Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá chất lượng của bột cao khô táo mèo với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu này bằng phương pháp phun sấy.
Tạp chí y - dợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵc-2016 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG BỘT CAO KHƠ TÁO MÈO Nguyễn Văn Bạch*; Hồng Việt Dũng*; Trần Văn Quang*; Phan Thị Thu Hằng* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô táo mèo bào chế phương pháp phun sấy Nguyên vật liệu phương pháp: đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu dạng bột cao khơ, từ đưa mức giới hạn chất lượng Kết quả: đánh giá đưa mức giới hạn chất lượng bột cao khô táo mèo số tiêu gồm: tính chất, khối lượng làm khơ, độ mịn, định tính, định lượng, tro toàn phần, kim loại nặng giới hạn nhiễm khuẩn Kết luận: xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho bột cao khô táo mèo * Từ khóa: Táo mèo; Bột cao khơ; Tiêu chuẩn chất lượng Study on Establishing the Quality Standard of Dry Extract of Fructus Docyniae indicae Summary Objectives: To establish the quality standard of dry extract of Fructus Docyniae indicae Material and methods: Determining some quality criteria of dry extract of Fructus Docyniae indicae to create the quality level Results: Determining and creating the quality level of dry extract of Fructus Docyniae indicae with some criteria including: property, loss on drying, identification, quantification, total ash, heavy metal, limit of microbial infection Conclusion: The quality standard of dry extract of Fructus Docyniae indicae was established * Key words: Docynia indica; Dry extract; Quality standard ĐẶT VẤN ĐỀ Táo mèo (Fructus Docyniae indicae) dược liệu dùng phổ biến để điều trị số bệnh như: đầy bụng, khó tiêu, ngủ, béo phì… [2, 3] Hiện nay, chúng tơi nghiên cứu bào chế bột cao khô táo mèo phương pháp phun sấy với mục tiêu làm nguyên liệu đầu vào để bào chế chế phẩm hoàn thiện khác như: viên nang, thuốc bột Đây chế phẩm giúp người bệnh dễ dàng sử dụng Vấn đề kiểm soát, kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu bột cao khơ bào chế quan trọng, định đến chất lượng hiệu tác dụng sản phẩm hồn chỉnh sau Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm: Đánh giá chất lượng bột cao khô táo mèo nhằm mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Việt Dũng (vietdungk85@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 01/09/2016 Ngày báo đăng: 15/09/2016 32 TạP CHí Y - DƯợc học quân số chuyên đề dợc-2016 NGUYấN VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CỨU + Ống 3: Ttêm giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT) Nguyên vật liệu thiết bị - Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4, DĐVN IV): - Nguyên liệu: mẫu bột cao khô táo mèo (ký hiệu lô TM1, lô TM2 lô TM3) lấy từ lô sản xuất khác bào chế tháng 01 - 2016 Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược, Học viện Qn y - Hóa chất, dung mơi: chất chuẩn quercetin (98,0%, Hãng Sigma); acetonitril, axít formic: đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck); ethanol, axít hydrocloric đậm đặc, amoniac đậm đặc: đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (Trung Quốc)… - Thiết bị, dụng cụ: hệ thống HPLC Waters 2695D (Mỹ); bếp cách thủy memmert (Đức); cân phân tích Mettler, độ xác 0,1 mg (Thụy Sỹ)… Phương pháp nghiên cứu * Tính chất: thử cảm quan * Mất khối lượng làm khô: tiến hành thử theo phương pháp xác định khối lượng làm khô, Phụ lục 9.6, DĐVN IV * Độ mịn: tiến hành xác định độ mịn bột theo Phụ lục 3.5, DĐVN IV, lấy 20 g chế phẩm để thử * Định tính: - Phản ứng hóa học (định tính nhóm hợp chất flavonoid): Lấy khoảng 0,5 g bột cao khô, thêm 10 ml ethanol 90%, đun nóng phút, để nguội, lọc Cho vào ống nghiệm - ml dịch lọc làm phản ứng sau: + Ống 1: thêm giọt axít hydrocloric đậm đặc (TT) bột magnesi + Ống 2: thêm giọt dung dịch natri hydroxyd 20% (TT) + Bản mỏng silica gel 60 F254 + Dung môi khai triển: n-Butanol:nước (10:1) + Dung dịch thử: đun nóng g bột cao khô với 10 ml ethanol 70% (TT) phút, lọc Dịch lọc cô đến cắn Phân tán cắn với 10 ml nước, sau lắc với 10 ml ethyl acetat (TT) lần Dịch ethyl acetat bay khoảng ml dùng làm dung dịch thử + Dung dịch đối chiếu: đun hồi lưu g bột táo mèo (mẫu dược liệu chuẩn) với 30 ml ethanol 70% (TT) 10 phút, lọc Dịch lọc cô đến cắn Phân tán cắn với 10 ml nước, sau lắc với 10 ml ethyl acetat (TT) lần Dịch ethyl acetat bay khoảng ml, dùng làm dung dịch đối chiếu - Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch thử dung dịch đối chiếu Sau khai triển, để khơ mỏng ngồi khơng khí nhiệt độ phòng, sau màu amoniac - Đánh giá kết quả: so sánh màu sắc giá trị Rf vết xuất sắc ký đồ dung dịch thử với vết xuất sắc ký đồ dung dịch đối chiếu * Định lượng: phương pháp HPLC (Phụ lục 5.3, DĐVN IV) - Điều kiện sắc ký: cột Sunfire Waters RP-18 (250 x 4,6 mm, µm, 100 A0) cột tương đương; bước sóng 364 nm; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiờm 20 àl; nhit ct: 280C 33 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 Bảng 1: Chương trình gradient pha động Thời gian (phút) Tỷ lệ acetonitril Tỷ lệ axít formic 0,1% (%) (%) 35 65 10 35 65 11 100 20 100 21 35 65 30 35 65 sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu, ghi thời gian lưu diện tích píc quercetin dung dịch - Tính kết quả: hàm lượng quercetin (mg/g) bột cao khô táo mèo khô kiệt tính theo cơng thức: -3 HL (mg/g)= - Chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn: + Chuẩn bị mẫu thử: cân xác 500,0 mg bột cao khơ vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 - 20 ml dung môi methanol, lắc siêu âm 15 phút Sau đó, thêm dung mơi vừa đủ đến vạch Dịch bình định mức lọc qua màng 0,45 µm phân tích dịch lọc với hệ thống HPLC + Chuẩn bị mẫu chuẩn: hòa tan pha lỗng lượng xác chất chuẩn quercetin dung mơi methanol để dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ khoảng 2,0 µg/ml - Cách tiến hành: tiêm dung dịch thử dung dịch chuẩn vào hệ thống Cch x Sth x 25 x 10 x 100 Sch x mc x (100-h) Trong đó: Sth, Sch: diện tích píc quercetin dung dịch thử dung dịch chuẩn (µV*s); Cch: nồng độ dung dịch quercetin chuẩn (µg/ml); mc: khối lượng mẫu thử (g); h: độ ẩm bột cao khơ (%) * Tro tồn phần: tiến hành thử theo phương pháp xác định tro toàn phần, phương pháp (Phụ lục 9.8, DĐVN IV) * Kim loại nặng: lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3, phụ lục 9.4.8, DĐVN IV Dùng 2,0 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu * Giới hạn nhiễm khuẩn: tiến hành thử theo phương pháp thử giới hạn nhiễm khuẩn, phương pháp đĩa thạch (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tính chất Qua quan sát mô tả, đề nghị đưa đặc điểm nhận dạng bột cao khô táo mèo gồm: dạng bột khô tơi, màu nâu hồng, đồng nhất, dễ hút ẩm ngồi khơng khí, có mùi thơm đặc trưng dược liệu, khơng có mùi nấm mốc, vị đắng Mất khối lượng làm khô Bảng 2: Kết xác định tỷ lệ khối lượng làm khô bột cao khô táo mèo Lô TM1 34 Lô TM2 Lô TM3 Mẫu Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) Khối lượng trước sấy (g) Độ ẩm (%) 3,0083 3,02 3,0021 2,59 3,0065 3,08 3,0023 2,98 3,0012 2,46 3,0132 3,37 3,0007 2,74 3,0005 2,61 3,0045 3,32 TạP CHí Y - DƯợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵc-2016 3,0022 2,82 3,0129 2,48 3,0123 3,54 3,0011 2,78 3,0002 2,39 3,0009 3,34 2,9993 2,94 3,0045 2,63 3,0023 3,23 X± SD (%) RSD (%) 2,88 ± 0,11 2,53 ± 0,09 3,31 ± 0,14 3,65 3,50 4,21 Độ ẩm lô bột cao khô táo mèo khoảng 2,53 - 3,31% Dựa kết kiểm nghiệm tham khảo tài liệu DĐVN IV [1], đề nghị đưa mức giới hạn độ ẩm bột cao khô táo mèo không 5,0% Độ mịn Bảng 3: Kết đánh giá độ mịn bột cao khô táo mèo Lô TM1 Mẫu Lô TM2 Khối Tỷ lệ bột Tỷ lệ bột lượng qua rây qua rây bột cân số 350 số 180 (g) (%) (%) Khối lượng bột cân (g) Lô TM3 Khối Tỷ lệ bột Tỷ lệ bột lượng qua rây số qua rây số bột cân 350 (%) 180 (%) (g) Tỷ lệ bột Tỷ lệ bột qua rây qua rây số 350 số 180 (%) (%) 20,13 98,35 37,14 20,21 96,56 33,75 20,19 95,78 34,47 20,02 97,69 34,89 20,13 96,45 35,84 20,03 95,12 36,72 20,16 95,73 36,25 20,09 97,08 36,18 20,08 97,24 37,84 20,05 99,04 37,07 20,04 98,72 34,29 20,15 99,05 34,98 20,09 97,82 35,86 20,17 95,97 35,02 20,26 95,41 35,26 20,14 96,51 38,12 19,98 96,84 37,49 20,14 97,33 36,63 97,52 ± 1,21 36,56 ± 1,31 96,95 ± 1,06 35,43 ± 1,36 96,65 ± 1,50 35,98 ± 1,28 1,24 3,10 1,10 3,84 1,55 3,57 X ± SD (%) RSD (%) Ở mẫu bột cao khô đem thử, tỷ lệ % bột qua rây số 350 > 95% tỷ lệ % bột qua rây số 180 < 40% Kết chứng tỏ bột cao khô táo mèo bột nửa mịn Định tính * Phản ứng hóa học: Bảng 4: Phản ứng hóa học định tính bột cao khơ táo mèo TT Thuốc thử Kết HCl đậm đặc + Mg Xuất màu tím đỏ Dung dịch NaOH 2% Xuất màu vàng đậm Dung dịch FeCl3 5% Xuất màu nâu tím Bột cao khơ táo mèo có chứa nhóm hợp chất flavonoid sử dụng phản ứng bảng để định tính thành phần hóa học bột cao khụ tỏo mốo 35 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 * Sc ký lp mỏng: Sau khai triển sắc ký màu amoniac đậm đặc, mỏng sắc ký mẫu dịch chiết bột cao khô mỏng sắc ký mẫu dược liệu táo mèo chuẩn xuất 02 vết màu vàng xám có giá trị Rf khoảng 0,29 - 0,30 0,72 - 0,73 Như vậy, sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với điều kiện nêu mục để định tính bột cao khơ táo mèo B:W (10/1) A B Hình 1: Ảnh sắc ký lớp mỏng mẫu dịch chiết táo mèo (A) mẫu dịch chiết bột cao khô táo mèo (B) Định lượng Bảng 5: Kết định lượng quercetin bột cao khô táo mèo Lô TM1 Mẫu Khối Diện tích píc lượng bột (µV*s) (mg) Lơ TM2 HL (mg/g) Khối Diện tích lượng píc (µV*s) bột (mg) Lơ TM3 HL (mg/g) Khối lượng Diện tích bột (mg) píc (µV*s) HL (mg/g) 501,1 66578 0,066 504,3 60113 0,059 499,7 650967 0,065 501,7 61608 0,061 502,8 60950 0,060 503,6 69642 0,069 500,3 63450 0,063 501,6 58778 0,058 504,5 70778 0,070 503,2 65844 0,065 503,9 58029 0,057 502,8 68524 0,068 502,6 64754 0,064 504,7 57101 0,056 501,6 67355 0,067 503,9 65936 0,065 501,9 58813 0,058 504,2 70735 X ± SD (%) RSD (%) 0,070 0,064 ± 0,0016 0,058 ± 0,0014 0,068 ± 0,002 2,55 2,43 2,85 Hàm lượng quercetin mẫu bột cao khô táo mèo khoảng 0,058 0,068 mg/g (tính theo bột cao khô kiệt) Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn hàm lượng quercetin mẫu bột cao khô táo mèo không 0,04 mg/g 36 TạP CHí Y - DƯợc học quân số chuyên đề dợc-2016 Tro ton phn Bng 6: Kt xác định tro tồn phần bột cao khơ táo mèo Tro tồn phần Mẫu Lơ TM1 Lơ TM2 Lô TM3 6,65 7,44 7,11 6,71 7,29 6,85 7,02 6,98 6,59 7,23 7,04 6,78 6,73 6,75 7,02 6,82 7,12 6,32 X ± SD (%) RSD (%) 6,86 ± 0,22 7,10 ± 0,24 6,78 ± 0,29 3,24 3,41 4,27 Tỷ lệ tro toàn phần mẫu bột cao khô táo mèo khoảng từ 6,78 7,10% Dựa kết kiểm nghiệm tham khảo tài liệu DĐVN IV, đề nghị đưa mức giới hạn tỷ lệ tro toàn phần bột cao khô táo mèo không 9,0% Kim loại nặng Kết xác định hàm lượng kim loại nặng mẫu bột cao khô táo mèo phương pháp so màu cho thấy màu ống dung dịch thử nhạt màu ống dung dịch đối chiếu có nồng độ chì 20 ppm Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa giới hạn kim loại nặng bột cao khô táo mèo không 20 ppm Giới hạn nhiễm khuẩn Kết xác định tiêu vi sinh vật cho thấy mẫu bột cao khơ táo mèo có giới hạn nhiễm khuẩn đạt mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Cụ thể, tổng số vi khuẩn hiếu khí < 104, tổng số nấm men nấm mốc < 100, tổng số vi khuẩn Enterobacteria < 500, khơng có vi khuẩn điểm vệ sinh E coli, P aeruginosa, S aureus Salmonella Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn nhiễm khuẩn bột cao khô táo mèo mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô táo mèo gồm tiêu u cầu sau: - Tính chất: khối bột khơ tơi, đồng nhất, màu nâu đỏ nhạt, dễ hút ẩm Có mùi thơm đặc trưng dược liệu, khơng có mùi nấm mốc, vị chua, đắng - Mất khối lượng làm khô: không 5% - Độ mịn: bột nửa mịn (355/180) - Định tính: chế phẩm phải thể phép thử định tính dược liệu táo mèo - Định lượng: hàm lượng quercetin bột cao khô táo mèo khơng nhỏ 0,04 mg/g tính theo bột cao khơ kiệt - Tro tồn phần: khơng q 9,0% - Kim loại nặng: không 20 ppm - Giới hạn nhiễm khuẩn: đạt mức 4, Phụ lục 13.6 - DĐVN IV KẾT LUẬN Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bột cao khô táo mèo với số tiêu gồm: tính chất, khối lượng làm khơ, độ mịn, định tính, định lượng, tro tồn phần, kim loại nặng giới hạn 37 T¹p chí y - dợc học quân số chuyên đề d−ỵc-2016 nhiễm khuẩn Tiêu chuẩn áp dụng để kiểm tra đánh giá chất lượng mẫu bột cao khô táo mèo bào chế phương pháp phun sấy Lời cảm ơn Kết nghiên cứu phần nội dung đề tài mã số KHCN-TB.04C/13-18 tài trợ Chương trình “Khoa học Công nghệ phục vụ phát triển bền vững vùng Tây Bắc” mã số KHCN-TB/13-18 38 Đại học Quốc gia Hà Nội quan chủ trì TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV NXB Y học 2009 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học 2001, tr.355 Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 2006, tập 1, tr.884-888 ... giới hạn nhiễm khuẩn bột cao khô táo mèo mức (Phụ lục 13.6, DĐVN IV) Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô táo mèo gồm tiêu yêu cầu sau: - Tính chất: khối bột khơ tơi, đồng... Hàm lượng quercetin mẫu bột cao khô táo mèo khoảng 0,058 0,068 mg/g (tính theo bột cao khô kiệt) Dựa kết kiểm nghiệm, đề nghị đưa mức giới hạn hàm lượng quercetin mẫu bột cao khô táo mèo không... mỏng mẫu dịch chiết táo mèo (A) mẫu dịch chiết bột cao khô táo mèo (B) Định lượng Bảng 5: Kết định lượng quercetin bột cao khô táo mèo Lô TM1 Mẫu Khối Diện tích píc lượng bột (µV*s) (mg) Lơ TM2