Phân tích thành phần các saponin chính trong sâm việt nam nuôi cấy mô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đề tài nghiên cứu tiến hành phân tích thành phần các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC SAPONIN CHÍNH TRONG SÂM VIỆT NAM NUÔI CẤY MÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Hải Anh*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức* TĨM TẮT Mục tiêu: Phân tích thành phần saponin Sâm Việt Nam ni cấy mô phương pháp Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp: Sử dụng phương pháp HPLC với cột Supelcosil RP-18 hỗn hợp acetonitril – nước làm pha động, phân tách định lượng saponin có mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, so sánh với Sâm Việt Nam tự nhiên Kết quả: Qua phân tích, mẫu Sâm Việt Nam ni cấy mơ có chứa saponin thành phần saponin tương tự Sâm Việt Nam tự nhiên với hàm lượng thấp Kết luận: Mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô khảo sát chứa saponin chủ yếu có Sâm Việt Nam, có triển vọng nghiên cứu hồn chỉnh để cung cấp nguồn sâm bổ sung Từ khóa: Sâm Việt Nam, Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, saponin, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT HPLC ANALYSIS OF MAJOR SAPONINS IN BIO-CULTURED VIETNAMESE GINSENG Hoang Hai Anh, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 579 - 584 Objectives: to separate and quantitatively determine major saponins in bio-cultured products of Panax vietnamensis by HPLC Methods: A reverse phase HPLC method using a Supelcosil RP-18 column and acetonitril–water mixture as mobile phase was used to separate and quantitatively determine major saponins in cultured Vietnamese Ginseng in comparison with the natural one Results: The major saponins in Panax vietnamensis are also present in bio-cultured products, but in lower contents Conclusion: The bio-cultured Vietnamese Ginseng contains most of the major saponins found in the natural one It should therefore be a potential source of Vietnamese Ginseng in future Keywords: Panax vietnamensis, bio-cultured Vietnamese Ginseng, saponin, HPLC dược liệu độc đáo, quý giá ĐẶT VẤN ĐỀ nước ta với nhiều đặc tính dược lý tác động Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et trị liệu so sánh với sâm Triều Tiên(3,4) Grushv - Araliaceae) phát vào năm Những năm gần nguồn Sâm Việt Nam 1973 nghiên cứu cách sâu rộng tự nhiên bị khai thác trái phép, nuôi trồng nhiều phương diện thực vật học, trồng trọt, chưa phát triển, khiến Sâm Việt Nam đối hóa thực vật dược lý học từ năm 1977 Các mặt với nguy cạn kiệt Việc phát triển nghiên cứu cho thấy Sâm Việt Nam *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: GS TS Nguyễn Minh Đức Chuyên Đề Dược Khoa ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vn.vnn 579 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học phương pháp nuôi cấy Sâm Việt Nam công nghệ sinh học đóng góp nguồn Sâm Việt Nam cho trồng trọt sử dụng làm thuốc Tuy nhiên, chất lượng sâm ni cấy mơ dấu hỏi Mục tiêu đề tài áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(1,2) để phân tích thành phần saponin có Sâm Việt Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam thiên nhiên NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Mẫu Bộ phận dùng Sâm Việt Rễ củ Nam (SVN) Sâm Việt Căn hành: 60% Nam nuôi Tiền con: 20% cấy mô Plbs : 20% (SVN NCM) Độ ẩm Nguồn cung cấp 6,56% Sở Y tế Kontum 10,88% Công ty TNHH Quốc tế Hoàng Gia (*) (*): 30/70/9, đường D2, phường 25, quận Bình Thạnh, Tp HCM Phương pháp nghiên cứu Hóa chất dụng cụ máy móc Chất chuẩn: saponin chuẩn, gồm: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Khoa Dược cung cấp, có độ tinh khiết > 97% 580 Resin pha đảo Diaion HP-20 (styren divinyl copolymer resin) Mitsubishi Chemicals Co (Nhật Bản) Máy HPLC LC-10 AD – Shimadzu, Nhật Bản, cột Supelcosil RP-C18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm), kèm theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm), detector photodiode array (SPD-M10A VP – Shimadzu, Nhật Bản) đặt bước sóng 203 nm detector RI, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Định tính sơ sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử: hòa tan chất chuẩn cắn saponin vào methanol Điều kiện sắc ký Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck) Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65: 35:10, lớp dưới) Thuốc thử màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy 105oC đến màu Xây dựng đường chuẩn từ saponin chuẩn Xây dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan nồng độ chất chuẩn với diện tích đỉnh cách bơm vào máy HPLC lượng ước phân dung dịch chuẩn với nồng độ thích hợp [saponin (mg/ml)]: G-Rb1 (1,85), G-Rg1 (1,65), G-Rd (1,0), G-Re (0,7), N-R1 (1,5), M-R2 (3,1) Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Quy trình phân tích HPLC Mẫu dược liệu - Sấy nhiệt độ 60 ± 5oC 2-3 - Nghiền thành bột mịn (cân xác khoảng g) - Chiết MeOH - Chiết Soxhlet Kiểm tra SKLM (đảm bảo chiết hết saponin) Dịch MeOH - Lọc cô chân không đến cắn (toC ≤ 50oC) - Cân cắn thu được, cho lượng thích hợp vào cột diaion HP-20 (2,5 x 30 cm) - Chiết xuất nước, MeOH, CHCl3 MeOH H2O Dịch H2O (hợp chất đường) Dịch MeOH (hợp chất saponin) CHCL3 Dịch CHCL3 (hợp chất béo) Cô chân không (toC ≤ 50oC) Cắn saponin - Cân xác mg cắn - Hòa tan ml MeOH - Lọc qua lọc 0,45 μm - Bơm vào máy HPLC (20 μl) Sắc ký đồ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết phân tích SKLM Phân tích sơ SKLM cho thấy, sắc đồ SKLM SVN NCM xuất vết tương tự SVN, vết saponin tương ứng với vết saponin chuẩn Chuyên Đề Dược Khoa 581 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng Kết SKLM so sánh SVN SVN NCM Rf SVN NCM SVN G-Rb1 0,22 x x G-Re 0,30 x x N-R1 0,32 x x G-Rd 0,35 x x G-Rg1 0,44 x x M-R2 4,48 x x x: có xuất vết Nhận xét: Trên sắc đồ SKLM, SVN NCM cho vết tương ứng với saponin chủ yếu có SVN gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 M-R2 Hình Sắc đồ SKLM SVN SVN NCM SVN: Sâm Việt Nam; SVN NCM: Sâm Việt Nam Kết xây dựng đường chuẩn 582 Hình Đường chuẩn G-Rb1 Hình Đường chuẩn G-Rg1 Hình Đường chuẩn G-Rd Hình Đường chuẩn G-Re Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Hình Đường chuẩn N-R1 Nghiên cứu Y học Hình Đường chuẩn M-R2 (phút) theo thứ tự 30,1 33,1 Cũng điều kiện thời gian lưu tương đối N-R1 22,1 Kết phân tích HPLC Kết định tính Hệ dung môi 1: CH3CN-H2O (30: 70) Trong điều kiện HPLC mơ tả, tách saponin G-Rb1 G-Rd với thời gian lưu tương đối (phút) theo thứ tự 20,1 48,2 Tuy nhiên, hai đỉnh G-Rg1 G-Re trùng nhau, gần với đỉnh N-R1 Hệ dung môi 2: CH3CN-H2O (20: 80) Hệ dung môi 3: CH3CN-H2O (24: 76) Phát MR2: Pha động: acetonitril – nước (24:76) Detector: Refractive Index (nhiệt độ: 30oC, độ nhạy: 9, P: 133) Với điều kiện trên, MR2 tách khỏi G-Rg1 G-Re với thời gian lưu tương đối (phút) 15,1 Với hệ dung mơi này, tách GRg1 khỏi G-Re với thời gian lưu tương đối Kết định lượng Bảng Kết định lượng saponin SVN SVN NCM Mẫu SVN SVN NCM GRb1 2,51 x GRg1 2,57 0,013 Hàm lượng saponin (%) GRd GRe NR1 1,22 0,16 0,53 x 0,15 0,015 MR2 5,97 0,12 Tổng cộng 12,96 0,30 x: hàm lượng ít, trị số đáp ứng đỉnh nhỏ Kết định lượng cho thấy, mẫu SVN NCM có chứa saponin tương tự SVN hàm lượng saponin chưa cao, ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy thời gian nuôi cấy KẾT LUẬN Bằng phương pháp SKLM HPLC pha đảo, chúng tơi phân tích thành phần saponin mẫu ngun liệu Sâm Việt Nam ni cấy mô Kết cho thấy, Sâm Việt Nam nuôi cấy mơ có saponin tương tự Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm GRb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 M-R2 Tuy hàm lượng tổng cộng saponin Sâm Việt Nam ni cấy mơ chưa cao (0,3% so với Chuyên Đề Dược Khoa 12,96% Sâm Việt Nam thiên nhiên), kết ban đầu khích lệ sản phẩm ni cấy mơ khơng dừng dạng sinh khối (callus) mà phát triển thành hành tiền Việc nghiên cứu hoàn chỉnh Sâm Việt Nam ni cấy mơ đưa đến việc cung cấp nguồn sâm cho trồng trọt sử dụng nguyên liệu để thay sâm thiên nhiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Chi nhánh Tp HCM, tr.49-126, tr.218-232 Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu Trang (2001), “Quantitative determination of major saponin contents of cultivated vietnamese ginseng – Panax vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC”, Proceedings 583 Nghiên cứu Y học 584 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 of Pharma indochina II, 20-23 Nov 2001, Hanoi, Vietnam, 247251 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân Sâm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.15-22, tr.41, tr.99-105, tr.110-119, tr.126-130 Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.446-455, tr.704-710, tr.775-779 Chuyên Đề Dược Khoa ... pháp sắc ký lỏng hiệu cao( 1,2) để phân tích thành phần saponin có Sâm Việt Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam thiên nhiên NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Mẫu Bộ phận dùng Sâm Việt. .. liệu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô Kết cho thấy, Sâm Việt Nam ni cấy mơ có saponin tương tự Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm GRb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 M-R2 Tuy hàm lượng tổng cộng saponin Sâm Việt Nam. .. NCM có chứa saponin tương tự SVN hàm lượng saponin chưa cao, ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy thời gian nuôi cấy KẾT LUẬN Bằng phương pháp SKLM HPLC pha đảo, chúng tơi phân tích thành phần saponin mẫu