Rutin là một flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa... Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn bị giới hạn nhiều, do độ tan và độ ổn định kém trong cả pha dầu và pha nước. Do đó, việc acyl hóa rutin sẽ cải thiện tính tan của nó trong pha dầu. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tối ưu hóa điều kiện của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác enzym lipase từ candida.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE Vũ Thanh Thảo*, Huyền Tôn Nữ Quỳnh Hương*, Trần Thị Yến Chi*, Nguyễn Thị Kim Un*, Trần Cát Đơng* TĨM TẮT Mở đầu Rutin flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa Tuy nhiên, ứng dụng bị giới hạn nhiều, độ tan độ ổn định pha dầu pha nước Do đó, việc acyl hóa rutin cải thiện tính tan pha dầu Mục tiêu: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác enzym lipase từ Candida Phương pháp: Khảo sát sơ điều kiện phản ứng như: dung môi loại enzym (enzym tự enzym cố định) Sau đó, tối ưu hóa thông số phản ứng acyl gồm tỉ lệ chất, tỉ lệ enzym thời gian phản ứng theo phương pháp bề mặt đáp ứng Bên cạnh đó, ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo (từ C6 đến C18) đến phản ứng acyl hóa rutin khảo sát Hiệu suất chuyển đổi thành rutin ester xác định HPLC Kết quả: Điều kiện tối ưu phản ứng acyl hóa rutin tert-butanol enzym lipase cố định g/l, tỷ lệ rutin:acid béo (1:2), thời gian phản ứng (4,52 ngày) Đối với acid lauric, acid palmitic acid stearic có hiệu suất chuyển đổi cao 75,8%, 71,08% 71,13%, tương ứng Trong đó, so với acid béo bão hòa (C18: 0), acid béo khơng bão hòa (C18: 1) có hiệu suất chuyển đổi thấp Kết luận: Xác định điều kiện tối ưu phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase với hiệu suất chuyển đổi phản ứng tăng 1,67 lần so với trước tối ưu Từ khóa: rutin, rutin ester, acyl hóa, lipase ABTRACT ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST Vu Thanh Thao, Huyen Ton Nu Quynh Huong, Tran Thi Yen Chi, Nguyen Thi Kim Uyen, Tran Cat Dong* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 283 - 288 Introduction: Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection, antioxidation However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and stability in both lipophilic and aqueous media The acylation of this molecule can improve it’s lipophilic properties Objectives: To optimize the acylation conditions of rutin with lipase from Candida as biocatalyst Methods: Initial investigation the reaction conditions such as: solvents and types of enzyme (free or immobization enzyme) were determined Then, reaction parameters to acylation reaction consist of subtrate ratio, enzyme ratio and reaction time were optimized using response surface methodology Besides, the effects of carbonchain length of the fatty acids (C6 to C18) on the rutin acylation performance were investigated The convertion yield of rutin ester were measured by HPLC Results: The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized lipase were identified as followed the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is 4.52 days, and quantity of enzymes is 5g/L For lauric acid, palmitic acid and stearic acid, the conversion yields were 75.8%, 71.08% and ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Vũ Thanh Thảo ĐT: 0985353384 Chuyên Đề Dược Học Email: vuthanhthao@uphcm.edu.vn 283 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 71.13%, respectively Herein, compared to the saturated fatty acid (C18:0), the unsaturated one (C18: 1) exhibited a lower reactivity Conclusions: Optimum conditions of acylation reaction of rutin the by lipase as biocatalyst were identified, with the convertion yield of acylaton reation was 1,67 -fold increased after optimization Keywords: rutin, rutin ester, acylation, lipase MỞ ĐẦU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP Rutin flavonoid dạng glycosid bao gồm aglycol quercetin đường đôi rutinose (rhamnose glucose) Rutin sử dụng rộng rãi để làm thuốc với mục đích chống lão hóa tế bào, phòng trị số bệnh liên quan đến mạch máu Tuy nhiên, ứng dụng rutin lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm bị giới hạn, độ ổn định độ tan pha dầu pha nước(9) Vì vậy, có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc rutin (acyl hóa glycosyl hóa), phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) … nhằm tăng độ ổn định độ tan rutin Trong bào chế dược phẩm, glycosyl hóa flavonoid khiến chúng tăng tính thân nước, thích hợp để điều chế chế phẩm đường tiêm Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn(4,6,7) Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh học để tổng hợp dẫn xuất nghiên cứu nhiều Trong đó, phương pháp tổng hợp đường xúc tác sinh học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm thích hợp phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao Một số nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố cấu trúc mạch acyl, khung flavonoid, nguồn gốc enzym, chất dung môi hay hàm lượng nước mơi trường có ảnh hưởng mạnh đến phản ứng acyl hóa flavonoid enzym(1,4) Bên cạnh đó, nghiên cứu cho thấy việc acyl hóa rutin tăng khả chống oxi hóa rutin Vì vậy, báo cáo chúng tơi nghiên cứu điều kiện acyl hóa rutin với xúc tác lipase để cải thiện tính tan rutin Vật liệu 284 Rutin (BV Pharma, Việt Nam) làm nguyên liệu tổng hợp; rutin hydrat (≥ 94%, Sigma) dùng làm chất chuẩn Các acid béo có chiều dài mạch carbon từ C6 đến C18 mua từ Sigma Enzym lipase cố định có nguồn gốc từ Candida antarctica với hoạt tính 10000 U/g lipase tự có nguồn gốc từ Candida rugosa (Sigma) Các dung môi aceton, tert-butanol, acetonitril hạt rây phân tử 3A (Merck) Phản ứng acyl hóa Rutin (15 mM) (C27H30O16) acid béo cho vào chai Duran có chứa sẵn 20 ml dung mơi khan (bằng 100 g/l hạt rây phân tử 3A – ngày) Thêm 100 g/l hạt rây phân tử 3A hoạt hóa (150oC 24 giờ) để điều chỉnh phản ứng theo hướng ester hóa Phản ứng bắt đầu cho – g/l enzym lipase vào bình phản ứng Phản ứng tiến hành 50oC, 200 vòng/phút, đến ngày(5,10) Sau phản ứng, lọc với áp suất giảm hỗn hợp sau phản ứng rửa sản phẩm tert-butanol Thu hồi hạt rây phân tử enzym để tái sử dụng Dịch lọc đem cô để loại hết dung môi thu cắn Cắn đem chiết tách rutin ester xác định hiệu suất chuyển đổi Hình 2: Phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase Chiết tách sản phẩm Trong cắn dịch lọc sau phản ứng sản phẩm rutin ester, có rutin dư, acid béo dư Tiến hành loại acid béo dư Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 heptan:nước (4:1 tt/tt) khoảng – lần, votex mạnh, ly tâm 9600 vòng/phút phút loại bỏ lớp heptan (acid béo nằm lớp heptan) Sau loại rutin dư với ethyl acetat:nước (1:5 tt/tt) 60oC Ly tâm thu lớp ethyl acetat chứa rutin ester loại bỏ lớp nước (rutin dư nằm lớp nước) Cô quay lớp etyl acetat để loại hết dung môi, thu sản phẩm Sau đó, đem sản phẩm phân tích định tính, định lượng(10) Định tính rutin ester với sắc ký lớp mỏng Tiến hành định tính sản phẩm thu sắc ký lớp mỏng với mỏng silica gel GF 254 tráng sẵn Merck với hệ dung môi EtOAc/HCOOH/CHCl3 (3:3:1), phát UV 254 nm Định lượng rutin ester phương pháp HPLC Cột Europher RP 18 (150 x 4,6mm, 5µm), đầu dò UV-Vis, thể tích bơm mẫu 20µl, tốc độ dòng 1ml/phút Pha động methanol (A) nước (B): phút (A:B 10:90); 10 phút (60:40); 16 phút (100:0); 25 phút (60:40); 26 phút (10:90) Bước sóng phát 280 nm Hàm lượng rutin rutin ester sản phẩm tính tốn dựa vào đường chuẩn rutin(8) Hiệu suất chuyển đổi phản ứng acyl hóa rutin tính theo cơng thức sau: H(%)=ne/nrx100 với : số mol sản phẩm rutin ester, : số mol rutin ban đầu Khảo sát sơ điều kiện phản ứng acyl hóa Khảo sát loại enzym: lipase cố định từ Candida antarctica, lipase tự từ Candida rugosa Đồng thời khảo sát loại dung môi: acetonitril, aceton, tert-butanol(8) Tối ưu hóa thơng số phản ứng acyl hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Thử nghiệm tiến hành với yếu tố khảo sát tỷ lệ chất, thời gian phản ứng lượng enzym; yếu tố cấp độ theo thiết kế Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học Box-Wilson Central Composite Design (CCD) Tổng cộng có tất 15 thí nghiệm Thí nghiệm thứ 13 - 15 thử nghiệm trung tâm lập lại lần để xác định mức độ sai số mơ hình đáp ứng Sau sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 (DX 7.1) để tìm mơ hình thực nghiệm thích hợp Thông số đầu thử nghiệm hiệu suất chuyển đổi phản ứng Khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo đến hiệu suất phản ứng acyl hóa Thử nghiệm tiến hành điều kiện tối ưu khảo sát, nhiên, với acid béo khác nhau: Acid caproic (C6), acid caprylic (C8), acid capric (C10), acid lauric (C12), acid myristic (C14), acid palmitic (C16), acid stearic (C18), acid oleic (C18:1) Sigma(4) KẾT QUẢ Điều kiện sơ phản ứng acyl hóa Trong thử nghiệm chúng tơi cố định thông số phản ứng sau: tỷ lệ rutin : acid béo (1:2), thời gian phản ứng (3 ngày), lượng enzym (3 g/l) dùng acid palmitic để acyl hóa rutin(1,3) Bảng 1: Kết khảo sát sơ ảnh hưởng dung môi loại enzym Dung môi Acetonitril Aceton Tert-butanol Enzym tự 22% 28% 31% Enzym cố định 34% 40% 47% Dựa vào bảng kết enzym tự cho hiệu suất thấp enzym cố định dung môi khảo sát (Bảng 2) Đồng thời, tertbutanol dung môi cho hiệu suất cao (47%) (Hình 1-A) Kết phù hợp với nghiên cứu Kontogianni cho thấy dung môi aceton tert-butanol cho hiệu suất phản ứng acyl hóa flavonoid cao(8) Trong đó, Nakajima lại cho acetonitril aceton dung mơi thích hợp cho phản ứng ester hóa enzym lipase (2) Tuy nhiên, aceton dung mơi có đặc tính bất lợi cho phản ứng khả bay cao, độc dễ cháy; 285 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học acetonitril hòa tan chất (rutin) nhiều so với tert-butanol Khảo sát loại enzym (tự cố định), kết cho thấy lipase tự cho hiệu suất phản ứng thấp hơn, đồng thời chi phí cao enzym cố định thu hồi để tái sử dụng Nhiều nghiên cứu gần phản ứng acyl hóa flavonoid sử dụng enzym xúc tác lipase cố định Đặc biệt, Novozym 435 lipase cố định có nguồn gốc từ Candida antarctica sử dụng rộng rãi thị trường Như vậy, chọn dung môi tert-butanol enzym cố định cho thử nghiệm Hình 3: Sắc ký đồ HPLC rutin sản phẩm sau phản ứng acyl hóa rutin enzym A Rutin nguyên liệu, B Sản phẩm phản ứng tert-butanol chưa tối ưu, C Sản phẩm phản ứng tert-butanol tối ưu, D Sản phẩm phản ứng tert-butanol tối ưu sau chiết tách Tối ưu hóa thơng số phản ứng acyl hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Thí nghiệm tiến hành theo thiết kế Box Behnken với 15 thử nghiệm Bảng Bảng 2: Kết thí nghiệm theo phương pháp RSM Số Tỷ lệ chất TN (rutin/acid béo) 1:2 Thời gian phản ứng (ngày) Lượng enzym (g/L) Hiệu suất phản ứng (%) 45,79 1:4 3 33,88 1:2 47,66 286 Số Tỷ lệ chất TN (rutin/acid béo) 1:4 Thời gian phản ứng (ngày) Lượng enzym (g/L) Hiệu suất phản ứng (%) 36,34 1:2 44,31 1:4 29,62 1:2 77,07 1:4 69,07 1:3 30,41 10 1:3 34,63 11 1:3 47,67 12 1:3 5 62,94 13 1:3 41,18 14 1:3 38,65 15 1:3 41,75 Dựa vào phần mềm cho thấy liệu hiệu suất phản ứng acyl hóa rutin phù hợp với mơ hình bậc hai (Quadratic model) với hệ số tương quan mơ hình R2 = 0,96 nghĩa đáp ứng tương ứng mơ hình tính tốn với độ xác 96% Giá trị P (p-value) đáp ứng 0,0069 < 0,05, mơ hình có ý nghĩa thống kê tương thích với thực nghiệm Sau loại trừ hệ số hồi qui khơng có ý nghĩa (p-value > 0,05) suy phương trình hồi qui đáp ứng sau: Hiệu suất phản ứng (%) = 40,52 – 5,74X1 + 14,72X3 + 8,75X32, với X1, X2, X3 biến số đại diện cho yếu tố tỷ lệ chất, thời gian phản ứng, lượng enzym Từ phương trình hồi qui cho thấy, yếu tố tỷ lệ chất có hệ số hồi qui -5,74 (p-value = 0,0221) nên có ảnh hưởng bậc bất lợi đến hiệu suất phản ứng Trong đó, yếu tố lượng enzym vừa có ảnh hưởng bậc vừa có ảnh hưởng bậc tích cực lên tổng hợp rutin ester nghĩa lượng enzym mức cao khoảng khảo sát hiệu suất phản ứng có xu hướng tăng Hơn nữa, hệ số hồi qui X3 14,72 lớn nhiều so với biến số lại Suy yếu tố lượng enzym Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hàm mục tiêu thử nghiệm hiệu suất phản ứng cao Điều kiện xác định phần dự đoán điểm phần mềm sau: tỷ lệ chất 1:2, thời gian phản ứng 4,52 ngày, lượng enzym g/l Với giá trị tối ưu này, hiệu suất phản ứng dự đốn 75,26% Cơng thức dự đốn tối ưu đánh giá cách lặp lại lần thu hiệu suất chuyển đổi 76,5% với độ xác 98,37% Như mơ hình có tính tương thích với thực nghiệm cao 100 Hiệu suất phản ứng (%) yếu tố ảnh hưởng lên q trình acyl hóa rutin Hiệu suất phản ứng tăng từ 29 đến 77% lượng enzym tăng từ đến g/l Mặt khác, tiến hành thử nghiệm với lượng enzym g/l 10 g/l, thu hiệu suất phản ứng 79% 81% Như vậy, tăng lượng enzym ngồi khoảng khảo sát hiệu suất phản ứng tăng khơng đáng kể Vì vậy, lượng enzym thích hợp để hiệu suất phản ứng đạt tối đa có lợi mặt kinh tế g/l 60 40 20 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 C18:1 Chie àu da øi m a ïc h ca rbon a cid bé o Hình 4: Ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo đến phản ứng acyl hóa Sau thực phản ứng acyl hóa rutin, tiến hành xác định cấu trúc sản phẩm rutin ester rutin palmitat (phổ UV, MS, 1H NMR, 13C NMR) để khẳng định tính đặc hiệu phản ứng acyl hóa với xúc tác lipase Kết xác định cấu trúc cho thấy enzym lipase xúc tác phản ứng acyl hóa rutin đặc hiệu vào vi trí C4”’ đường rhamnose OH OH HO O OH OH O O O OH O HO O OH OH CH3 OCO C15H31 Chemical Formula: C43 Công thức: C43H60 OH 1760O17 Exact Mass: 848,3831 Hình 4: Cơng thức hóa học rutin palmitate (Phần mền ChemDraw ultra V9) KẾT LUẬN Tóm lại, điều kiện tối ưu phản ứng acyl hóa rutin: tỷ lệ chất rutin:acid béo 1: 2, thời gian phản ứng 4,52 ngày, lượng enzym g/l Hiệu suất chuyển đổi tối ưu 75,26% Kết sau tối ưu làm tăng hiệu suất phản ứng 1,67 lần so với trước tối ưu TÀI LIỆU THAM KHẢO Chuyên Đề Dược Học 80 Ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo đến phản ứng acyl hóa Dựa vào kết biểu diễn Hình 3, phản ứng acid lauric rutin cho hiệu suất cao (75,8%), phản ứng acid palmitic stearic cho hiệu suất lớn 70% Bên cạnh đó, hiệu suất phản ứng acid oleic (69,38%) khác biệt không đáng kể so với acid stearic (71,13%) Các acid béo lại có hiệu suất acid béo nêu tăng dần theo thứ tự : C6 < C14 < C8 < C10 Kết khác với nghiên cứu Kontogianni cho chiều dài mạch carbon (C8, C10, C12) không ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng acyl hóa flavonoid (rutin, naringin) Novozym 435®(8) Tuy nhiên, Ardhaoui lại cho hiệu suất phản ứng có bị ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo hiệu suất thấp acid béo mạch ngắn (