Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô hà thủ ô đỏ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của bột cao khô Hà thủ ô đỏ được điều chế bằng phương pháp phun sấy. Phương pháp: đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng đối với nguyên liệu dạng bột cao khô, từ đó đưa ra mức giới hạn chất lượng.

Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG BỘT CAO KHÔ HÀ THỦ Ô ĐỎ Nguyễn Văn Liệu*; Nguyễn Văn Bạch* Nguyễn Thị Thu Hồi*; Hồng Việt Dũng* TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ điều chế phương pháp phun sấy Phương pháp: đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu dạng bột cao khơ, từ đưa mức giới hạn chất lượng Kết quả: đánh giá đưa mức giới hạn chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ số tiêu gồm: tính chất, khối lượng làm khơ, độ mịn, định tính, định lượng, tro toàn phần, kim loại nặng giới hạn nhiễm khuẩn Kết luận: xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ * Từ khóa: Hà thủ đỏ; Bột cao khơ; Tiêu chuẩn chất lượng Study on Establishing the Quality Standard of Dry Extract of Radix Fallopiae Multiflorae Summary Objectives: Establishing the quality standard of dry extract of Radix Fallopiae multiflorae Methods: Determining some quality criteria of dry extract of Radix Fallopiae multiflorae to create the quality level Results: Determining and creating the quality level of dry extract of Radix Fallopiae multiflorae with some criteria including: property, loss on drying, identification, quantification, total ash, heavy metal, limit of microbial infection Conclusion: The quality standard of dry extract of Radix Fallopiae multiflorae was established * Key words: Radix Fallopiae multiflorae; Dry extract; Quality standard ĐẶT VẤN ĐỀ Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae) dược liệu dùng phổ biến để điều trị số bệnh như: suy nhược thể, thiếu máu, tóc bạc sớm… [2, 3] Hiện nay, Hà thủ đỏ có vào số dạng bào chế như: thuốc bột, viên nang để tạo thuận lợi sử dụng Q trình nghiên cứu, nhóm tác giả bào chế nguyên liệu bột cao khô Hà thủ ô đỏ phương pháp phun sấy, từ bào chế chế phẩm hồn thiện Tuy nhiên, để chế phẩm cuối đạt hiệu tác dụng tốt chất lượng nguyên liệu bột cao khô đầu vào quan trọng Trong nội dung báo này, thông báo kết quả: Đánh giá chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ bào chế được, từ xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Việt Dũng (vietdungk85@yahoo.com) Ngày nhận bài: 04/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/09/2016 Ngày báo đăng: 16/09/2016 14 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 NGUYấN VT LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu thiết bị - Nguyên liệu: mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ (ký hiệu lô HTO1, lô HTO2 lô HTO3) lấy từ lô sản xuất khác nhau, bào chế tháng 03 - 2016, Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược, Học viện Quân y cung cấp - Hóa chất, dung môi: chất chuẩn 2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2-O-β-Dglucosid (THSG) (97,3%, Hãng Sigma); acetonitril, axít formic: đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck); ethanol, ether ethylic, HCl đậm đặc: đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (Trung Quốc)… - Thiết bị, dụng cụ: hệ thống HPLC Waters 2695D (Mỹ); bếp cách thủy memmert (Đức); cân phân tích Mettler, độ xác 0,1 mg (Thụy Sỹ)… Phương pháp nghiên cứu * Tính chất: thử cảm quan * Mất khối lượng làm khô: thử theo phương pháp xác định khối lượng làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN IV) * Độ mịn: xác định độ mịn bột theo Phụ lục 3.5, DĐVN IV Lấy 20 g chế phẩm để thử * Định tính: - Phản ứng hóa học: + A: lấy 0,2 g bột cao khơ cho vào ống nghiệm, đun nóng với 10 ml nước phút, để nguội, lọc Thêm - giọt dung dịch natri hydroxyd (TT) có màu đỏ sẫm + B: lấy 0,1 g bột cao khô, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT) đun cách thủy phút, để nguội, lọc Dịch lọc axít hóa dung dịch axít hydrocloric 10% (TT) đến mơi trường axít (thử giấy quỳ) Sau đó, lắc với 20 ml ether ethylic (TT), lớp ether ethylic có màu vàng cam Gạn lấy ml ether, thêm ml dung dịch amoniac đậm đặc (TT), lớp amoniac có màu đỏ - Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4, DĐVN IV): + Bản mỏng silica gel 60 F254 + Dung môi khai triển: n-Hexan:aceton (5:1) + Dung dịch thử: đun nóng 0,4 g bột cao khô Hà thủ ô đỏ với 10 ml ethanol 70% (TT) phút, để nguội, lọc Dịch lọc cô cách thủy đến cắn Thêm 10 ml nước ml dung dịch axít hydrocloric 10% (TT) vào cắn Sau đó, đun cách thủy 30 phút, để nguội, lắc với 10 ml ether ethylic (TT) lần Dịch ether bay khoảng ml dùng làm dung dịch thử + Dung dịch đối chiếu: đun hồi lưu g bột Hà thủ ô đỏ (mẫu dược liệu chuẩn) với 20 ml ethanol 70% (TT) 30 phút, để nguội, lọc Dịch lọc cô cách thủy đến cắn Thêm 10 ml nước ml dung dịch axít hydrocloric 10% (TT) vào cắn Sau đó, đun cách thủy 30 phút, để nguội, lắc với 10 ml ether ethylic (TT) lần Dịch ether bay khoảng ml dùng làm dung dịch đối chiếu + Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau khai triển, để khơ mỏng ngồi khơng khí nhiệt độ phòng màu amoniac đậm đặc (TT) 15 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 + ỏnh giỏ kt quả: so sánh màu sắc giá trị Rf vết xuất sắc ký đồ dung dịch thử với vết xuất sắc ký đồ dung dịch đối chiếu - Cách tiến hành: tiêm dung dịch thử dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu, ghi thời gian lưu diện tích píc THSG dung dịch * Định lượng: phương pháp HPLC (Phụ lục 5.3, DĐVN IV) - Tính kết quả: hàm lượng THSG (mg/g) bột cao khơ Hà thủ đỏ khơ kiệt tính theo công thức: - Điều kiện sắc ký: cột Sunfire Waters RP-18 (250 x 4,6 mm, µm, 100 A0) cột tương đương; bước sóng 320 nm; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 10 µl; nhiệt độ cột: 280C; pha động: chương trình gradient pha động bảng Bảng 1: Chương trình gradient pha động Thời gian (phút) Tỷ lệ acetonitril (%) Tỷ lệ axít formic 0,1% (%) 23 77 23 77 10 100 18 100 20 23 77 30 23 77 - Chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn: + Chuẩn bị mẫu thử: cân xác 20 mg bột cao khơ Hà thủ đỏ cho vào bình định mức 25 ml, thêm methanol vào, lắc siêu âm 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc Lọc dịch bình định mức qua màng 0,45 µm phân tích HPLC + Chuẩn bị mẫu chuẩn: hòa tan pha lỗng lượng xác chất chuẩn THSG dung môi methanol để dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ khoảng 10,0 µg/ml 16 HL (mg/g) = Cch x Sth x 25 x 10-3 x 100 Sch x mc x (100-h) Trong đó: Sth, Sch: diện tích píc THSG dung dịch thử dung dịch chuẩn (µV*s); Cch: nồng độ dung dịch THSG chuẩn (µg/ml); mc: khối lượng mẫu thử (g); h: độ ẩm bột cao khơ (%) * Tro tồn phần: tiến hành thử theo phương pháp xác định tro toàn phần (phương pháp 1, Phụ lục 9.8, DĐVN IV) * Kim loại nặng: lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3, phụ lục 9.4.8, DĐVN IV Dùng 2,0 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu * Giới hạn nhiễm khuẩn: thử theo phương pháp thử giới hạn nhiễm khuẩn (phương pháp đĩa thạch, Phụ lục 13.6, DĐVN IV) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tính chất Qua quan sát mô tả, đề nghị đưa đặc điểm nhận dạng bột cao khô Hà thủ ô đỏ gồm: dạng bột khô tơi, màu nâu đỏ, đồng nhất, dễ hút ẩm ngồi khơng khí, có mùi thơm đặc trưng dược liệu, khơng có mùi nấm mc, v hi ng Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2016 Mất khối lượng làm khô Bảng 2: Kết xác định tỷ lệ khối lượng làm khô bột cao khô Hà thủ ô đỏ Lô HTO1 Lô HTO2 Lô HTO3 Mẫu Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) 3,0024 2,35 3,0012 1,65 3,0121 2,41 3,0176 2,52 3,0071 1,67 3,0005 2,61 3,0156 2,49 3,0201 1,87 3,0082 2,79 3,0098 2,73 3,0123 1,66 3,0093 2,54 3,0187 2,51 3,0042 1,69 3,0179 2,58 3,0028 2,47 3,0002 1,71 3,0142 2,56 X ± SD (%) RSD (%) 2,51 ± 0,12 1,71 ± 0,08 2,58 ± 0,12 4,91 4,80 4,77 Độ ẩm lô bột cao khô Hà thủ ô đỏ khoảng 1,71 - 2,58% Dựa kết kiểm nghiệm tham khảo tài liệu DĐVN IV [1], đề nghị đưa mức giới hạn độ ẩm bột cao khô Hà thủ ô đỏ không 5,0% Độ mịn Bảng 3: Kết đánh giá độ mịn bột cao khô Hà thủ ô đỏ Lô HTO1 Lô HTO2 Khối lượng bột cân (g) 20,04 99,21 32,58 20,16 99,93 30,92 20,01 97,80 35,15 20,15 98,14 34,13 20,03 96,41 33,47 20,06 98,91 34,18 19,99 99,42 31,09 20,12 98,02 31,38 20,03 97,91 32,42 20,42 99,34 32,82 20,86 98,80 32,65 20,13 95,94 32,07 20,02 96,53 32,07 20,09 95,42 33,19 20,03 99,71 33,78 20,72 96,01 33,56 20,13 97,25 30,72 20,15 97,24 31,69 98,42 ± 1,46 32,71 ± 1,08 97,64 ± 1,63 32,06 ± 1,20 97,92 ± 1,31 33,22 ± 1,36 1,47 3,29 1,67 3,74 1,36 4,10 X RSD (%) Khối lượng bột cân (g) Tỷ lệ bột Tỷ lệ bột qua rây số qua rây số 350 (%) 180 (%) Khối lượng bột cân (g) Tỷ lệ Tỷ lệ bột bột qua qua rây số rây số 350 (%) 180 (%) Mẫu ± SD (%) Tỷ lệ bột Tỷ lệ bột qua rây số qua rây số 350 (%) 180 (%) Lô HTO3 Ở mẫu bột cao khô đem thử, tỷ lệ % bột qua rây số 350 > 95% tỷ lệ % bột qua rây số 180 < 40%, chứng tỏ bột cao khô Hà thủ đỏ bột nửa mịn 17 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 nh tính - Phản ứng hóa học: Bảng 4: Phản ứng hóa học định tính bột cao khơ Hà thủ đỏ Thứ tự Thuốc thử/phản ứng Kết Dung dịch NaOH Xuất màu đỏ sẫm Phản ứng Boertraeger Lớp amoniac xuất màu đỏ Trong bột cao khơ Hà thủ đỏ có chứa nhóm hợp chất anthranoid sử dụng phản ứng bảng để định tính thành phần hóa học bột cao khô Hà thủ ô đỏ - Sắc ký lớp mỏng: sau khai triển sắc ký màu amoniac đậm đặc, mỏng sắc ký mẫu A dịch chiết bột cao khô mỏng sắc ký mẫu dược liệu Hà thủ ô chuẩn xuất 02 vết màu vàng cam có Rf 0,18 - 0,19 0,66 - 0,67 Như vậy, sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với điều kiện nêu mục để định tính bột cao khơ Hà thủ đỏ B Hình 1: Ảnh sắc ký lớp mỏng mẫu dịch chiết bột cao khô Hà thủ ô đỏ (A) mẫu dịch chiết Hà thủ ụ (B) 18 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 8-2016 Định lượng Bảng 5: Kết định lượng THSG bột cao khô Hà thủ ô đỏ Mẫu X Lô HTO1 Lô HTO2 Lô HTO3 Khối lượng bột (mg) Diện tích píc (µV*s) HL (mg/g) Khối lượng bột (mg) Diện tích píc (µV*s) HL (mg/g) Khối lượng bột (mg) Diện tích píc (µV*s) HL (mg/g) 20,1 332299 12,31 20,6 340905 12,65 20,8 321668 11,89 20,6 315846 11,66 20,5 337362 12,51 20,6 318883 11,78 21,2 315339 11,64 20,7 350271 13,02 21,1 332299 12,31 20,8 327236 12,11 20,5 339134 12,58 20,3 315339 11,64 20,4 323946 11,98 19,8 326730 12,09 20,7 321161 11,87 20,1 327996 12,14 20,3 338374 12,55 19,9 313821 11,58 ± SD (%) RSD (%) 11,97 ± 0,27 12,57 ± 0,30 11,85 ± 0,26 2,27 2,37 2,19 Hàm lượng THSG mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ khoảng từ 11,85 - 12,57 mg/g tính theo bột cao khô kiệt Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn hàm lượng THSG mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ không mg/g Tro toàn phần Bảng 6: Kết xác định tro tồn phần bột cao khơ Hà thủ ô đỏ Mẫu X Tro toàn phần (%) Lô HTO1 Lô HTO2 Lô HTO3 6,92 7,04 6,85 6,88 6,68 7,23 6,53 6,91 6,89 6,85 6,76 6,78 7,42 6,32 6,83 7,11 6,45 6,23 6,95 ± 0,30 6,69 ± 0,27 6,80 ± 0,32 4,26 4,07 4,75 ± SD (%) RSD (%) Tỷ lệ tro toàn phần mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ khoảng 6,69 - 6,95% Dựa kết kiểm nghiệm tham khảo tài liệu DĐVN IV, đề nghị đưa mức giới hạn tỷ lệ tro toàn phần bột cao khô Hà thủ ô đỏ không 9,0% 19 Tạp chí y - dợc học quân sè 8-2016 Kim loại nặng Kết xác định hàm lượng kim loại nặng mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ phương pháp so màu cho thấy màu ống dung dịch thử nhạt màu ống dung dịch đối chiếu có nồng độ chì 20 ppm Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa giới hạn kim loại nặng bột cao khô Hà thủ ô đỏ không 20 ppm Giới hạn nhiễm khuẩn Kết xác định tiêu vi sinh vật cho thấy mẫu bột cao khơ Hà thủ đỏ có giới hạn nhiễm khuẩn đạt mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Cụ thể, tổng số vi khuẩn hiếu khí < 104, tổng số nấm men nấm mốc < 100, tổng số vi khuẩn Enterobacteria < 500, khơng có vi khuẩn điểm vệ sinh E coli, P aeruginosa, S aureus Salmonella Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn nhiễm khuẩn bột cao khô Hà thủ ô đỏ mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô Hà thủ ô đỏ gồm tiêu yêu cầu sau: - Tính chất: khối bột khơ tơi, màu nâu đỏ, dễ hút ẩm, có mùi thơm đặc trưng dược liệu, khơng có mùi nấm mốc, vị đắng - Mất khối lượng làm khô: không 5% - Độ mịn: bột nửa mịn (355/180) - Tro tồn phần: khơng 9,0% - Kim loại nặng: không 20 ppm 20 - Định tính: chế phẩm phải thể phép thử định tính dược liệu Hà thủ đỏ - Định lượng: hàm lượng THSG bột cao khô hà thủ ô đỏ không nhỏ 8,0 mg/g tính theo bột cao khơ kiệt - Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt mức 4, Phụ lục 13.6 - DĐVN IV KẾT LUẬN Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô Hà thủ ô đỏ với số tiêu gồm: tính chất, khối lượng làm khơ, độ mịn, định tính, định lượng, tro tồn phần, kim loại nặng giới hạn nhiễm khuẩn Tiêu chuẩn áp dụng để kiểm tra đánh giá chất lượng mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ bào chế phương pháp phun sấy LỜI CẢM ƠN Kết nghiên cứu phần nội dung đề tài mã số KHCNTB.04C/13-18 tài trợ Chương trình “Khoa học Công nghệ phục vụ phát triển bền vững vùng Tây Bắc” mã số KHCN-TB/13-18 Đại học Quốc gia Hà Nội quan chủ trì TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV NXB Y học 2009 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 2001, tr.355 Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 2006, tập 1, tr.884-888  ... khuẩn bột cao khô Hà thủ ô đỏ mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô Hà thủ ô đỏ gồm tiêu yêu cầu sau: - Tính chất: khối bột khơ tơi, màu nâu đỏ, ... 2,19 Hàm lượng THSG mẫu bột cao khô Hà thủ đỏ khoảng từ 11,85 - 12,57 mg/g tính theo bột cao khô kiệt Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn hàm lượng THSG mẫu bột cao khô Hà thủ ô đỏ khơng... Định lượng: hàm lượng THSG bột cao khô hà thủ ô đỏ không nhỏ 8,0 mg/g tính theo bột cao khơ kiệt - Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt mức 4, Phụ lục 13.6 - DĐVN IV KẾT LUẬN Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng