Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện và mô tả các đột biến gen BTK trên bệnh nhân trẻ em Việt Nam bị XLA. Nghiên cứu tiến hành phân tích đột biến gen BTK từ RNA trong máu ngoại vi của 22 bệnh nhân. Toàn bộ vùng mã hóa protein của gen BTK được khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học ĐỘT BIẾN GEN BTK TRÊN BỆNH NHÂN THIẾU GAMMAGLOBULIN MÁU LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ X Hồng Anh Vũ*, Phan Thị Xinh**, Nguyễn Hồng Mai Anh***, Hồng Lê Phúc*** TĨM TẮT Giới thiệu: Thiếu gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X (X‐linked agammaglobulinemia (XLA) là một dạng suy giảm miễn dịch tiên phát mà chẩn đốn lâm sàng thường phải phân biệt với nhiều dạng rối loạn miễn dịch khác. Đột biến gen BTK là ngun nhân gây bệnh trong phần lớn các trường hợp và được xem như một dấu ấn sinh học quan trọng giúp hỗ trợ chẩn đốn cũng như tư vấn di truyền. Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện và mơ tả các đột biến gen BTK trên bệnh nhân trẻ em Việt Nam bị XLA. Đối tượng và phương pháp: Chúng tơi tiến hành phân tích đột biến gen BTK từ RNA trong máu ngoại vi của 22 bệnh nhân. Tồn bộ vùng mã hóa protein của gen BTK được khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA. Kết quả: Có 13 bệnh nhân mang đột biến gen BTK được phát hiện (59%), gồm 8 đột biến mất đoạn, 4 đột biến điểm và 1 đột biến chèn đoạn. Các đột biến khơng tập trung mà phân bố rải rác trên khắp chiều dài gen BTK từ exon 2 – 19. Kết luận: Phổ đột biến gen BTK trên bệnh nhân Việt Nam rất đa dạng, cần được khảo sát tồn bộ các vùng của gen này cho trường hợp muốn xác định chẩn đốn XLA. Từ khóa: Thiếu gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X, đột biến gen BTK, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT BTK MUTATIONS IN PATIENTS WITH X‐LINKED AGAMMAGLOBULINEMIA Hoang Anh Vu, Phan Thi Xinh, Nguyen Hoang Mai Anh, Hoang Le Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 195 ‐ 199 Introduction: X‐linked agammaglobulinemia is a primary immunodeficiency disease that clinically overlaps with other immune disorders. Mutations in the gene for Bruton’s tyrosine kinase (BTK) are responsible for the majority of agammaglobulinemia cases and the analysis of BTK is important for an accurate diagnosis and genetic counseling. Objective: This study aims to establish a testing procedure for identification of BTK mutations from blood‐ derived RNA as well as to describe BTK mutation spectrum in pediatric Vietnamese patients with XLA. Patients and methods: We have analyzed BTK mutations in RNA extracted from blood of 22 patients with XLA. All the coding region of BTK were amplified and sequenced. Results: We found BTK mutations in 13 patients (59%), including 8 deletions, 4 point mutations and 1 insertion. Mutations are distributed throughout the whole gene, from exon 2 to exon 19. Conclusion: Spectrum of the BTK gene mutation in Vietnamese patients is complex, therefore sequence analysis of the whole gene are needed for an accurate diagnosis of XLA. Keywords: X‐linked agammaglobulinemia, BTK gene mutation, DNA sequencing. *Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM **Bộ mơn Huyết học, Đại học Y Dược TPHCM ***Bệnh viện Nhi Đồng I – TPHCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Hồng Anh Vũ Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học ĐT: 0122‐2993537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com 195 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Thiếu gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X (X‐linked agammaglobulinemia: XLA) là một tình trạng khiếm khuyết miễn dịch di truyền, gây ra do đột biến gen BTK dẫn đến mất trưởng thành của tế bào lymphơ B tuần hồn trong máu(12,14,16). Bệnh nhân XLA gần như khơng có tương bào nên khơng tạo được immunoglobulin, với một cơ địa rất dễ nhiễm vi trùng và virus. Về mặt lâm sàng, chẩn đốn XLA trùng lắp với các bệnh cảnh nhiễm trùng tái phát trên cơ địa suy giảm miễn dịch khác. Kể từ khi được mô tả lần đầu tiên bởi Bruton vào năm 1952, tỷ lệ bệnh XLA mới được chẩn đốn ngày càng tăng và có xu hướng phát hiện ở tuổi sớm hơn. Việc phát hiện sớm được thực hiện một phần nhờ phân tích đột biến gen BTK, từ đó có thể chỉ định sớm liệu pháp immunoglobulin tĩnh mạch, giúp cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân, giảm số đợt nhiễm trùng và số lần nhập viện(4). Chúng tơi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu xác lập quy trình chẩn đốn đột biến gen BTK từ RNA của bệnh nhân XLA đồng thời mô tả được các đột biến xuất hiện trên bệnh nhân Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Gồm 22 bệnh nhân nam (từ 2 tháng đến 5 tuổi) tại Bệnh viện Nhi Đồng I – Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng 10/2010 đến tháng 11/2011. Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng XLA dựa trên sự biến mất hoặc giảm nặng tế bào B trong máu kèm theo bệnh sử nhiễm trùng tái phát hoặc nhiễm trùng nặng, và/hoặc giảm đồng loạt các thành phần globulin IgG, IgM và IgA trong máu (sau khi so sánh theo tháng tuổi)(5). Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA Từ mỗi bệnh nhi, chúng tôi thu nhận 4 mL máu ngoại vi được chống đơng trong EDTA có bổ sung puromycin (200 μg/mL) và lắc nhẹ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Chúng tơi sử dụng RNA 196 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) để tách chiết RNA từ máu ngoại biên, đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. Từ 1 μg RNA chúng tôi tiến hành tổng hợp DNA bổ sung (complement DNA hay cDNA) với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của gen beta‐actin dài 1180 bp. Thực hiện PCR Từ cDNA, vùng mã hóa của gen BTK được khuếch đại bằng 2 cặp mồi. Đoạn đầu chứa các exon 2 ‐ 11 (1023 bp) được khuếch đại bằng mồi xuôi BTK‐F1 (5’ – GTGAACTCCAGAAAGAAGAAGCT – 3’) và mồi ngược BTK‐R2 (5’ – AATGACGTATCACCCCTTGAGG – 3’); đoạn sau chứa các exon 12 – 19 (1046 bp) được khuếch đại bằng mồi xuôi BTK‐F3 (5’ – GTTTGCTAAATCCACAGGGGAC – 3’) và mồi ngược BTK‐R4 (5’ – ACCAAGAAGCTTATTGGCGAGC – 3’). Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xi và ngược (0,5 μM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara Bio, Nhật Bản) và cDNA (25 ng). Phản ứng khuếch đại được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), với giai đoạn biến tính ban đầu 980C trong 2 phút, theo sau bởi 40 chu kỳ luân nhiệt (980C trong 10 giây, 600C trong 15 giây, 720C trong 70 giây) và kết thúc phản ứng ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản). Những trường hợp chỉ có một băng đặc hiệu thì sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch trực tiếp bằng QIAquick Gel Extraction kit. Trường hợp có băng phụ xuất hiện, các băng chính và băng phụ sẽ được cắt riêng dưới màn soi gel của Pringraph – Atto và được tinh sạch riêng biệt. Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 (Applied Biosystems, Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape, dựa trên trình tự tham chiếu cDNA bình thường của BTK với accession number NM_00061 trong GenBank. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng kỹ thuật giải trình tự RNA của gen BTK Nghiên cứu Y học đó exon 2 – 19 mã hóa protein(13). Kỹ thuật phân tích đột biến trên RNA tập trung vào các exon, để phát hiện các đột biến thuộc vùng mã hóa protein của gen. Chúng tơi đã khuếch đại thành cơng vùng mã hóa protein của gen BTK bằng 2 phản ứng PCR, với sản phẩm tương ứng là 1023 bp và 1046 bp, giúp đơn giản q trình phân tích đột biến gen (Hình 1A). Trước khi tách chiết RNA, mẫu máu đã được trộn ủ với puromycin nhằm ngăn chặn sự thối hóa các RNA đột biến trong tế bào(1). Các sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch đã được tiến hành giải trình tự chuỗi DNA để xác định thay đổi trên exon của gen BTK. Tồn bộ các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết quả đặc hiệu với các vùng gen BTK đã được khuếch đại. Gen BTK nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X, chiếm chiều dài hơn 37 kb, gồm 19 exon trong Phát hiện đột biến gen BTK trên bệnh nhân XLA. Trong thời gian từ tháng 10/ 2010 đến tháng 11/2011, chúng tôi tiến hành phân tích đột biến gen BTK cho 22 mẫu máu bệnh nhân XLA được chẩn đốn trong độ tuổi từ 2 tháng đến 5 tuổi. Chúng tôi phát hiện 13 bệnh nhân (59%) có Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học mang đột biến của gen BTK, gồm 8 đột biến mất đoạn, 4 đột biến điểm và 1 đột biến chèn đoạn (Bảng 1). Các đột biến mất đoạn gen BTK đã được nhiều tác giả mơ tả trong bệnh XLA(7,9,15). Những đột biến này khơng có tính khu trú vào một vùng nào nhất định, nhưng xảy ra trên khắp 197 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học chiều dài của gen BTK, từ exon 2 đến exon 19. Đây là những đột biến làm mất đi nhiều vùng chức năng quan trọng của BTK như vùng pleckstrin homology (PH) , vùng Src homology 3 (SH3), SH2 và SH1. Hình 1B minh họa trường hợp mất đoạn exon 7 – 15 trên một bệnh nhân 10 tháng tuổi. Các đột biến mất đoạn RNA của gen BTK có thể là hậu quả của các đột biến điểm trên Bảng 1: Các trường hợp bệnh nhân có đột biến gen BTK STT Tuổi tuổi 2 tuổi 10 tháng tuổi tuổi tuổi tuổi tuổi tuổi 10 tuổi 11 tuổi 12 tháng 13 10 tháng Giới tính Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Thay đổi nucleotide c.1855C>A c.1059_1758del c.574_1445del c.1093-1531_del Ins30 c.1205 T>C c.91C>T c.393_1124del c.124_842del c.92_768del c.1921C>T c.110_563del c.1066_1703del Thay đổi amino acid Pro619Thr Mất đoạn Mất đoạn Mất đoạn Chèn đoạn Leu402Pro Leu31Phe Mất đoạn Mất đoạn Mất đoạn Arg641Cys Mất đoạn Mất đoạn Trong số 4 đột biến điểm được chúng tôi phát hiện, các đột biến Leu402Pro, Pro619Thr và Arg641Cys đã được báo cáo trong bệnh XLA(8,9,11) và được tổng hợp trong Resource of Asian Primary Immunodeficiency Diseases. Tại codon 31, đột biến thay thế leucine bằng proline (Leu31Pro) cũng đã từng được báo cáo trước đây(3), nhưng đột biến thay thế leucine bằng phenylalanine (Leu31Phe) trong nghiên cứu này là một đột biến mới được phát hiện. Vị trí leucine 31 thuộc vùng PH của BTK, được biết có khả năng tương tác với protein phosphatidylinositol(3,4,5)‐triphosphate (PIP3) trong q trình hoạt hóa BTK(10). Đột biến Leu31Phe có thể đã ảnh hưởng lên sự tương tác với PIP3 và làm giảm hoạt động chức năng của BTK trong tế bào B của bệnh nhân XLA. Đột biến chèn 30 nucleotide của intron 5 vào giữa exon 5 – 6 tạo nên một protein mới gồm 669 amino acid so với protein BTK chỉ có 659 amino acid. Do hiện tượng chèn đoạn làm lệch khung đọc nên protein mới chỉ còn lại 130 amino acid đầu tiên thuộc vùng chức năng PH giống với 198 intron trong genomic DNA, làm thay đổi những điểm quan trọng cho hiện tượng nối ghép exon diễn ra khi có sự phiên mã của gen(2,6). Chúng tơi đang tiếp tục tiến hành thêm việc phân tích đột biến ở mức genomic DNA để có thể xác định chính xác hơn cơ chế gây đột biến trên những bệnh nhân có biểu hiện mất đoạn RNA. Vùng exon – intron bị đột biến Exon Exon 12 – 18 Exon – 15 Exon 12 – 15 Intron Exon 14 Exon Exon – 13 Exon – 10 Exon – Exon 19 Exon – Exon 12 – 17 protein BTK, trong khi đó các vùng chức năng SH 1 – 3 đã bị thay thế bằng chuỗi polypeptide lạ. Sự biến mất các vùng SH 1 – 3 có thể đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng của BTK trong tế bào B dẫn đến biểu hiện bệnh. Chúng tơi khơng phát hiện được đột biến gen BTK trên 9 bệnh nhân trong nghiên cứu này. Một trong những hạn chế khi phân tích đột biến ở mức RNA là không khảo sát vùng promoter của gen BTK, có thể đã bỏ sót các đột biến làm giảm khả năng phiên mã và ảnh hưởng trên sự giải mã protein BTK. Các bệnh nhân này cần được giải trình tự genomic DNA, bao gồm cả vùng promoter để có thể phát hiện thêm các đột biến giúp xác định chẩn đốn bệnh XLA. KẾT LUẬN Sử dụng kỹ thuật phân tích đột biến ở mức RNA, chúng tơi đã phát hiện 59% bệnh nhân XLA có đột biến gen BTK. Vì các đột biến xuất hiện trên tồn bộ các vùng chức năng quan trọng của gen này, nên cần phân tích tất cả các exon khi muốn xác định đột biến để hỗ trợ chẩn đốn chính xác bệnh XLA. Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học and its carrier identified by flow cytometric assessment combined with genetic analysis. J Allergy Clin Immunol 2001;108:1012‐20. Lindvall JM, Blomberg KE, Väliaho J, Vargas L, Heinonen JE, Berglöf A, Mohamed AJ, Nore BF, Vihinen M, Smith CI. Brutonʹs tyrosine kinase: cell biology, sequence conservation, mutation spectrum, siRNA modifications, and expression profiling. Immunological Reviews 2005;203:200‐215. López‐Granados E, Pérez de Diego R, Ferreira Cerdán A, Fontán Casariego G, García Rodríguez MC. A genotype‐ phenotype correlation study in a group of 54 patients with X‐ linked agammaglobulinemia. J Allergy Clin Immunol 2005;116(3):690‐7. Ochs HD, Smith CI. X‐linked agammaglobulinemia. A clinical and molecular analysis. Medicine 1996;75:287‐299. Rohrer J, Parolini O, Belmont JW, Conley ME, Parolino O. The genomic structure of human BTK, the defective gene in X‐ linked agammaglobulinemia. Immunogenetics 1994; 40:319– 324. Sideras P, Smith CI. Molecular and cellular aspects of X‐linked agammaglobulinemia. Adv Immunol 1995;59:135‐223. Speletas M, Kanariou M, Kanakoudi‐Tsakalidou F, Papadopoulou‐Alataki E, Arvanitidis K, Pardali E, Constantopoulos A, Kartalis G, Vihinen M, Sideras P, Ritis K. Analysis of Btk mutations in patients with X‐linked agammaglobulinaemia (XLA) and determination of carrier status in normal female relatives: a nationwide study of Btk deficiency in Greece. Scand. J. Immunol 2001;54: 321‐327. Vetrie D, Vorechovský I, Sideras P, Holland J, Davies A, Flinter F, Hammarström L, Kinnon C, Levinsky R, Bobrow M. The gene involved in X‐linked agammaglobulinaemia is a member of the src family of protein‐tyrosine kinases. Nature 1993;361:226–233. Winkelstein JA, Marino MC, Lederman HM, Jones SM, Sullivan K, Burks AW, Conley ME, Cunningham‐Rundles C, Ochs HD. X‐linked agammaglobulinemia: report on a United States registry of 201 patients. Medicine (Baltimore) 2006;85:193‐202. TÀI LIỆU THAM KHẢO Andreutti‐Zaugg C, Scott RJ, Iggo R. Inhibition of nonsense‐ mediated messenger RNA decay in clinical samples facilitates detection of human MSH2 mutations with an in vivo fusion protein assay and conventional techniques. Cancer Res 1997;57(15):3288‐93. Brooimans RA, van den Berg AJ, Rijkers GT, Sanders LA, van Amstel JK, Tilanus MG, Grubben MJ, Zegers BJ. Identification of novel Brutonʹs tyrosine kinase mutations in 10 unrelated subjects with X linked agammaglobulinaemia. J of Med Genet 1997;34:484‐488. Conley ME, Broides A, Hernandez‐Trujillo V, Howard V, Kanegane H, Miyawaki T, Shurtleff SA. Genetic analysis of patients with defects in early B‐cell development. Immunol Rev 2005;203:216‐217. Conley ME, Howard V. Clinical findings leading to the diagnosis of X‐linked agammaglobulinemia. J Pediatr 2002;141:566‐71. Conley ME, Notarangelo LD, Etzioni A. Diagnostic criteria for primary immunodeficiencies. Representing PAGID (Pan‐ American Group for Immunodeficiency) and ESID (European Society for Immunodeficiencies). Clin Immunol 1999;93(3):190‐7. Fiorini M, Franceschini R, Soresina A, Schumacher RF, Ugazio AG, Rossi P, Plebani A, Notarangelo LD. BTK: 22 novel and 25 recurrent mutations in European patients with X‐linked agammaglobulinemia. Hum Mutat. 2004 Mar;23(3):286. Hashimoto S, Tsukada S, Matsushita M, Miyawaki T, Niida Y, Yachie A, Kobayashi S, Iwata T, Hayakawa H, Matsuoka H, Tsuge I, Yamadori T, Kunikata T, Arai S, Yoshizaki K, Taniguchi N, Kishimoto T. Identification of Brutonʹs tyrosine kinase (Btk) gene mutations and characterization of the derived proteins in 35 X‐linked agammaglobulinemia families: a nationwide study of Btk deficiency in Japan. Blood 1996;88(2):561‐573. Holinski‐Feder E, Weiss M, Brandau O, Jedele KB, Nore B, Bäckesjö CM, Vihinen M, Hubbard SR, Belohradsky BH, Smith CI, Meindl A. Mutation screening of the BTK gene in 56 families with X‐linked agammaglobulinemia (XLA): 47 unique mutations without correlation to clinical course. Pediatrics 1998;101(2):276‐284. Kanegane H, Futatani T, Wang Y, Nomura K, Shinozaki K, Matsukura H, Kubota T, Tsukada S, Miyawaki T. Clinical and mutational characteristics of X‐linked agammaglobulinemia Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học 10 11 12 13 14 15 16 17 Ngày nhận bài báo: 15 tháng 8 năm 2013 Ngày phản biện: 04 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 199 ... hợp mất đoạn exon 7 – 15 trên một bệnh nhân 10 tháng tuổi. Các đột biến mất đoạn RNA của gen BTK có thể là hậu quả của các đột biến điểm trên Bảng 1: Các trường hợp bệnh nhân có đột biến gen BTK STT... mang đột biến của gen BTK, gồm 8 đột biến mất đoạn, 4 đột biến điểm và 1 đột biến chèn đoạn (Bảng 1). Các đột biến mất đoạn gen BTK đã được nhiều tác giả mô tả trong bệnh XLA(7,9,15). Những ... ĐẶT VẤN ĐỀ Thiếu gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X (X linked agammaglobulinemia: XLA) là một tình trạng khiếm khuyết miễn dịch di truyền, gây ra do đột biến gen BTK dẫn đến mất