Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát tỉ lệ và kiểu đột biến của gen H-ras trong ung thư hốc miệng và giải trình tự chuỗi DNA của gen H-ras tại các exon 1 và 2 trong 18 ca ung thư tế bào gai ở hốc miệng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 PHÁT HIỆN TỈ LỆ TƯƠNG ĐỐI CAO ĐỘT BIẾN GEN H-RAS VÀ GEN P53 TRONG UNG THƯ HỐC MIỆNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM Nguyễn Thị Hồng* TÓM TẮT Mở đầu: Gen ras oncogen thường bị đột biến ung thư người Trong nghiên cứu trước (năm 2002), tìm thấy 44,4% ung thư hốc miệng (UTHM) có đột biến gen p53 Điều gợi ý khả có hoạt hóa oncogen ras gây ung thư, trường hợp khơng có đột biến gen đè nén bướu p53 Mục tiêu: Khảo sát tỉ lệ kiểu đột biến gen H-ras UTHM Phương pháp: Giải trình tự chuỗi DNA gen H-ras exon 18 ca ung thư tế bào gai hốc miệng Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang Kết quả: Ngồi ca có đột biến gen p53 tìm thấy, kết phát thêm ca có đột biến gen H-ras, chiếm tỉ lệ 16,7% Trong đột biến này, có đột biến thêm nucleotid (GGC) codon 10 codon 11 tạo thêm glycin (10Gly11) khung, đột biến sai nghĩa codon 12 (GGC>AGC) đột biến sai nghĩa codon 13 (GGT>CGT) làm thay đổi axít amin Tất đột biến xảy bệnh nhân nữ có thói quen nhai trầu, ung thư giai đoạn trễ, độ ác tính mơ học thấp, khơng có đột biến gen p53 Ngồi ra, có đột biến im lặng (27,8%) biểu đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T Tổng cộng 18 ca UTHM, có ca (22,2%) đột biến hai gen p53 H-ras, nhiên có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa ghép nối sai đột biến gen H-ras đột biến im lặng Kết luận: Đột biến gen H-ras giữ vai trò quan trọng trình sinh ung thư hốc miệng người Việt Nam Từ khóa: Đột biến gen H-ras, đột biến gen p53, oncogen, gen đè nén bướu, UTHM ABSTRACT DETECTION OF RELATIVELY HIGH INCIDENCE OF H-RAS MUTATIONS AND P53 MUTATIONS IN ORAL CANCER IN VIETNAMESE Nguyen Thi Hong* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 128 - 133 Background: The ras gene is one of the most commonly detected mutated oncogenes in human cancers Our previous study (2002) showed that 44.4% had mutation in p53 tumor suppressor gene We thus hypothesized that the ras oncogene could be activated, especially in cases without p53 mutation Objectives: To investigate the incidence and patterns of H-ras mutation in oral cancer Methods: In this cross-sectional study, DNA samples obtained from the same 18 primary oral squamous cell carcinomas were screened for mutations of hot spots in exons and of the H-ras gene by DNA sequencing Results: Besides p53 mutations found in cases, the H-ras mutations were detected in cases (16.7%) In these three H-ras mutations, one was an insertion of three nucleotide (GGC) between codons 10 and 11 resulting in in-frame insertion of glycine (10Gly11), one was a missense mutation in codon 12 (GGC>AGC) and one was a missense mutation in codon 13 (GGT>CGT) resulting in amino acid changes These H-ras mutations were only *: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Thị Hồng, ĐT: 0903810003; Email: nguyopat@hcm.vnn.vn 128 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học found in female patients with betel chewing habit, advanced stage of the tumor, and low grade of malignancy, but without p53 mutation We also found silent mutations of H-ras gene, with C81T single nucleotide polymorphism (SNP), in of 18 tumors (27.8%) Altogether, cases (22.2%) had simultaneously H-ras mutation (silent mutation) and p53 mutation (missense or abberant splicing mutation) Conclusion: H-ras gene mutation could play an important role in the tumorigenesis of oral carcinoma in Vietnamese patients Key words: H-RAS mutation, p53 mutation, oncogene, tumor suppressor gene, oral cancer ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ung thư hốc miệng (UTHM) mười loại ung thư thường gặp nhất(9) Mặc dù có thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu – yếu tố nguy UTHM, có số người có thói quen bị ung thư Điều cho thấy yếu tố di truyền góp phần thúc đẩy sinh ung thư Việc tìm biến đổi di truyền cần thiết để tạo chất ức chế liệu pháp đích điều trị đặc hiệu ung thư Mẫu nghiên cứu Trong ung thư người, gen đè nén bướu p53 thường bị đột biến Trong nghiên cứu 18 ca ung thư hốc miệng (năm 2002), chúng tơi phát ca có đột biến gen p53, chiếm tỉ lệ 44,4%(6) Nhiều trường hợp khơng có đột biến gen đè nén bướu p53 gợi ý khả đột biến oncogen Trong oncogen, gen ras thường bị đ ột biến nhất(9,10) Họ gen ras, gồm có gen H-ras, K-ras N-ras, mã hóa protein p21 (p21ras) Protein định vị màng tế bào, giữ vai trò trung tâm điều hòa đường dẫn truyền tín hiệu tế bào Đường dẫn truyền tín hiệu Ras-RafMEK-ERK điểm đích hấp dẫn cho điều trị ung thư(9) Để đánh giá đột biến gen H-ras UTHM, nghiên cứu nhằm mục tiêu sau: - Xác định tỉ lệ đột biến gen H-ras UTHM - Khảo sát đồng đột biến gen H-ras đột biến gen p53 UTHM - Khảo sát đột biến H-ras với số đặc điểm lâm sàng-giải phẫu bệnh UTHM Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Gồm 18 ca ung thư tế bào gai hốc miệng chưa điều trị đặc hiệu, điều trị Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM tháng 8/2000 Thiết kế nghiên cứu Cắt ngang mô tả Các phương pháp thực Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết bướu nguyên phát ly trích QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo dẫn nhà sản xuất Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại exon gen p53 gen H-ras Nghiên cứu khảo sát đột biến từ exon đến exon gen p53 đa số (87%) đột biến gen p53 xảy exon này(2) Dùng cặp mồi để khuếch đại exon 5, 6, gen p53 Trình tự nucleotid đoạn mồi phản ứng PCR mô tả y văn (Sakai 1992)(7) Đối với DNA gen H-ras, trình tự đoạn mồi phản ứng PCR khuếch đại exon exon thực nêu y văn (Munirajan 1998, Murugan 2008)(4,5) Mỗi đợt thí nghiệm ln có chứng dương biết cho kết PCR (+) chứng âm thay mẫu DNA nước cất Kết PCR đánh giá cách điện di gel Giải trình tự chuỗi DNA Tinh sản phẩm PCR Thực PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để khuếch đại đoạn gen cần giải trình tự Sau đó, sản phẩm PCR tinh giải trình tự chuỗi DNA Big Dye 129 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Terminator v 1.1 cycle sequencing kit máy giải trình tự ABI-Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem) Tất mẫu thực PCR hai lần, gồm lần PCR với đoạn mồi chiều lần PCR với đoạn mồi ngược chiều KẾT QUẢ Đột biến gen p53 ca có đột biến gen p53, chiếm tỉ 44,4% Về exon đột biến, ca đột biến exon 5; ca exon 7; ca exon ca hai exon Không đột biến exon (Bảng 1) Tổng cộng phát đột biến ca, có đột biến điểm sai nghĩa (77,8%) đột biến ghép nối sai (22,2%) Tỉ lệ đột biến gen p53 nhóm bệnh nhân có thói quen nhai trầu (57,1%), hút thuốc (42,9%) cao nhóm khơng có thói quen (25%) Tỉ lệ đột biến gen p53 nhóm bệnh nhân 60 tuổi, ung thư giai đoạn trễ, độ ác tính mơ học trung bình, tăng cao nhóm bệnh nhân 60 tuổi, giai đoạn sớm, độ mô học thấp (Bảng 2) Đột biến gen H-ras Đột biến gen H-ras xảy ca (38,9%), exon 1, bao gồm (Bảng 1): - ca đột biến thêm nucleotid (GGC) vào codon 10 codon 11 nên tạo thêm axít amin glycin (10Gly11) khung - ca đột biến điểm sai nghĩa codon 12 (GGC>AGC) đột biến im lặng codon 27 - ca đột biến điểm sai nghĩa codon 13 (GGT>CGT) - ca đột biến im lặng C81T codon 27 biểu đa hình nucleotid đơn (SNP) Khơng kể đột biến im lặng, tỉ lệ đột biến gen H-ras mẫu nghiên cứu 16,7% Tổng cộng có đột biến ca Trong đó, có đột biến im lặng không làm thay đổi protein (62,5%) đột biến làm thay đổi protein (37,5%) Trong ca đột biến này, có ca đột biến điểm (66,7%) Tất ca xảy bệnh nhân nữ, 60 tuổi, có thói quen nhai trầu, ung thư giai đoạn trễ, bướu có độ ác tính mơ học thấp khơng có đột biến gen p53 (Bảng 3) Đồng đột biến p53 H-ras Có ca (22,2%) đột biến xảy hai gen p53 H-ras Tuy nhiên, có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa ghép nối sai đột biến gen H-ras đột biến im lặng Bảng 1: Đột biến gen H-ras đột biến gen p53 18 ca UTHM ST T Tuổi 75 Nữ Nhai trầu 75 Nữ 10 11 80 53 69 70 51 52 40 82 73 Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Giới Thói quen Vị trí Độ mơ học Giai đoạn Má III Nhai trầu* Nướu IV Nhai trầu Hút thuốc Nhai trầu* Hút thuốc Nhai trầu* Nhai trầu* Không Hút thuốc Nhai trầu Má Lưỡi Má Sàn m Má Môi Má Lưỡi Má 2 1 1 IV III III III IV IV IV III II Nucleotid 30_3 34 81 37 81 81 81 81 Đột biến H-ras (exon 1-2) Codon Axit Kiểu đột Amin biến insGGC 10Gly11 Thêm GGC-AGC CAT-CAC GGT-CGT CAT-CAC CAT-CAC CAT-CAC CAT-CAC G12S H27H G13R H27H H27H H27H H27H Sai nghĩa Im lặng Sai nghĩa Im lặng Im lặng Im lặng Im lặng (-) (-) (-) (-) Đột biến p53 (exon5-8) (-) (-) (-) Exon Exon Exon 7, Exon Exon Exon Exon Exon *: Nhai trầu kèm xỉa thuốc 130 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng 2: Đột biến gen p53 lâm sàng-giải phẫu bệnh UTHM Đặc điểm Tuổi Giới tính Thói quen Tổng 18 ca ≤60 >60 11 Nam Nữ 11 Nhai trầu Hút thuốc Khơng Vị trí Lưỡi Má Sàn miệng Mơi Nướu Giai I II đoạn III IV Độ mô Độ học Độ Đột biến p53 ca (44,4%) (57,1) (36,4) (42,9) (45,5) (57,1) Không đột biến p53 10 ca (55,6%) (42,9) (57,1) (25,0) (75,0) 2 (28,6) (66,7) (50,0) (71,4) (33,3) 1(50,0) 15 (50,0) (0) (33,3) (46,6) (50,0) (100) (66,7) (53,3) 11 (36,4) (57,1) (63,6) (42,9) (42,9) (63,6) (57,1) (54,4) (42,9) Bảng 3: Đột biến gen H-ras lâm sàng-giải phẫu bệnh UTHM Đặc điểm Tổng Đột biến H-ras Không đột biến 18 ca ca (16,7%) Hras 12 ca (83,3%) Tuổi ≤60 (0) (100) >60 11 (27,3) (72,7) Giới tính Nam (0) (100) Nữ 11 (27,3) (72,7) Thói quen Nhai trầu (42,9) (57,1) Hút thuốc (0) (100) Không (0) (100) Vị trí Lưỡi (0) (100,0) Má (33,3) (66,7) Sàn miệng (0) (100) Môi (0) (100) Nướu 1 (100) (0) Giai đoạn I II (0) (100) III IV 15 (20,0) 12 (80,0) Độ mô học Độ 11 (27,3) (72,7) Độ (0) (100) Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học BÀN LUẬN Khảo sát đột biến gen p53 gen H-ras Hơn 30% ung thư người có đột biến gen ras: K-, N- H-ras Để phân tích đột biến gen ras, nghiên cứu chọn khảo sát gen H-ras, đa số đột biến UTHM tìm thấy gen H-ras mà gen K-ras N-ras(9) Gen H-ras nằm nhiễm sắc thể 11, chứa exon mã hóa protein p21 (p21ras)(10) Nghiên cứu phân tích exon exon gen H-ras, exon dễ bị đột biến nhất, có nhiều điểm nóng đột biến codon 12 13 exon (vùng gắn GTP), codon 61 (vùng GTPase) exon 2(8,9,10) Đột biến vị trí khiến cho protein ln trạng thái hoạt hóa (đột biến tăng chức năng) Kết nghiên cứu tìm thấy đột biến H-ras codon 12 13 Trong nghiên cứu Sathyan (2007)(9), đa số đột biến H-ras codon 12 (63%), codon 13 (32%), codon 61 (5%) Gen p53 nằm nhiễm sắc thể 17 Việc giải trình tự gen p53 để tìm đột biến phức tạp hơn, nhiều thời gian gen H-ras, gen p53 dài (11 exon), thường phải khảo sát exon từ exon đến nơi tập trung đa số (87%) đột biến(2) Tỉ lệ đột biến gen p53 H-ras Đột biến gen p53 xảy UTHM liên quan thói quen nhai trầu, thường có tỉ lệ tương đối thấp nhiều nước châu Á phổ biến thói quen nhai trầu Ấn Độ (17-21%), Myanmar (17,5%), Papua New Guinea (10%), Đài Loan (5,4%)(2,3,6) Tuy nhiên, phát đột biến gen p53 UTHM với tỉ lệ tương đối cao 44,4% mẫu nghiên cứu có 38,9% bệnh nhân có thói quen nhai trầu Tỉ lệ gần tương tự tỉ lệ đột biến gen p53 cao Nhật Bản (63%), Mỹ (53%), Pháp (67%) - nơi mà hút thuốc uống rượu xem yếu tố nguy chính(1,2,7) Ngược lại, đột biến gen H-ras thường gặp UTHM người nhai trầu Đột biến gen H- 131 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ras chiếm tỉ lệ 12,5-35% Ấn Độ, liên quan với thói quen nhai trầu(4,8,9), lại có tỉ lệ thấp 0-5% Anh, Nhật, Mỹ(7,9) Nghiên cứu phát tỉ lệ đột biến gen H-ras UTHM 16,7%, tất ca đột biến có thói quen nhai trầu Sự thay đổi nhiều tỉ lệ đột biến gen p53 ras UTHM nước chủ yếu khác biệt thói quen nguy cơ(1,10) Ngồi ra, khác kỹ thuật phát hiện, vị trí ung thư, chế độ dinh dưỡng, tình trạng miệng Tỉ lệ tương đối cao 38,9% khơng có đột biến gen p53 gen H-ras gợi ý UTHM biến đổi gen protein khác tế bào (như MDM2) hay virus sinh ung thư (như virus gây bướu nhú người HPV) Trong UTHM, tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%) cao tỉ lệ đột biến gen H-ras (16,7%) Nhìn chung, đột biến gen đè nén bướu p53 oncogen H-ras tương đối phổ biến UTHM người Việt Nam Kiểu đột biến gen p53 H-ras Đa số đột biến gen p53 gen H-ras đột biến điểm Đột biến gen p53 thường gặp đột biến sai nghĩa (87,5%) sản xuất protein p53 bị chức Trong gen H-ras, thường gặp đột biến im lặng (62,5%) đột biến sai nghĩa (25%) đột biến thêm vào (12,5%) Tuy nhiên, xét riêng đột biến làm thay đổi protein, đa số đột biến H-ras đột biến sai nghĩa (66,7%) Theo y văn(2), nitrosamin thuốc nhai alkylat hóa DNA vị trí nucleotid guanin (G) thymin (T) dẫn tới chuyển vị G:C>A:T Benzopyren khói thuốc gây đột biến chuyển dạng G:C>T:A Trong nghiên cứu này, đột biến chuyển vị (G:C>A:T) đột biến chuyển dạng (như G:C>C:G) gặp đột biến gen p53 gen H-ras Trong ca đột biến sai nghĩa gen H-ras, ca nhai trầu kèm xỉa thuốc có đột biến dạng chuyển vị 132 G:C>A:T Tất đột biến im lặng hay đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T giống gen H-ras bệnh nhân thường sử dụng thuốc (gồm ca nhai trầu-xỉa thuốc ca hút thuốc), có đột biến chuyển vị (C:G>T:A) Kết phù hợp với y văn, cho thấy khả N-nitrosamin thuốc nhai hay xỉa gây đột biến gen H-ras Đột biến gen H-ras lâm sàng UTHM Đa số nghiên cứu cho đột biến gen p53 không liên quan với tuổi, giới tính, giai đoạn TNM, thói quen hút thuốc, nhai trầu; nhiên có nghiên cứu tìm thấy đột biến gen p53 liên quan với tiên lượng xấu(2,3,6) Các ca đột biến gen H-ras xảy nữ, có thói quen nhai trầu, vị trí ung thư niêm mạc má nướu răng, ung thư giai đoạn trễ, bướu có độ ác tính mơ học thấp Trong nghiên cứu Sathyan 152 ca UTHM Ấn Độ (2007)(9), đột biến H-ras liên quan có ý nghĩa với giới tính nữ nhiều nam, diễn tiến khơng tái phát, tiên lượng tốt; không liên quan với di hạch, kích thước bướu, độ ác tính mơ học, giai đoạn bệnh KẾT LUẬN Nghiên cứu phát tỉ lệ tương đối cao đột biến gen p53 (44,4%) H-ras (16,7%) Như vậy, đột biến gen p53 H-ras thường diện UTHM người Việt Nam Không đột biến bất hoạt gen đè nén bướu p53, đột biến hoạt hóa oncogen H-ras góp phần q trình sinh ung thư hốc miệng TÀI LIỆU THAM KHẢO Chitra G., Chandramouli A., Chanchal C (2010) “P53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma” Int J Pharm Biomed Res 1(3) pp 117-121 Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C (1994) “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis” Cancer Research 54 pp 4855-4878 Hsieh L.L., Wang P.F., Chen I.H., Liao C.T., Chen C.M., Chang C.J.T (2001) “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betael quid chewing and cigarette smoking in Taiwaneses” Carcinogenesis 22(9) pp 1497-1503 Munirajan A.K., Mohanprasad B.K.C., Shanmugam G., Tsuchida N (1998) “Detection of a rare point mutation at Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 codon 59 and relatively high incidence of H-ras mutation in Indian oral cancer” Int J Oncol 13 pp 971-974 Murugan A.K., Hong N.T., Fukui Y., Munirajan A.K., Tsuchida N (2008) “Oncogenic mutations of the PIK3CA gene in head and neck squamous cell carcinomas” Int J Oncol 32 pp 101-111 Nguyễn Thị Hồng, Phạm Hùng Vân, cộng (2002) “Đột biến gen p53 ung thư miệng: phát qua kỹ thuật PCR-SSCP” Tạp chí Y học Tp.HCM 4(6) Trang 52-57 Sakai E., Rikimaru K., Ueda M., Matsumoto Y., Ishii N., Enomoto S., Yamamoto H and Tsuchida N (1992) “The p53 tumor-suppressor gene and ras oncogene mutations in oral squamous-cell carcinoma” Int J Cancer 52 pp 867-872 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 10 Nghiên cứu Y học Saranath D., Chang S.E., Bhoite L.T., Panchal R.G., Kerr I.B, Mehta A.R., Johnson N.W., Deo M.G (1991) “High frequency of mutation in codon 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma of India” Br J Cancer 63 pp 573-578 Sathyan K.M., Nalinikumari K.R., Kannan S (2007) “H-Ras mutation modulates the expression of major cell cycle regulatory proteins and disease prognosis in oral carcinoma” Modern Pathol 20 pp 1141-1148 Süzen S., Parry J.M (2001) “Analysis of ras gene mutation in human oral tumours by polymerase chain reaction and direct sequencing” Turk J Med Sci 31 pp 217-223 133 ... biến UTHM người Việt Nam Kiểu đột biến gen p53 H-ras Đa số đột biến gen p53 gen H-ras đột biến điểm Đột biến gen p53 thư ng gặp đột biến sai nghĩa (87,5%) sản xuất protein p53 bị chức Trong gen. .. sinh ung thư (như virus gây bướu nhú người HPV) Trong UTHM, tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%) cao tỉ lệ đột biến gen H-ras (16,7%) Nhìn chung, đột biến gen đè nén bướu p53 oncogen H-ras tương đối. .. khơng có đột biến gen p53 (Bảng 3) Đồng đột biến p53 H-ras Có ca (22,2%) đột biến xảy hai gen p53 H-ras Tuy nhiên, có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa ghép nối sai đột biến gen H-ras đột biến im