mơ lựa chọn xác vùng tế bào ung thư Parafin loại bỏ xylen DNA tách chiết theo qui trình phenol/chloroform (protein phân huỷ Proteinase K với nồng độ mg/mL) Nồng độ độ tinh DNA xác định máy Nano Drop, mẫu DNA đạt giá trị OD 280/ OD260 ≥ 1,8 sử dụng để phân tích - Kỹ thuật giải trình tự gen: sau khuyếch đại exon 19, exon 21 gen EGFR kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR tinh từ gel agarose, sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) sau đưa vào giải trình tự phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự Genebank gen EGFR - Kỹ thuật Scorpions ARMS: kết hợp kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) công nghệ Scorpions phản ứng real - time PCR để phát đột biến gen EGFR đột biến kháng thuốc T790M exon 21 Quy trình kỹ thuật theo Kit hãng QIAGEN [10] Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu Y học Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ biến kháng thuốc T790M exon 20, Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen Scorpion ARMS để phát đột biến gen EGFR trường hợp xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự gen Scorpions ARMS cho đối tượng nghiên cứu Kết cho thấy phát 5/11 (45%) bệnh nhân có đột trường hợp phát đột biến kỹ thuật Scorpions ARMS (bảng 1) Bảng Kết phát đột biến gen EGFR trước sau điều trị EGFR TKI Đột biến gen sau điều trị EGFR TKI Chẩn đoán Đột biến gen trước điều lâm sàng trị EGFR TKI Giải trình tự gen Scorpions ARMS K phổi LREA LREA LREA, T790M K phổi LREA LREA LREA K phế quản L858R L858R L858R K phổi LREA LREA LREA, T790M K phổi L858R L858R, T790M L858R, T790M K phế quản LREA LREA LREA K phế quản L858R L858R L858R, T790M K phổi L858R L858R L858R K phổi LREA LREA, T790M LREA, T790M 10 K phế quản LREA LREA LREA 11 K phổi L858R L858R L858R MS Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, phân tích mẫu DNA kỹ thuật giải trình tự gen Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến L858R exon 21, khơng có đột biến gen EGFR khác, chứng tỏ thời điểm này, bệnh nhân có đột biến L858Rexon 21 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI Tại thời điểm bệnh tiến triển, phân tích mẫu DNA kỹ thuật giải trình tự gen Scorpion ARMS, đột biến L858R exon 21 phát trước điều trị, xuất thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ thời điểm này, bệnh nhân xuất thêm đột biến thứ phát T790M gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 1) 42 TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết giải trình tự gen Kết Scorpion ARMS Hình Kết xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân MS5 trước điều trị (A) sau điều trị (B) Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, phân tích mẫu DNA kỹ thuật giải trình tự gen Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn LREA exon 19, khơng có đột biến gen EGFR khác, chứng tỏ thời điểm này, bệnh nhân có đột biến LREA exon 19 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI Tại thời điểm bệnh tiến triển, phân tích mẫu DNA kỹ thuật giải trình tự gen thấy có tín hiệu nghi ngờ đột biến T790M exon 20 Khi kiểm tra lại kỹ thuật Scorpion ARMS, đột biến LREA exon 19 phát trước điều trị, xuất thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ thời điểm này, bệnh nhân xuất thêm đột biến thứ phát T790M exon 20 gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 2) TCNCYH 99 (1) - 2016 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết giải trình tự gen Kết Scorpion ARMS Hình Kết xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân MS9 trước điều trị (A) sau điều trị (B) IV BÀN LUẬN Cơ chế kháng thuốc điều trị đích tốt với thuốc điều trị đích [10; 11] Sự biến đổi bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ cấu trúc vùng giữ chức tyrosine chứng minh xuất đột biến điểm T790M exon 20 gen EGFR Phát kinase (exon 18 21) protein EGFR gây cơng bố hai nhóm nghiên cứu độc lập Kobayashi Pao năm 2005 sau gắn ATP Do đó, phân tử thuốc EGFR TKI tiến hành phân tích bệnh nhân mang đột biến LREA, L858R xuất tính kháng sau khoảng thời gian ban đầu đáp ứng 44 giảm lực protein EGFR với ATP khe cạnh tranh với ATP EGFR trở nên nhạy cảm với thuốc [12] Theo thời gian tiếp xúc liên tục với thuốc điều trị đích EGFR TKI, gen EGFR tế bào ung thư TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC xuất đột biến đột biến điểm thư phổi không tế bào nhỏ sau sử dụng T790M exon 20, biến đổi cấu trúc protein EGFR vị trí đột biến T790M khơng tạo thuốc ức chế TKI EGFR đánh giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo phong tỏa vị trí khơng gian thuốc TKI mà làm hồi sinh lực EGFR với tiêu chuẩn Jackman cộng [9] Nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật giải trình ATP, đối kháng lại chế ức chế kinase theo kiểu cạnh tranh ATP TKI [13] Theo đó, tự gen Scorpion ARMS (kỹ thuật có độ nhạy cao 0,01%) tỷ lệ phát đột TKI ức chế thuận nghịch erlotinib biến T790M thấp so với số nghiên gefitinib có hiệu giới hạn với thể đột biến T790M, TKI khơng cứu trước cỡ mẫu hạn chế [10; 17] Đặc biệt, có bệnh nhân khơng phát thuận nghịch afatinib vượt qua tượng nhờ hình thành nối cộng đột biến kháng thuốc T790M exon 20 (hoặc có tín hiệu nghi ngờ) kỹ thuật giải hóa trị với vùng gắn ATP, giúp kéo dài hiệu ức chế hoạt tính tyrosine kinase [14] trình tự gen mà phát kỹ thuật Scorpion ARMS, điều lý giải Thử nghiệm in vitro cho thấy nồng độ Gefitinib lượng tế bào ung thư phổi mang đột biến Erlotinib tối thiểu để ức chế protein EGFR - T790M cao gấp 300 lần nồng độ để T790M exon 20 thu thập từ mẫu mô nghiên cứu hạn chế Chúng cần có cần thiết để ức chế protein EGFR-LREA, L858R [15; 16] Hệ dòng tế bào ung nghiên cứu với cỡ mẫu lớn để đưa kết nghiên cứu toàn diện thư phổi mang đột biến T790M exon 20 (dòng H1975) có khả chịu Gefitinib, Erlotinib tốt V KẾT LUẬN nhiều so với dòng mang đột biến LREA Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen (dòng H3255) L858R (dòng HCC827) Hiện có chế nhà khoa học đề Scorpions ARMS phát 5/11 xuất nhằm giải thích mối liên quan đột biến T790M tính kháng tế bào ung thư phổi: i) Ở mức độ cấu trúc, thay đổi Threonin thành Methionin gây biến đổi vị trí tương tác vùng kinase, ức chế hồn tồn bám Erlotinib Gefitinib ii) Ở góc độ tương tác phân tử sinh học, đột biến T790M khôi phục lại lực vùng kinase với ATP giảm lực với Erlotinib (45%) bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 gen EGFR Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh viện K Trung ương, Bệnh viện Hữu Nghị Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai giúp đỡ trình thực nghiên cứu Đề tài thực với Gefitinib [10, 13] Tiến hành phân tích số lượng lớn bệnh nhân ung thư phổi không tế hỗ trợ kinh phí đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu biến đổi gen tế bào nhỏ, nhà khoa học phát thấy đột bào ung thư phổi lơ-xê-mi kinh dòng hạt kháng thuốc điều trị đích” thuộc chương trình biến T790M chiếm 50% trường hợp kháng thuốc sau điều trị Gefitinib Erlotinib, KC.04.16/11-15 dạng đột biến lại chiếm 5% [10, 17] Trong nghiên cứu này, đột biến T790M TÀI LIỆU THAM KHẢO phát 5/11 (45%) bệnh nhân ung Jemal A, Bray F, Ward E et al (2011) TCNCYH 99 (1) - 2016 45 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Global cancer statistics CA Cancer J Clin, 61 10 Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T (2), 69 - 90 Chu Hồng Thắng, Lê Trần Ngoan, Lê (2005) EGFR mutation and resistance of non small-cell lung cancer to gefitinib N Engl J Hoài Chương, Vũ Thị Nguyệt Ánh (2013) Tình hình tử vong ung thư Hà Nội Med, 352, 786 – 792 Thái Ngun, 2005 - 2008 Tạp chí Thơng Tin Y Dược, 4, 50 - 54 Pao W, Miller VA (2005) Epidermal growth factor receptor mutations, smallmolecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions J Clin Oncol, 23(11), 2556 - 2568 Ohashi K., Maruvka Y., Michor F and Pao W (2013) Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor– Resistant Disease J Clin Oncol, 31, - 12 Nurwidya F., Takahashi F., Murakami A., et al (2014).Acquired resistance of nonsmall cell lung cancer to epidermal growth 11 Pao W., Millere VA., Politi KA Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain PLoS Med, 2, 73 12 Dienstmann R., Martinez P., Felip E (2011) Personalizing therapy with targeted agents in non-small cell lung cancer Oncotarget, 2(3), 165 - 177 13 Yun C.H., Mengwasser K.E., Toms A.V et al (2008) The T790Mmutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasingthe affinity for ATP Proceedings of the National Academy of Sciences of the factor receptor tyrosine kinase inhibitors United States of America, 105(6), 2070–2075 Respiratory Investigation, 52(2), 81 - 91 14 Li D., Ambrogio L., Shimamura T., (2008) BIBW2992, anirreversible EGFR/ HER2 inhibitor highly effective in preclinical Engelman J.A., Zejnullahu K., Mitsudomi T et al (2007) MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling Science, 316, 1039 1043 Sequist L.V., Waltman B.A., DiasSantagata D et al (2011) Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors Sci Transl Med, 375, 26 Pao W and Ladanyi M (2007) Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Testing in Lung Cancer: Searching for the Ideal Method.Clin Cancer Res,13, 4954 - 4955 Jackman D., Pao W., Riely G.J (2010) Clinical definition of acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine lung cancer models Oncogene, 27(34), 4702 4711 15 Kosaka T, Yatabe Y, Endoh H (2006) Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutation inpatients with non-small cell lung cancer and acquired resistance to gefitinib Clin Cancer Res, 12, 5764 – 5769 16 Avizienyte E, Ward RA, Garner AP (2008) Comparison of the EGFR resistance mutation profiles generated by EGFR targeted tyrosine kinase inhibitors and the impact of drug combinations Biochem J, 415,197 - 206 kinase inhibitors in non-small-cell lung cancer 17 Oxnard GR, Miller VA, Robson ME (2012) Screening for germline EGFR T790M mutations through lung cancer genotyping J J Clin Oncol, 28(2), 357 - 360 Thorac Oncol, l7, 1049 - 1052 46 TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary IDENTIFICATION OF A SECONDARY EGFR T790M MUTATION BY REBIOPSY OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS WITH ACQUIRED RESISTANCE TO TYROSINE KINASE INHIBITOR Approximately 50% of non-small cell lung cancer patients with epidermal growth factor receptor (EGFR) - mutations (deletion in exon 19 or L858R) who develop acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) reportedly carry a secondary EGFR T790M mutation This phenomenon prevails after 10 - 20 months of treatment in most of patients This study investigated 11 EGFR-mutant patients who had undergone rebiopsy after TKI failure DNA was extracted from tumor tissues and examined for the presence of T790M, using a standard sequencing based method followed by Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Mutation System) method with an analytical sensitivity of approximately 0.01% Analysis of 11 patients detected mutants (45%), including mutants can detect by both sequencing and Scorpions ARMS method and mutants only can detect by Scorpions ARMS method due to limited cancer tissues after rebiopsy We need to study more with larger number of patients to confirm this result Keywords: Non-small cell lung cancer, TKI acquired resistance, Secondary T790M mutation TCNCYH 99 (1) - 2016 47 ... biến gen EGFR trước sau điều trị EGFR TKI Đột biến gen sau điều trị EGFR TKI Chẩn đoán Đột biến gen trước điều lâm sàng trị EGFR TKI Giải trình tự gen Scorpions ARMS K phổi LREA LREA LREA, T790M. .. kháng thuốc T790M exon 20 gen EGFR độ nhạy kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tế bào ung thư mẫu mô Hai kỹ thuật sử dụng phổ biến giải trình tự gen Scorpion ARMS Kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành... LREA LREA LREA, T790M K phổi L858R L858R, T790M L858R, T790M K phế quản LREA LREA LREA K phế quản L858R L858R L858R, T790M K phổi L858R L858R L858R K phổi LREA LREA, T790M LREA, T790M 10 K phế