Rutin là một flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa... Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn bị giới hạn nhiều, do độ tan và độ ổn định kém trong cả pha dầu và pha nước. Do đó, việc acyl hóa rutin sẽ cải thiện tính tan của nó trong pha dầu. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tối ưu hóa điều kiện của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác enzym lipase từ candida.
Trang 1NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE
Vũ Thanh Thảo*, Huyền Tôn Nữ Quỳnh Hương*, Trần Thị Yến Chi*, Nguyễn Thị Kim Uyên*,
Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Mở đầu Rutin là một flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa Tuy nhiên, ứng dụng
của nó còn bị giới hạn nhiều, do độ tan và độ ổn định kém trong cả pha dầu và pha nước Do đó, việc acyl hóa rutin sẽ cải thiện tính tan của nó trong pha dầu.
Mục tiêu: Tối ưu hóa điều kiện của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác enzym lipase từ Candida
Phương pháp: Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng như: dung môi và loại enzym (enzym tự do và enzym
cố định) Sau đó, tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl gồm tỉ lệ cơ chất, tỉ lệ enzym và thời gian phản ứng theo phương pháp bề mặt đáp ứng Bên cạnh đó, ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của các acid béo (từ C6 đến C18) đến phản ứng acyl hóa rutin cũng được khảo sát Hiệu suất chuyển đổi thành rutin ester được xác định bằng HPLC
Kết quả: Điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin trong tert-butanol là enzym lipase cố định 5 g/l, tỷ lệ
rutin:acid béo (1:2), thời gian phản ứng (4,52 ngày) Đối với acid lauric, acid palmitic và acid stearic có hiệu suất chuyển đổi cao nhất lần lượt là 75,8%, 71,08% và 71,13%, tương ứng Trong đó, so với các acid béo bão hòa (C18: 0), acid béo không bão hòa (C18: 1) có hiệu suất chuyển đổi thấp hơn
Kết luận: Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase với hiệu suất
chuyển đổi của phản ứng tăng 1,67 lần so với trước khi tối ưu
Từ khóa: rutin, rutin ester, acyl hóa, lipase
ABTRACT
ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST
Vu Thanh Thao, Huyen Ton Nu Quynh Huong, Tran Thi Yen Chi, Nguyen Thi Kim Uyen, Tran Cat Dong* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 283 - 288
Introduction: Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection,
antioxidation However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and stability in both lipophilic and aqueous media The acylation of this molecule can improve it’s lipophilic properties
Objectives: To optimize the acylation conditions of rutin with lipase from Candida as biocatalyst
Methods: Initial investigation the reaction conditions such as: solvents and types of enzyme (free or
immobization enzyme) were determined Then, reaction parameters to acylation reaction consist of subtrate ratio, enzyme ratio and reaction time were optimized using response surface methodology Besides, the effects of carbon-chain length of the fatty acids (C6 to C18) on the rutin acylation performance were investigated The convertion yield of rutin ester were measured by HPLC
Results: The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized lipase were
identified as followed the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is 4.52 days, and quantity of enzymes is 5g/L For lauric acid, palmitic acid and stearic acid, the conversion yields were 75.8%, 71.08% and
∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 271.13%, respectively Herein, compared to the saturated fatty acid (C18:0), the unsaturated one (C18: 1) exhibited
a lower reactivity
Conclusions: Optimum conditions of acylation reaction of rutin the by lipase as biocatalyst were identified,
with the convertion yield of acylaton reation was 1,67 -fold increased after optimization
Keywords: rutin, rutin ester, acylation, lipase
MỞ ĐẦU
Rutin là một flavonoid dạng glycosid bao
gồm aglycol là quercetin và một đường đôi
rutinose (rhamnose và glucose) Rutin được sử
dụng rộng rãi để làm thuốc với mục đích
chống lão hóa tế bào, phòng và trị một số bệnh
liên quan đến mạch máu Tuy nhiên, ứng
dụng của rutin trong các lĩnh vực thực phẩm,
dược phẩm, mỹ phẩm đang bị giới hạn, bởi độ
ổn định và độ tan kém của nó trong cả pha
dầu và pha nước(9) Vì vậy, hiện đang có nhiều
nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc của rutin
(acyl hóa hoặc glycosyl hóa), bằng các phương
pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học
(enzym) … nhằm tăng độ ổn định và độ tan
của rutin Trong bào chế dược phẩm, glycosyl
hóa flavonoid sẽ khiến chúng tăng tính thân
nước, thích hợp để điều chế các chế phẩm
đường tiêm Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa của
flavonoid lại có tính thân dầu cao hơn(4,6,7)
Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh
học để tổng hợp các dẫn xuất trên cũng đã
được nghiên cứu nhiều Trong đó, phương
pháp tổng hợp bằng con đường xúc tác sinh
học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm và
thích hợp hơn bởi phản ứng enzym có tính
đặc hiệu cao Một số nghiên cứu cho thấy có
nhiều yếu tố như cấu trúc mạch acyl, khung
flavonoid, nguồn gốc enzym, bản chất dung
môi hay hàm lượng nước trong môi trường
có ảnh hưởng khá mạnh đến phản ứng acyl
hóa flavonoid bằng enzym(1,4) Bên cạnh đó,
các nghiên cứu cho thấy việc acyl hóa rutin sẽ
tăng khả năng chống oxi hóa của rutin Vì vậy,
trong báo cáo này chúng tôi nghiên cứu các
điều kiện acyl hóa rutin với xúc tác lipase để
cải thiện tính tan của rutin
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu
Rutin (BV Pharma, Việt Nam) được làm nguyên liệu tổng hợp; rutin hydrat (≥ 94%, Sigma) được dùng làm chất chuẩn Các acid béo
có chiều dài mạch carbon từ C6 đến C18 được mua từ Sigma Enzym lipase cố định có nguồn
gốc từ Candida antarctica với hoạt tính 10000 U/g
và lipase tự do có nguồn gốc từ Candida rugosa
(Sigma) Các dung môi aceton, tert-butanol, acetonitril và hạt rây phân tử 3A (Merck)
Phản ứng acyl hóa
Rutin (15 mM) (C27H30O16) và acid béo được cho vào chai Duran có chứa sẵn 20 ml dung môi khan (bằng 100 g/l hạt rây phân tử 3A trong 3 – 5 ngày) Thêm 100 g/l hạt rây phân tử 3A đã hoạt hóa (150oCtrong 24 giờ) để điều chỉnh phản ứng theo hướng ester hóa Phản ứng bắt đầu khi cho
1 – 5 g/l enzym lipase vào bình phản ứng Phản ứng tiến hành ở 50oC, 200 vòng/phút, trong 3 đến 5 ngày(5,10) Sau phản ứng, lọc với áp suất giảm hỗn hợp sau phản ứng và rửa sản phẩm bằng tert-butanol Thu hồi hạt rây phân tử và enzym để tái sử dụng Dịch lọc đem đi cô để loại hết dung môi thu cắn Cắn được đem đi chiết tách rutin ester và xác định hiệu suất chuyển đổi
Hình 2: Phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase
Chiết tách sản phẩm
Trong cắn của dịch lọc sau phản ứng ngoài sản phẩm rutin ester, còn có rutin dư, acid béo
dư Tiến hành loại acid béo dư bằng
Trang 3heptan:nước (4:1 tt/tt) khoảng 3 – 4 lần, votex
mạnh, ly tâm 9600 vòng/phút trong 5 phút và
loại bỏ lớp heptan (acid béo nằm trong lớp
heptan) Sau đó loại rutin dư với ethyl
acetat:nước (1:5 tt/tt) ở 60oC Ly tâm thu lớp ethyl
acetat chứa rutin ester và loại bỏ lớp nước (rutin
dư nằm trong lớp nước) Cô quay lớp etyl acetat
để loại hết dung môi, thu sản phẩm Sau đó, đem
sản phẩm đi phân tích định tính, định lượng(10)
Định tính rutin ester với sắc ký lớp mỏng
Tiến hành định tính sản phẩm thu bằng sắc
ký lớp mỏng với bản mỏng silica gel GF 254
tráng sẵn của Merck với hệ dung môi
EtOAc/HCOOH/CHCl3 (3:3:1), phát hiện dưới
UV 254 nm
Định lượng rutin ester bằng phương pháp
HPLC
Cột Europher RP 18 (150 x 4,6mm, 5µm), đầu
dò UV-Vis, thể tích bơm mẫu 20µl, tốc độ dòng
1ml/phút Pha động methanol (A) và nước (B): 0
phút (A:B 10:90); 10 phút (60:40); 16 phút (100:0);
25 phút (60:40); 26 phút (10:90) Bước sóng phát
hiện là 280 nm Hàm lượng rutin và rutin ester
trong sản phẩm được tính toán dựa vào đường
chuẩn rutin(8)
Hiệu suất chuyển đổi của phản ứng acyl hóa
rutin được tính theo công thức sau:
H(%)=ne/nrx100 với : số mol sản phẩm rutin
ester, : số mol rutin ban đầu
Khảo sát sơ bộ điều kiện của phản ứng acyl
hóa
Khảo sát 2 loại enzym: lipase cố định từ
Candida antarctica, lipase tự do từ Candida rugosa
Đồng thời khảo sát 3 loại dung môi: acetonitril,
aceton, tert-butanol(8)
Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl
hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt
(RSM)
Thử nghiệm được tiến hành với 3 yếu tố
khảo sát là tỷ lệ cơ chất, thời gian phản ứng và
lượng enzym; mỗi yếu tố 3 cấp độ theo thiết kế
của Box-Wilson Central Composite Design (CCD) Tổng cộng có tất 15 thí nghiệm Thí nghiệm thứ 13 - 15 là thử nghiệm trung tâm được lập lại 3 lần để xác định mức độ sai số của
mô hình đáp ứng Sau đó sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 (DX 7.1) để tìm ra mô hình thực nghiệm thích hợp Thông số đầu ra của thử nghiệm là hiệu suất chuyển đổi của phản ứng
Khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của acid béo đến hiệu suất phản ứng acyl hóa
Thử nghiệm được tiến hành ở điều kiện tối
ưu đã khảo sát, tuy nhiên, với các acid béo khác nhau: Acid caproic (C6), acid caprylic (C8), acid capric (C10), acid lauric (C12), acid myristic (C14), acid palmitic (C16), acid stearic (C18), acid oleic (C18:1) của Sigma(4)
KẾT QUẢ Điều kiện sơ bộ của phản ứng acyl hóa
Trong thử nghiệm này chúng tôi cố định các thông số phản ứng như sau: tỷ lệ rutin : acid béo (1:2), thời gian phản ứng (3 ngày), lượng enzym (3 g/l) và dùng acid palmitic để acyl hóa rutin(1,3)
Bảng 1: Kết quả khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của dung
môi và loại enzym
Dung môi Enzym tự do Enzym cố định
Dựa vào bảng kết quả trên thì enzym tự do cho hiệu suất thấp hơn enzym cố định trong cả 3 dung môi khảo sát (Bảng 2) Đồng thời, tert-butanol là dung môi cho hiệu suất cao nhất (47%) (Hình 1-A) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kontogianni cho thấy 2 dung môi aceton và tert-butanol cho hiệu suất phản ứng acyl hóa flavonoid cao(8) Trong khi đó, Nakajima lại cho rằng acetonitril và aceton là những dung môi thích hợp cho phản ứng ester hóa của enzym lipase (2) Tuy nhiên, aceton là dung môi có những đặc tính bất lợi cho phản ứng như khả năng bay hơi cao, độc và dễ cháy;
Trang 4acetonitril hòa tan cơ chất (rutin) kém hơn nhiều
so với tert-butanol Khảo sát loại enzym (tự do
hoặc cố định), kết quả cho thấy lipase tự do cho
hiệu suất phản ứng thấp hơn, đồng thời chi phí
cũng cao hơn enzym cố định do không thể thu
hồi để tái sử dụng Nhiều nghiên cứu gần đây về
phản ứng acyl hóa các flavonoid cũng đã sử
dụng enzym xúc tác là lipase cố định Đặc biệt,
Novozym 435 là lipase cố định có nguồn gốc từ
Candida antarctica hiện được sử dụng khá rộng
rãi trên thị trường Như vậy, chúng tôi chọn
dung môi tert-butanol và enzym cố định cho
những thử nghiệm tiếp theo
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC của rutin và sản phẩm sau
phản ứng acyl hóa rutin bằng enzym
A Rutin nguyên liệu, B Sản phẩm phản
ứng trong tert-butanol chưa tối ưu, C Sản
phẩm phản ứng trong tert-butanol tối ưu, D
Sản phẩm phản ứng trong tert-butanol tối ưu
sau khi chiết tách
Tối ưu hóa các thông số của phản ứng acyl
hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng
(RSM)
Thí nghiệm được tiến hành theo thiết kế Box
Behnken với 15 thử nghiệm như Bảng 3
Bảng 2: Kết quả thí nghiệm theo phương pháp RSM
Số
TN
Tỷ lệ cơ chất
(rutin/acid
béo)
Thời gian phản ứng (ngày)
Lượng enzym (g/L)
Hiệu suất phản ứng (%)
Số TN
Tỷ lệ cơ chất (rutin/acid béo)
Thời gian phản ứng (ngày)
Lượng enzym (g/L)
Hiệu suất phản ứng (%)
Dựa vào phần mềm cho thấy các dữ liệu
về hiệu suất của phản ứng acyl hóa rutin phù hợp với mô hình bậc hai (Quadratic model) với hệ số tương quan của mô hình là R2 = 0,96 nghĩa là các đáp ứng tương ứng sẽ được mô hình tính toán với độ chính xác là 96% Giá trị
P (p-value) của đáp ứng là 0,0069 < 0,05, như
vậy mô hình trên có ý nghĩa thống kê và
tương thích với thực nghiệm
Sau khi loại trừ các hệ số hồi qui không có
ý nghĩa (p-value > 0,05) suy ra được phương
trình hồi qui của đáp ứng như sau: Hiệu suất phản ứng (%) = 40,52 – 5,74X1 + 14,72X3 + 8,75X32, với X1, X2, X3 là các biến số đại diện lần lượt cho các yếu tố tỷ lệ cơ chất, thời gian phản ứng, lượng enzym
Từ phương trình hồi qui cho thấy, yếu tố
tỷ lệ cơ chất có hệ số hồi qui là -5,74 (p-value =
0,0221) nên có ảnh hưởng bậc 1 bất lợi đến hiệu suất phản ứng Trong khi đó, yếu tố lượng enzym thì vừa có ảnh hưởng bậc 1 vừa
có ảnh hưởng bậc 2 tích cực lên sự tổng hợp rutin ester nghĩa là khi lượng enzym ở mức cao trong khoảng khảo sát thì hiệu suất phản ứng sẽ có xu hướng tăng Hơn thế nữa, hệ số hồi qui của X3 là 14,72 lớn hơn nhiều so với 2 biến số còn lại Suy ra yếu tố lượng enzym là
Trang 5yếu tố ảnh hưởng chính lên quá trình acyl hĩa
rutin Hiệu suất phản ứng tăng từ 29 đến 77%
khi lượng enzym tăng từ 1 đến 5 g/l Mặt khác,
chúng tơi cũng đã tiến hành các thử nghiệm
với lượng enzym là 7 g/l và 10 g/l, thu được
hiệu suất phản ứng lần lượt là 79% và 81%
Như vậy, khi tăng lượng enzym ra ngồi
khoảng khảo sát thì hiệu suất phản ứng tăng
nhưng khơng đáng kể Vì vậy, lượng enzym
thích hợp để hiệu suất phản ứng đạt tối đa
nhưng vẫn cĩ lợi về mặt kinh tế là 5 g/l
Hàm mục tiêu trong thử nghiệm này là hiệu
suất phản ứng cao nhất Điều kiện này được xác
định trong phần dự đốn điểm của phần mềm
như sau: tỷ lệ cơ chất là 1:2, thời gian phản ứng
là 4,52 ngày, lượng enzym là 5 g/l Với các giá trị
tối ưu này, hiệu suất phản ứng được dự đốn là
75,26% Cơng thức dự đốn tối ưu này được
đánh giá bằng cách lặp lại 3 lần thu được hiệu
suất chuyển đổi là 76,5% với độ chính xác
98,37% Như vậy mơ hình cĩ tính tương thích
với thực nghiệm cao
Ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của
acid béo đến phản ứng acyl hĩa
Dựa vào kết quả được biểu diễn trong Hình
3, phản ứng giữa acid lauric và rutin cho hiệu
suất cao nhất (75,8%), phản ứng của acid
palmitic và stearic cho hiệu suất lớn hơn 70%
Bên cạnh đĩ, hiệu suất phản ứng của acid oleic
(69,38%) khác biệt khơng đáng kể so với acid
stearic (71,13%) Các acid béo cịn lại cĩ hiệu suất
hơn các acid béo được nêu trên và tăng dần theo
thứ tự : C6 < C14 < C8 < C10 Kết quả này khác
với nghiên cứu của Kontogianni cho rằng chiều
dài mạch carbon (C8, C10, C12) khơng ảnh
hưởng đến hiệu suất phản ứng acyl hĩa các
flavonoid (rutin, naringin) bằng Novozym
435®(8) Tuy nhiên, Ardhaoui lại cho rằng hiệu
suất phản ứng cĩ bị ảnh hưởng bởi chiều dài
mạch carbon của acid béo và hiệu suất thấp ở
những acid béo mạch ngắn (<C10)(3)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Chiều dài m ạch carbon của acid béo
Hình 4: Ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của
acid béo đến phản ứng acyl hĩa
Sau khi thực hiện phản ứng acyl hĩa rutin, chúng tơi đã tiến hành xác định cấu trúc của một sản phẩm rutin ester là rutin palmitat (phổ UV,
MS, 1H NMR, 13C NMR) để khẳng định tính đặc hiệu của phản ứng acyl hĩa với xúc tác lipase Kết quả xác định cấu trúc cho thấy enzym lipase xúc tác phản ứng acyl hĩa của rutin đặc hiệu vào
vi trí C4”’ trên đường rhamnose
O
O HO
OH
OH OH
OH OH HO
O O
CH 3
OH OH
OCO
C 15 H 31
Chemical Formula: C43H60O17 Exact Mass: 848,3831
Cơng thức: C43H60O17
Hình 4: Cơng thức hĩa học của rutin palmitate (Phần
mền ChemDraw ultra V9)
KẾT LUẬN
Tĩm lại, điều kiện tối ưu của phản ứng acyl hĩa rutin: tỷ lệ cơ chất rutin:acid béo là 1: 2, thời gian phản ứng là 4,52 ngày, lượng enzym là 5 g/l Hiệu suất chuyển đổi tối ưu là 75,26% Kết quả sau khi tối ưu làm tăng hiệu suất phản ứng 1,67 lần so với trước khi tối ưu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ardhaoui M, Falcimaigne A et al (2004) Acylation of natural flavonoids using lipase of candida antarctica as biocatalyst Molecular Catalysis, 29:63-67
2 Nakajima N, Ishihara K et al (1999) Lipase-catalyzed direct and regioselective acylation of flavonoid glucoside for mechanistic investigation of stable plant pigments J Biosci Bioeng, 87(1):105-107
3 Ardhaoui M, Falcimaigne A et al (2004) Effect of acyl donor chain length and substitutions pattern on the enzymatic acylation of flavonoids J Biotechnol, 110(3):265-271
Trang 64 Chebil L, Humeau C et al (2006) Enzymatic acylation of
flavonoids Process Biochemistry, 41:2237–2251
5 Duan Y, Du Z et al (2006) Effect of molecular sieves on
lipase-catalyzed esterification of rutin with stearic acid J Agric Food
Chem, 54(17):6219-6225
6 Gao C, Mayon P et al (2000) Novel enzymatic approach to
the synthesis of flavonoid glycosides and their esters
Biotechnol Bioeng, 71(3):235-243
significance of the flavonoids Pharmacol Ther, 96(2-3):67-202
8 Kontogianni A, Skouridou V et al (2003) Lipase-catalyzed
esterification of rutin and naringin with fatty acids of medium
carbon chain Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,
21(1–2):59-62
9 Lue BM, Nielsen NS et al (2010) Antioxidant properties of modified rutin esters by DPPH, reducing power, iron chelation and human low density lipoprotein assays Food Chemistry, 123(2):221-230
10 Lue BM, Guo Z et al (2010) Scalable preparation of high purity rutin fatty acid esters Journal of the American Oil Chemists' Society, 87(1):55-61
Ngày nhận bài báo 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012