Kim thất tai được biết đến như là cây thuốc cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp... Có rất ít nghiên cứu về dược liệu này. Do thiếu những nghiên cứu mà dẫn đến nhầm lẫn trong gọi tên, sử dụng. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm khảo sát vi học và thành phần hóa học kim thất tai để phân biệt với các loài khác, tránh nhầm lẫn trong sử dụng.
KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC VÀ HÓA HỌC CÂY KIM THẤT TAI (Gynura auriculata Cass.) Phạm Thị Hóa∗ TĨM TĂT Mục tiêu: Kim thất tai ñược biết ñến thuốc cổ truyền ñể ñiều trị bệnh tiểu ñường, cao huyết áp….Có nghiên cứu dược liệu Do thiếu nghiên cứu mà dẫn ñến nhầm lẫn gọi tên, sử dụng Vì vậy, nghiên cứu nhằm khảo sát vi học thành phần hóa học Kim thất tai để phân biệt với lồi khác, tránh nhầm lẫn sử dụng Đối tượng phương pháp: Kim thất tai ñược thu thập Mỹ tho Khảo sát đặc điểm vi học kính hiển vi Phân tích thành phần hóa học phản ứng hóa học đặc trưng dựa theo tài liệu Rumani kỹ thuật sắc ký lớp mỏng Nghiên cứu ñộ tinh khiết dược liệu theo DĐVN III Phân lập xác ñịnh cấu trúc chất Kim thất tai Kết quả: Khảo sát ñược ñặc ñiểm vi học, thành phần hóa học Kim thất tai Phân lập ñơn chất xác ñịnh cấu trúc chất KTT3 parahydroxy methyl cinnamat Kết luận: Những kết nghiên cứu cần thiết để chuẩn hóa nguồn nguyên liệu quan trọng cho sản xuất Từ khóa: Gynura auriculata Cass, parahydroxy methyl cinnamat ABSTRACT STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPONENTS OF GYNURA AURICULATA CASS Pham Thi Hoa Backgroun and Aims: Although Kim that tai is known as a traditional medicinal plant to treat diabetes, arterial hypertension but this medicinal herb hasn’t been studied systematically leads to misuse with another medicinal herbs The aim of this research to study of microscopic properties and chemical components of Kim that tai in order to discriminate this medinal hern from another species Patients and method: Kim that tai was collected at My Tho province The chemical component was identified by means of chemical reaction and chromatography Results: The microscopic properties and chemical components of Kim that tai were determined in which four isolated subtances were determined with chemical structure is parahydroxy methyl cinnamat Conclusion: These results are necessary to standardize the source of this production Key words: Gynura auriculata Cass., parahydroxy methyl cinnamat ĐẶT VẤN ĐỀ: Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.) thuốc ñược dân gian sử dụng ñể chữa nhiều bệnh tiểu ñường, tăng huyết áp, viêm xoang…Đây thuốc nghiên cứu, từ năm 2000 ñến Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược Tp HCM ñã sơ khảo sát tác dụng dược lý thực nghiệm lâm sàng cao nước 1/1, trà viên nang cho thấy thực nghiệm Kim thất tai có tác dụng lợi tiểu chuột nhắt, giảm trị số huyết áp mèo Trên lâm sàng Kim thất tai làm giảm huyết áp bệnh nhân có số huyết áp > 140/90 mmHg [3], [5], [8] Kim thất tai thuốc dễ trồng, thường trồng rộng rãi ñể làm thuốc chữa bệnh, ∗ Khoa Y học cổ truyền- Đại học Y Dược Tp HCM Địa liên hệ :ThS Phạm Thị Hóa Điện thoại: 01268108097 Email: pthihoa48@yahoo.com.vn 166 nhiên có nhiều chi Gynura ñã ñược nghiên cứu sử dụng làm thuốc có tên Kim thất [4], nên khơng thể tránh khỏi nhầm lẫn thu mua, thu hái sử dụng Vì vậy, đề tài “Khảo sát thực vật học hóa học Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.)” đặt nhằm mục đích tránh nhầm lẫn hoàn chỉnh dần nghiên cứu Kim thất tai góp phần làm phong phú thêm nguồn dược liệu nước nhà ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu non khô Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.) trồng Mỹ tho Thu hái sau trồng tháng Phương tiện Bộ dụng cụ khảo sát thực vật học Bộ dụng cụ khảo sát hóa học Hóa chất khảo sát thực vật học Hóa chất khảo sát hóa học Các loại Silica gel Merck - Silica gel F 254 tráng sẵn nhôm (1.05554) - Silica gel SKC 15-40 µm (1.15111) 40-63 µm (1.09385) Dung môi dùng cho sắc ký: Chloroform, Methanol, Ethyl acetat, n - Buthanol (Merck) Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp khảo sát thực vật học Mô tả ñặc ñiểm thực vật học (lá, thân, hoa, phận phụ) dựa quan sát tươi Tiến hành làm vi phẫu lá, thân, phân tích hoa [7], [9], [10] Phương pháp khảo sát hóa học Thử tinh khiết: Theo Dược ñiển Việt Nam III [1] Xác ñịnh ñộ ẩm, ñộ tro Định lượng chất chiết dược liệu Xác ñịnh hàm lượng ion K+, Na+, Cl-, NO3- Phân tích sơ thành phần hóa thực vật Áp dụng phương pháp phân tích sơ thành phần hóa thực vật theo quy trình cải tiến dựa quy trình trường Đại học Rumani có cải tiến, sau tiến hành xác định nhóm hợp chất lớn phản ứng ñặc hiệu Phân lập hợp chất, tìm chất điểm Từ phân ñoạn phân lập hợp chất tinh khiết, kiểm tra ñịnh tính sắc ký lớp mỏng, ño phổ UV, IR, NMR, điểm chảy, sở xác định cấu trúc phân tử KẾT QUẢ Khảo sát thực vật học Kim Thất Tai loại thảo cao từ 0,5 -1 m có hơn, mọc đứng, mọc bò leo dựa Thân gốc tròn, lên phía có góc cạnh, thân non có lơng, thân có màu tía Lá đơn, mọc cách, dầy, mập nước, đỉnh nhọn, hẹp dần phía cuống Mép có cưa nơng thường rộng từ -5 cm (7 -9 cm), dài - 10 cm (15 -16 cm) Gân rõ, gân có có màu tía tùy theo mơi trường sống, gân phụ - cặp Hai mặt có lơng, cuống dài –-3 cm Đáy cuống có tai cao khoảng mm dạng bẹ hình nhỏ, đơi khơng có Cụm hoa dạng ngù kép, dài khoảng 20 cm, có nhiều nhánh, nhánh mang - hoa hình đầu Lá bắc vòng, bắc ngồi dạng nhỏ dài – cm, có khoảng - 10 màu tía, bắc dính thành tổng bao cao 1,2 - 1,5 cm, có sọc tía, chia thành nhiều nhỏ màu tía Hoa đầu, màu vàng cam Vi phẫu Gân giữa: Biểu bì gồm lớp tế bào xếp ñều ñặn mang lơng che chở đa bào 167 dãy khoảng từ –7 tế bào Mô dày xếp sát biểu bì, tế bào màng dày góc Mơ mềm gồm tế bào màng mỏng Bó libe – gỗ chồng kép , bó to gân lá, bó nhỏ xếp thành hình vòng cung Phiến lá: Biểu bì mang lơng che chở đa bào dãy, biểu bì có nhiều khí khổng kiểu hỗn bào Mơ mềm dậu gồm lớp tế bào hình chữ nhật xếp xít đặn Mơ mềm khuyết nằm mơ mềm dậu Vi phẫu thân Biểu bì có lớp tế bào mang lơng che chở đa bào dãy Vòng mơ dày xếp sát biểu bì gồm – lớp tế bào màng dày góc Mơ mềm vỏ tế bào màng mỏng Vòng mơ cứng xếp vòng quanh ứng với bó libe – gỗ, tế bào mơ cứng hình nhiều cạnh màng dày Mơ mềm tủy tế bào tròn to, màng mỏng Phân tích hoa Hoa đầu, lưỡng tính, tất ñều giống dài 1,5 - 1,7 cm Tràng hoa hình ống mảnh khảnh, phình đỉnh ống phía chia thành nhỏ màu ñỏ cam Năm nhị dính tạo thành ống bao quanh vòi nhụy, bao phấn hướng trong, có đỉnh tù nhọn, đính gốc, nhị phình đính vào ống tràng Hạt phấn hình bầu dục, màu vàng, có gai nhỏ Nhụy hình dùi trống, vòi nhụy chia làm hai nhánh có gai nạc 1/3 trên, ló khỏi ống tràng Đĩa mật hình khoen nằm cuối nhụy bầu Phía bầu hạ Lá đài tiêu biến thành lơng tơ mịn màu trắng vòng quanh đỉnh bầu, mịn, mềm dài khoảng cm Quả bế, hình trụ, có gân sọc có lơng Đế hoa lỗ chỗ dạng tổ ong Khảo sát hóa học Thử tinh khiết Theo Dược ñiển Việt Nam III (1) Độ ẩm dược liệu 9,63% Tro toàn phần 20.25% Tro không tan acid hydrocloric 2,36% Định lượng chất chiết dược liệu phương pháp chiết nóng 31,63% Định lượng muối dịch chiết nóng cồn 40% Dùng 50g dược liệu chiết nóng cồn 40% (200mlx3lần) Gộp, bốc 100 ml Định lượng hàm lượng ion K+, Na+, Cl-, NO3- (g/kg) là: K+ 29,4; Na+ 7,58; Cl- 31,78; NO3- 12,1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật theo phương pháp Rumani cải tiến nhận thấy có diện carotenoid, triterpenoid, saponin, tanin, chất khử, polyuronic Định tính xác định nhóm hợp chất lớn Định tính saponin: - Thử tính tạo bọt: bọt bền > 60 phút - Chỉ số bọt: < 100 - Thử nghiệm tính phá huyết: khơng có Phân lập hợp chất, tìm chất ñiểm Sơ ñồ chiết tách: 168 Dược liệu Cồn 40%, ñun cách thủy Dịch cồn Than hoạt 1%.Lọc Dịch lọc Thu hồi dung mơi Cắn Hòa nước cất Dịch nước Ether petrol Cắn E Ethyl acetat Cắn Et n – Buthanol Cắn B Nước Cắn nước Sơ ñồ 1: Chiết xuất dược liệu khảo sát hóa học Các phân ñoạn (cắn E, cắn Et, cắn B) ñược phân lập sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel (Merck) Theo dõi cột ánh sáng thường, sắc ký lớp mỏng, phát vết ñèn UV sau phun thuốc thử Vanilin sulfuric Gộp phân đoạn có sắc đồ tương tự nhau, thu hồi dung mơi tìm chất điểm phân ñoạn Khảo sát cắn E Phân lập hợp chất từ cắn E Nguyên tắc: sắc ký hấp phụ cột cổ ñiển Chất hấp phụ: 60 g silica gel 60 (40 – 63 µm) Dung mơi khai triển : benzen – ethyl acetat (9:1) → (8:2) Thể tích ống hứng : 10 ml Mẫu: cắn E (2 g); Thuốc thử màu: Vanilin sulfuric Kết quả: Thu ñược phân ñoạn ñánh số E1 – E9 Phân ñoạn E3 kết tinh tinh thể (KTT1) methanol trọng lượng 24,1mg Các phân ñoạn E2, E4, E5 ñều có kết tinh khơng đáng kể Khảo sát chất KTT1: Dùng mỏng silica gel 60 F254 chạy sắc ký với hệ dung môi sau: -Benzen – EtOAc (8:2) -Benzen – EtOAc – Acid formic (75:24:1) Nhận xét: Với ñiều kiện sắc ký KTT1 tương đối tinh khiết, chúng tơi tiến hành đo ñiểm chảy, UV, IR Nhiệt ñộ nóng chảy KTT1 khoảng 114,5 0C Không hấp thu xạ UV, chứng tỏ khơng có dây nối đơi Phổ IR có bước sóng hấp thu 3423,4; 2937,4; 2868,0; 2850,6; 1637,5 cm-1 Khảo sát cắn Et • Cột nhanh lần I Sử dụng sắc ký hấp phụ với cột nhanh Chất nhồi cột: 120 g silica gel (15 – 40 µm) Mẫu: cắn Et trọng lượng 10 g Dung môi khai triển CHCl3 – MeOH với tỉ lệ MeOH thay ñổi từ 2% - 10% Thể tích ống hứng 100 ml; thuốc thử màu: Vanilin sulfuric Thu ñược phân đoạn, phân đoạn kết tinh methanol thu ñược tinh thể KTT2 169 khối lượng 12,7 mg Tiến hành ño phổ UV IR KTT2 - Nhiệt độ nóng chảy KTT2 khoảng 2240C - Không hấp thu xạ UV → dây nối đơi cơng thức phân tử - Phổ IR có bước sóng hấp thu 3386,8; 2931,6; 2868; 2850,6cm-1 • Cột nhanh lần II: Sử dụng sắc ký hấp phụ với cột nhanh Chất hấp phụ : 120 g Silica gel (15 - 40µm) Mẫu: cắn Et trọng lượng 10g Dung mơi khai triển EtOAc Thể tích hứng 100ml Thuốc thử màu: Vanilin sulfuric Kết quả: Thu ñược phân ñoạn sau (khối lượng cắn): Et1: (1,30 g) Et3: (0,70 g) Et5: (1,20 g) Et2: (0,79 g) Et4: (1,20 g) Et6: (0,72 g) Khảo sát phân ñoạn Et3: Phân ñoạn Et3 khai triển cột cổ ñiển chứa 40 g Silica gel 60 (40 – 63 µm) Mẫu 0,7 g Et3 Dung môi khai triển EtOAc; Thể tích ống hứng 10 ml Theo dõi sắc ký lớp mỏng hệ EtOAc – MeOH (9 : 1) Kết quả: thu ñược phân ñoạn ñánh số Et3.1 – Et3.3, phân đoạn Et3.1 có kết tinh MeOH khơng đáng kể Khảo sát phân ñoạn Et4 Phân ñoạn Et4 ñược khai triển sắc ký cột Chất hấp phụ: 80 g Silica gel 60 (40 – 63 µm) Mẫu 1,2 g cắn phân đoạn Et4 Dung mơi khai triển EtOAc; thể tích ống hứng: 10 ml Theo dõi sắc ký lớp mỏng hệ EtOAc – MeOH (9:1) Kết quả: thu ñược phân ñoạn ñánh số Et41 – Et44 , phân đoạn Et43 có kết tinh (KTT4) acetonitril, khối lượng 24 mg, tinh thể màu vàng Tiến hành ño phổ UV , IR , ñiểm chảy, làm số phản ứng định tính flavonoid Điểm chảy KTT4 khoảng 1620C Cho phản ứng vòng γ - pyron Phổ UV có cực đại hấp thu bước sóng 360,50; 267,50; 230,50nm Phổ IR có bước sóng hấp thu 3263,3; 2893; 2221,8; 1654,8; 1581,8cm-1 Khảo sát cắn B Dùng 50 g cắn B hoà 1250 ml MeOH, thêm 1250 ml HCl 2N, thủy phân bình cầu, sau thủy phân lắc với Benzen thu ñược 7,9 g cắn (C) Khảo sát cắn C: Cắn C ñược triển khai cột cổ ñiển Chất hấp phụ 250 g Silica gel 60 (40 – 63 µm) Mẫu 7,9 g (C) Hệ dung mơi khai triển CHCl3 ; thể tích ống hứng 20 ml Thu ñược phân ñoạn ñánh số từ C1 – C8 Khảo sát phân ñoạn C5 Phân ñoạn C5 lại ñược triển khai cột cổ ñiển: Chất hấp phụ: 50 g Silica gel 60 (15 – 40 µm); mẫu g (C5) 170 Hệ dung môi Benzen, Benzen – EtOAc (9:1) Thể tích ống hứng 10ml Thu ñược phân ñoạn ñánh số C51 – C54 Khảo sát KTT3 Ở phân đoạn C51 có kết tinh acetonitril chất KTT3 với khối lượng 64mg Điểm chảy KTT3 khoảng 1200C Phổ UV có cực ñại hấp thu sau: 310,10; 308,30; 299,20; 226,30; 214,20; 212,30nm Phổ IR có bước sóng hấp thu 3377,1; 2952,8; 2133,1; 1897,8cm-1 Phổ NMR, MS sau H.1: Phổ 1H-NMR KTT3 H.2: Phổ 13C-NMR KTT3 171 H.3: Phổ MS KTT3 Xác ñịnh cấu trúc hợp chất KTT-3 Trên khối phổ, phân mảnh KTT-3 cho thấy mảnh ion phân tử [M+] = 178 Sơ bộ, số khối phù hợp với công thức C10H10O3 = (120 + 10 + 48) = 178 Phổ khối KTT-3 cho mảnh - m/z 160 (= 178 – 18) cho thấy có mặt nhóm –OH cấu trúc - m/z 147 (=178 – 31) cho thấy có mặt nhóm –OMe cấu trúc - m/z 119 (= 178 – 31 – 28) cho thấy có mặt nhóm –COOMe cấu trúc Trên phổ 13C-NMR (kỹ thuật giải ghép băng rộng, DEPT) phổ 1H-NMR cho thấy lại - tín hiệu –OMe (δC 50,5 ppm δH 3,77 ppm; s, 3H) - tín hiệu carbon thơm =C< (δC 127,2ppm) - tín hiệu carbon thơm (là C IV khơng cho tín hiệu DEPT) δC 169,7 ppm dấu hiệu carbon ester (-COOR) - tín hiệu mảnh –CH = CH– (δC 146,5 114,9 ppm); proton olefinic ñược ghi nhận có δH 7,62 6,33 ppm (đều d, J = 16 Hz) dấu hiệu proton ghép đơi vị trí trans - tín hiệu carbon thơm (δC 161,2 ppm) dấu hiệu carbon thơm gắn với nhóm giảm chắn (=C(OH)-) - tín hiệu carbon thơm δC 131,1 116,8 ppm (đều =CH-); tín hiệu cao bất thường cho thấy ñây cặp (= carbon thơm) ñối xứng Điều phù hợp với cấu trúc dự kiến KTT3 KTT3 có 10 Carbon có tín hiệu tương đương phổ 13CNMR (2 carbon thơm có δC 131,1 ppm carbon thơm có δC 116,8 ppm) Cấu trúc KTT3 là: 172 H3 H7 H2 O CH3 10 HO O H5 H8 COOMe = HO 10 H6 Đây parahydroxy methyl cinnamat Tuy ñây hợp chất thơm ñơn giản, theo ghi nhận chúng tơi, lần ñầu tiên hợp chất parahydroxy methyl cinnamat ñược phân lập từ loài Gynura auriculata Cass KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu, ñề tài ñã ñạt ñược kết sau: Khảo sát thực vật Kim thất tai Gynura auriculata Cass Khảo sát hóa học Kim thất tai mặt sau: Sơ phân tích thành phần hóa thực vật, kết luận Kim thất tai có carotenoid, triterpenoid, saponin, tannin, chất khử, polyuronic - Thử tinh khiết: độ ẩm 9,63%, tro tồn phần 20,25%, tro khơng tan acid hydrochloric 2,36%, định lượng chất chiết ñược dược liệu 31,53% - Xác ñịnh hàm lượng muối (g/kg) cồn 40%: K+ 29,4; Na+ 7,58; Cl- 31,78; NO3- 12,16 - Phân lập ñược ñơn chất là: KTT1, KTT2, KTT3, KTT4 KTT3 parahydroxy methyl cinnamat TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2002), Dược ñiển Việt Nam III , NXB Y học Cemi,Silvija; Rusak, Gordana; Curkovic Perica, Mirna; Skoric, Dijana (2005), Gynura aurantiaca (Blume) DC as a model for in vitro maintanance of Citrus exocortis viroid, European Journal of Cell Biology, (0171 – 9335), pp 55; 90 Đào Thị Ánh Tuyết (2004), Thăm dò tác dụng hạ áp trà KTT lâm sàng Luận văn tốt nghiệp BS CK cấp I YHCT, tr 65 Đỗ Tất Lợi(1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 11, 558, 657, 913 Mã Mỹ Sang (2005), Nghiên cứu tác dụng hạ áp lâm sàng viên nang Kim thất tai Gynura auriculata Cass Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp I YHCT, tr 65 Nguyễn Sơn Nam, Phạm Thanh Kỳ, Vũ Hà (2001), Kết nghiên cứu số tác dụng sinh học Kim thất (Gynura procumbens) – Tạp chí dược học, số 12, tr 18 – 20 Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp kính hiển vi tập I, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 21 Phạm Thị Hóa, Nguyễn Việt Hương, Trịnh Hồng Lĩnh (2001), Thăm dò tác dụng lợi tiểu hạ huyết áp Kim thất tai Gynura auriculata Cass., Chuyên san Y học cổ truyền, tr 11 – 13 Trương Thị Đẹp(2002), Bài giảng phân loại thực vật (Tài liệu dành cho học viên cao học Khoa Dược) 10 Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang (2003), Bài giảng phân loại thực vật (Tài liệu dành cho sinh viên Khoa Dược), tr.160 – 163, 167 – 169 173 ... Thu hái sau trồng tháng Phương tiện Bộ dụng cụ khảo sát thực vật học Bộ dụng cụ khảo sát hóa học Hóa chất khảo sát thực vật học Hóa chất khảo sát hóa học Các loại Silica gel Merck - Silica gel F... lập từ loài Gynura auriculata Cass KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu, ñề tài ñã ñạt ñược kết sau: Khảo sát thực vật Kim thất tai Gynura auriculata Cass Khảo sát hóa học Kim thất tai mặt sau: Sơ... nghiên cứu sử dụng làm thuốc có tên Kim thất [4], nên tránh khỏi nhầm lẫn thu mua, thu hái sử dụng Vì vậy, đề tài Khảo sát thực vật học hóa học Kim thất tai (Gynura auriculata Cass.)” ñược đặt nhằm