Ứng dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng xác định mức độ sao chép của heparansulphat interacting protein ở mô ung thư

Nghiên cứu được sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng để đánh giá mức độ sao chép của heparansulphat interacting protein (HIP) ở mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ Số * 2007 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH LƢỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ UNG THƢ Trần Vân Khánh*, Tạ Thành Văn* Phương pháp PCR bán định lượng định lượng phương pháp đơn giản, xác cho độ tin cậy tương đối cao sử dụng rộng rãi để xác định mức độ biểu gen khuyếch đại sau phản ứng PCR Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng định lượng để đánh giá mức độ chép Heparansulphat Interacting Protein (HIP) mô ung thư so với mơ lành tính; so sánh kết phương pháp Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mơ ung thư lành tính; tổng hợp cDNA; xác định mức độ chép HIP sử dụng phương pháp PCR bán định lượng định lượng Kết quả: Cả phương pháp cho kết tương tự nhau; HIP tăng cường chép rõ mơ ung thư phát thấp mẫu lành tính Kết luận: Mức độ biểu HIP mô ung thư mơ lành tính khác biệt cách rõ rệt Chúng ta dùng hai phương pháp PCR bán định lượng định lượng để đánh giá mức độ chép HIP chẩn đốn bệnh ung thư Từ khóa: HIP/L29; cancer; transcript ABSTRACT THE DETERMINATION HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN CANCER TISSUES USING SEMIQUANTITATIVE PCR AND QUANTITATIVE PCR METHODS Tran Van Khanh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 – Supplement of No – 2007: 36 – 40 Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple methods They are commonly used to determine amplified gene levels in PCR reaction Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods to determine HIP transcript levels in cancer and normal tissue; to evaluate sensibility of tow methods Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues, cDNA synthesis by reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR); HIP transcript determination using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was up regulated in cancer tissues Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer tissue and the normal control Semiquantitative PCR and quantitative PCR are useful methods to determine HIP transcript for cancer diagnosis Key words: HIP/L29; cancer; transcript ĐẶT VẤNĐỀ Heparin heparansulfate (HP/HS) đại phân tử mang điện âm với độ sulphate hóa cao, chúng có khả tương tác với nhiều loại protein trình sinh học khác đóng vai trò quan trọng việc hình thành trì cấu trúc chức * Trường Đại học Y Hà Nội 36 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ Số * 2007 tế bào(6) Daniel D Carson cộng phát protein bề mặt tế bào biểu mô thận người số dòng tế bào khác, protein đặt tên Heparansulphat Interacting Protein (HIP)(2) Đây protein có chiều dài 155 aa với trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa(3) Khi nghiên cứu sâu chức sinh học HIP tác giả phát HIP có chức tương tự protein gắn lực với HP/HS chúng tổng hợp nhiều dòng tế bào nội mạc tế bào biểu mô trưởng thành Một số nghiên cứu gần chứng minh HIP tăng cường tổng hợp dòng tế bào mô ung thư mức độ RNA thông tin protein như: ung thư tuyến giáp trạng ung thư vú, ung thư đại tràng Đặc biệt mức độ biểu HIP liên quan chặt chẽ với trình phát triển xâm lấn ung thư phụ thuộc vào mức độ ác tính dòng ung thư(1,7) Việc nghiên cứu tìm hiểu chế ung thư mức độ phân tử, từ tìm phương pháp chẩn đoán hữu hiệu điều trị sớm lĩnh vực nhiều nhà khoa học quan tâm Trong vài nghiên cứu gần đây, phương pháp RT-PCR phát thấy mRNA HIP chép với lượng đáng kể mô ung thư vú ung thư tuyến tiền liệt khơng phát phát thấp mô u xơ(4,5) Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp RT-PCR bán định lượng định lượng để xác định mức độ chép HIP mô ung thư, từ so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy phương pháp để ứng dụng chúng xác định mức độ chép HIP gen khác chẩn đoán bệnh ung thư ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng 30 bệnh nhân ung thư chẩn đoán xác định dựa lâm sàng, cận lâm sàng (siêu âm, hố sinh, mơ bệnh học) Bệnh viện K Nghiên cứu Y học Hà nội Chúng sử dụng 15 mẫu mơ lành tính để làm đối chứng Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết mRNA tổng hợp cDNA RNA tổng số tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn mơ tả trước đây(5) 5µg RNA tổng số sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA bổ xung phản ứng reverse transcript-polymerase chain reaction RT- PCR Phương pháp PCR bán định lượng Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự sau: HIP-F: 5’-GCT TAT GGT GCA GAC ATG G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC TGA AGC-3’ PCR tiến hành với tổng thể tích 20µl gồm: µl cDNA, µl 10x Ex Taq Buffer, µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi ngược, unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan) Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: Biến tính 940C - phút, 35 chu kỳ 940C - 50 giây, 580C - 50 giây, 720C - 50 giây , 720C - phút Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA so sánh lượng mẫu sử dụng phản ứng RT-PCR Đậm độ vạch HIP GAPDH xác định nhờ phần mềm chuyên dụng Mức độ chép HIP tính tỉ lệ HIP/GAPDH vẽ đồ thị Phương pháp PCR định lượng (Agilent 2100 Bioanalyzer with DNA 1000 Lab Chips; Agilent Technologies, Palo Alto, CA): Phương pháp PCR định lượng ứng dụng để đánh giá độ tin cậy phương pháp Quy trình PCR tiến hành tương tự phương pháp PCR bán định lượng Vì phương pháp nhạy đánh giá mức độ chép HIP cho dù mức độ thấp nên chu kỳ phản ứng giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ Sản phẩm PCR sau điện di hệ thống capillary (Capillary electrophoresis) mức độ chép HIP xác định thông qua hệ thống máy tính Kết PCR định lượng Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học 37 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ Số * 2007 Nghiên cứu Y học biểu thị đồ thị tương ứng với đỉnh GAPDH sử dụng để so sánh lượng mẫu sử dụng phản ứng mẫu lành tính Sau điện di agarose 2%, sản phẩm PCR nhận có kích thước phân tử 444 bp (hình 1a) Quan sát thấy đậm độ vạch PCR mẫu ung thư rõ so với mẫu lành tính, kết gợi ý HIP tăng cường chép mô ung thư chép thấp mơ lành tính KẾT QUẢ NGHIÊNCỨU Để xác định mức độ chép HIP, sử dụng cặp mồi đặc hiệu với HIP tiến hành phản ứng RT-PCR bán định lượng mẫu RNA tổng số tách từ mẫu ung thư a HIP GAPDH b 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 1 2 3 5 6 7 Hình 1: Kết phản ứng RT-PCR HIP GAPDH mơ ung thư mơ lành tính (a) Sản phẩm khuyếch đại từ cDNA mô ung thư (1-5) mơ lành tính (6-7) Kết định lượng HIP/GAPDH tương ứng với hình a tính vẽ đồ thị (b) Nhận xét: Sản phẩm PCR đặc hiệu gen mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, GAPDH mẫu ung thư đồng thời khơng có khác biệt lượng mẫu mẫu lành tính tương ứng có kích thước 350 bp sử dụng phản ứng PCR Kết vẽ (hình 1a) GAPDH gen thể đồ thị tỉ lệ HIP/GAPDH hình 1b cho thấy tế bào, khơng phụ thuộc vào thể loại, HIP tăng cường chép rõ trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên mơ ung thư phát thấp dùng gen nội chuẩn Kết mẫu lành tính Điều khẳng định phản ứng khuếch đại GAPDH rõ khác biệt mức độ biểu HIP bệnh nhân nghiên cứu có chất lượng mơ ung thư so với mơ lành tính 38 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ Số * 2007 M Nghiên cứu Y học G H M M M M H M G M M M M 3** G M i *** *** G *** *** *** M M M G M *** *** G *** *** M *** M G *** *** M HIP M GAPDH Hình 2: Hình ảnh phản ứng RT-PCR định lượng Kết PCR định lượng HIP tương ứng với đỉnh H mơ ung thư mơ lành tính (bên trái) Kết PCR gen GAPDH tương ứng với đỉnh G (bên phải) Đỉnh M tương ứng với marker 15 1500 bp Sản phẩm khuyếch đại từ cDNA mô ung thư (1-5) mô lành tính (6-7) phản ứng Kết lần khẳng Nhận xét: Kết PCR định lượng đánh định HIP tăng cường chép rõ giá mức độ chép HIP sử dụng hệ mơ ung thư thống điện di cappilary (hình 2) rõ: đỉnh H (bên trái) tương ứng với mức độ mức độ biểu HIP mẫu ung thư (1-5) cao rõ ràng so với mẫu lành tính (6-7) đỉnh G (bên phải) tương ứng với mức độ biểu gen GAPDH khơng thấy có khác biệt, điều chứng tỏ khơng có khác biệt lượng mẫu sử dụng BÀNLUẬN Việc nghiên cứu tìm hiểu gen tăng cường tổng hợp mô ung thư giúp hiểu rõ chế phân tử bệnh, từ cho phép tìm marker có giá trị để chẩn đốn xác định mức độ tiến triển Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học 39 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ Số * 2007 mô ung thư HIP protein bề mặt tế bào phát lần dòng tế bào biểu mơ thận người tổng hợp nhiều dòng tế bào nội mạc tế bào biểu mô trưởng thành HIP gắn trực tiếp vào Heparin, loại protein có khả tương tác với nhiều loại protein khác HIP tham gia vào trình liên kết tế bào – tế bào, tế bào – khoảng gian bào Rohde cộng chứng minh HIP giúp cho tế bào trophoblast gắn vào biểu mô thận tăng cường trình xâm lấn tế bào Một vài nghiên cứu nước gần chứng minh HIP tăng cường tổng hợp dòng tế bào mơ ung thư mức độ RNA thông tin protein(1,4,5,7) Sự tăng cường tổng hợp HIP mô ung thư thúc đẩy tương tác tế bào-tế bào, tế bàongoại bào đồng thời đóng vai trò quan trọng cho phát triển, khư trú xâm lấn khối u Trong nghiên cứu dùng phương pháp RT-PCR bán định lượng định lượng để xác định mức độ biểu gen HIP mô ung thư so sánh với mô lành tính Đây kỹ thuật đơn giản, xác cho độ tin cậy tương đối cao Cả phương pháp cho kết tương tự nhau: HIP tăng cường tổng hợp rõ mơ ung thư phát thấp mơ lành tính Điều giúp cho chúng tơi có định hướng ứng dụng phương pháp công cụ hữu ích khơng việc đánh giá mức độ biểu HIP mô ung thư mà việc nghiên cứu tìm hiểu đánh giá mức độ biểu hiên marker khác chẩn đoán bệnh ung thư Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu tác giả nước cho thấy mức độ chép mRNA HIP tăng cường dòng tế bào mơ ung thư 40 khơng biểu biểu thấp mơ lành tính Sự tăng cường tổng hợp HIP mô ung thư cho phép kết luận rằng, HIP có mối liên hệ chặt chẽ với phát triển mô ung thư dùng HIP marker có giá trị góp phần chẩn đốn bệnh ung thư KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: - Mức độ biểu HIP mô ung thư mơ lành tính khác biệt cách rõ rệt - Cả phương pháp PCR bán định lượng định lượng cho kết tương tự với độ tin cậy cao Chúng ta dùng hai phương pháp để đánh giá mức độ chép HIP số marker khác chẩn đoán xác định bệnh ung thư TÀI LIỆU THAM KHẢO De Nigris, F., Visconti, R.,Fusco, A., et al (1998) Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/ heparin sulfate – binding protein in human thyroid carcinomas Cancer Res 58, 4745-4751 Jacobs, A.L., Julian, J.A., Sahin, A.A., and Carson, D.D (1997) Heparin/Heparansulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia Cancer Research 57, 5148-5154 Liu S., Smith, E Sott, Julian, J., Rohde, H.L, Karin, J Norman., and Carson, D.D (1996) cDNA Cloning and expression of HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin-binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines Journal of biological chemistry.271, 11817-11823 Nguyễn Thị Phương Ngọc, Trần Vân Khánh, Đào Kim Chi, Phạm Thị Lý Tạ Thành Văn (2006) Tăng cường tổng hợp heparan sulfate interacting protein mô ung thư tuyến tiền liệt Tạp chí dược học 367, 132-135 Phan Tơn Hồng Tạ Thành Văn (2005) Sự chép Heparin/Heparan Sulfate Interacting Protein (HIP) mô ung thư vú Tạp chí nghiên cứu Y học 38, 5-10 Tạ Thành Văn (1989) Heparin: Sự tương tác với protein Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69-72 Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S (1997) heparin/heparan sulfate interacting protein gene expression is up – regulated in human colorectal carcinoma and correlated with differentiation status and metastasis Cancer Res 59, 2989-2994 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học ... đáng kể mô ung thư vú ung thư tuyến tiền liệt khơng phát phát thấp mô u xơ(4,5) Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp RT -PCR bán định lượng định lượng để xác định mức độ chép HIP mô ung thư, ... CA): Phương pháp PCR định lượng ứng dụng để đánh giá độ tin cậy phương pháp Quy trình PCR tiến hành tương tự phương pháp PCR bán định lượng Vì phương pháp nhạy đánh giá mức độ chép HIP cho dù mức. .. cứu dùng phương pháp RT -PCR bán định lượng định lượng để xác định mức độ biểu gen HIP mô ung thư so sánh với mô lành tính Đây kỹ thuật đơn giản, xác cho độ tin cậy tương đối cao Cả phương pháp cho