Nội dung bài viết với mục tiêu xác định đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn. Nghiên cứu tiến hành 07 bệnh nhân tạo xương bất toàn và bố mẹ bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu, kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 TRÊN BỆNH NHÂN TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN Bùi Thị Hồng Châu*, Trần Vân Khánh*, Hồ Cẩm Tú*, Trần Huy Thịnh * Tạ Thành Văn* TÓMTẮT Mở đầu: Tạo xương bất toàn bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, 85% gây nên đột biến gen tổng hợp collagen týp (COL1A1) Bố mẹ mắc bệnh có khả truyền bệnh cho 50% Mục tiêu: Xác định đột biến gen COL1A1 bệnh nhân bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 07 bệnh nhân tạo xương bất toàn bố mẹ bệnh nhân lựa chọn nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp sử dụng để phát đột biến Kết quả: 5/7 bệnh nhân tạo xương bất toàn phát có đột biến gen COL1A1, trường hợp di truyền từ bố trường hợp di truyền từ mẹ, trường hợp đột biến phát sinh Kết luận: Phát đột biến gen bố, mẹ bệnh nhân đóng vai trò quan trọng cơng tác tư vấn di truyền Từ khóa: Bệnh tạo xương bất toàn, COL1A1, đột biến ABSTRACT MUTATIONAL SPECTRUM OF COL1A1 GENE IN PATIENTS WITH OSTEOGENESIS IMPERFECTA Bui Thi Hong Chau, Tran Van Khanh, Ho Cam Tu, Tran Huy Thinh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - No - 2013: 20 - 24 Background: Osteogenesis imperfecta, an autosomal dominant disease, is caused by mutation on gene coded for collagen type (COL1A1) Parent with this genetic disease deliver 50% of the ability of osteogenesis imperfecta for their children Objective: Identification of COL1A1 gene mutation in OI patients and their parent Method: osteogenesis imperfecta patients and their parents were selected for this study Direct sequencing was used to detect the mutation Results: The results showed that 5/7 patients were found to have the mutation in COL1A1 gene; including two cases are inherited from the father and the two cases are inherited from the mother, one case was found as de novo mutation Conclusion: Identify the mutations in COL1A1 gene is important for genetic counseling Keywords: Osteogenesis imperfecta, COL1A1, mutation người mẹ bị bệnh, nguy sinh bị bệnh MỞĐẦU 50% khơng bị bệnh 50% Chẩn đốn bệnh Tạo xương bất tồn (Osteogenesis Imferfecta OI khơng phức tạp trường hợp có tiền – OI) bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể sử gia đình rõ biểu bệnh nặng, có tiền thường, chủ yếu đột biến gen tổng hợp sử gãy xương Với trường hợp khơng có collagen týp (COL1A1) Nguy mắc bệnh tiền sử gia đình gãy xương khơng có kết nam nữ Khi người bố hợp với bất thường ngồi xương chẩn * Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: TS Trần Vân Khánh ĐT: 0915958661 Email: vankhanh73md@yahoo.com 20 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 đốn tương đối khó khăn, ngồi tiêu chuẩn chẩn đoán mặt lâm sàng, cần kết hợp thêm với xét nghiệm số lượng cấu trúc phân tử collagen týp qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh nhân kết hợp phân tích gen(9,2) Kết phân tích gen tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối tượng có nguy cao sinh bị bệnh để đưa tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa giảm tỉ lệ mắc bệnh(6, 3) Nghiên cứu thực Trung Tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội với mục đích xác định đột biến gen COL1A1 bệnh nhân bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn Nghiên cứu Y học ABI-PRISM Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) để phát đột biến KẾTQUẢ Kết PCR Sau thu DNA có nồng độ độ tinh cao, kỹ thuật PCR tiến hành để khuyếch đại gen COL1A1 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu - 07 bệnh nhân chẩn đoán bệnh OI Khoa Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương dựa vào triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng điển hình - Các cặp bố mẹ bệnh nhân Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu bệnh phẩm Bệnh nhân lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA, đảm bảo vô trùng Tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết từ máu tồn phần chống đơng EDTA dung dịch phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1) Nồng độ độ tinh DNA đo máy Nanodrop 1000 Kỹ thuật PCR Những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/260 ≥ 1,8 sử dụng để khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu Chu kỳ nhiệt: 94oC/5phút (94oC/1phút - 59oC/1phút - 72oC/ 2phút) x 35 chu kỳ - 72oC/5phút Sản phẩm PCR bảo quản 4oC Giải trình tự gen Sản phẩm PCR tiến hành giải trình tự máy 3100-Avant Genetic Analyzer hãng Hình 1: Hình ảnh PCR đoạn gen khuyếch đại từ exon 39 - 41 gen COL1A1 C mẫu đối chứng, 1-7 mẫu bệnh nhân MK: Marker 100 bp Sản phẩm PCR tiến hành giải trình tự gen trực tiếp để xác định đột biến, kết cho thấy 5/7 bệnh nhân phát có đột biến điểm gen COL1A1 Bố, mẹ bệnh nhân tiến hành xác định đột biến để tìm nguyên nhân gây bệnh người có phải di truyền bố mẹ hay khơng Trường hợp Phân tích gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân số 20 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 7599-31C>T intron 31, người mẹ bệnh nhân khơng có đột biến Như bệnh nhân số 20 có đột biến 7599-31C>T dị hợp tử intron 31 nhận alen đột biến từ người bố (Hình 2) Tương tự, kết phân tích gen COL1A1 trường hợp 2, gia đình bệnh nhân số 43 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 3479+33T>C intron 33, người mẹ bệnh nhân khơng có đột biến, hai em gái em trai bệnh nhân khơng có đột biến Như bệnh nhân số 21 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học 43 có đột biến 3479+33T>C intron 33 dị hợp tử nhận alen đột biến từ người bố (Hình 3) c.7599-31C c.7599-31C>T Bố bệnh nhân mã số 20 Mẹ bệnh nhân mã số 20 c.7599-31C>T Bệnh nhân mã số 20 Hình 2: Đột biến 7599-31C>T intron 31 gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân số 20 Mũi tên thẳng đứng vị trí đột biến, chữ số mũi tên vị trí nucleotid acid amin thay đổi I II Nam bị bệnh Nữ bình thường Nữ bị bệnh Hình : Phả hệ gia đình mã số 20 (mũi tên: BN mã số 20) Trường hợp Phân tích gen COL1A1 gia đình bệnh nhân số cho thấy người bố bệnh nhân khơng có đột biến, người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử thay G thành T vị trí 2183 làm cho ba vị trí 686 mã hóa Glycin chuyển thành Valin (p.Gly686Val) Bệnh nhân số người em trai có đột biến dị hợp tử nhận alen đột biến từ người mẹ (Hình 4) 22 Tương tự, kết phân tích gen COL1A1 gia đình bệnh nhân số 23 cho thấy người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử thay G thành A vị trí 2587 làm cho ba vị trí 821 mã hóa Glycin chuyển thành Serin (p.Gly821Ser), người bố bệnh nhân khơng có đột biến Bệnh nhân số 23 có đột biến nhận alen đột biến từ người mẹ Kết phân tích gen COL1A1 gia đình bệnh nhân bệnh nhân mã số 03, exon có thay đổi nucleotid C653A (thay đổi Serin vị trí 176 thành Tyrosin) C654G (không làm thay đổi acid amin) dạng dị hợp tử Khi hai đột biến xảy đồng thời biến đổi codon TCC (mã hoá cho Serin) thành mã kết thúc TAG (p.S176Stop) Người mẹ người bố bệnh nhân không tìm thấy đột biến gen (Hình 5) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 Nghiên cứu Y học c 2183G>T p.Gly686Val c 2183G Bố bệnh nhân Mẹ bệnh nhân c 2183G>T p.Gly686Val c 2183G>T p.Gly686Val Bệnh nhân mã số Em trai bệnh nhân Hình 4: Hình ảnh đột biến c.2183 G>T p.Gly686Val gen COL1A1 thành viên gia đình bệnh nhân Mũi tên thẳng đứng vị trí đột biến, chữ số mũi tên vị trí nucleotid acid amin thay đổi I II Nam bình thường Nam bị bệnh Nữ bình thường Nữ bị bệnh Hình 5: Phả hệ gia đình mã số (mũi tên: BN mã số 8) BÀNLUẬN OI bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường đột biến gen tổng hợp collagen týp Như vậy, cần alen mang gen đột biến người mang gen mắc bệnh cần người bố người mẹ bị bệnh 50% khả sinh mắc bệnh OI(8) Nghiên cứu cho thấy có 5/7 bệnh nhân OI có mang đột biến gen COL1A1 Trong đó, trường hợp di truyền từ người bố trường hợp di truyền từ người mẹ Chỉ có trường hợp đột biến phát sinh, người mẹ người bố bình thường Có khoảng 250 đột biến tìm thấy gen COL1A1 chủ yếu dạng thay đổi nucleotid, phá vỡ cấu trúc ba Gly-X-Y dẫn đến tính bền vững protein Những dạng đột biến khác mất, lặp đoạn bổ sung nucleotid gặp hơn(7) Các đột biến thay Glycin (Gly) cấu trúc Gly-X-Y có vai trò quan trọng thường ngun nhân 23 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số * 2013 gây rối loạn cấy trúc collagen I Vùng trải dài từ exon đến exon 49 gen COL1A1 Như không đột biến exon mà đột biến nằm vùng intron ảnh hưởng đến cấu trúc chuỗi xoắn bậc ba Thực tế chứng minh, 18% đột biến intron chuỗi DNA gen COL1A1 công bố gây bệnh OI (Osteogenesis Imperfecta Variant Database) Hiện có 217 đột biến vùng intron gen COL1A1 công bố ngân hàng liệu Osteogenesis Imperfecta Variant Database Đột biến 7599-31C>T dị hợp tử intron 24 xuất bệnh nhân mã số 20 người bố bệnh nhân Đột biến cách đầu 5’ exon 25 khoảng 31 nucleotid gây nhiễu vị trí cắt nối exon 24 25 Tương tự bệnh nhân mã số 43, người bố bệnh nhân xuất đột biến dị hợp tử intron 7, cách đầu 3’ exon khoảng 33 nucleotid, 3479+33T>C Đột biến gây ảnh hưởng q trình cắt nối exon số alen đột biến từ người mẹ từ người bố nên đột biến phát sinh(7,1) Trường hợp bệnh nhân mã số 08, đột biến thay G vị trí 2183 mRNA gen COL1A1 (NM_000088.3) thành T làm thay đổi acid amin Glycin vị trí 686 thành Valin, tìm thấy người mẹ người em trai bệnh nhân (đều bị bệnh OI) Đột biến công bố hai lần ngân hàng liệu Osteogenesis Imperfecta Variant Database khẳng định đột biến gây bệnh OI(7,5) Một trường hợp khác, đột biến p.Gly821Ser bệnh nhân mã số 23 công bố 13 lần châu Âu, châu Á châu Mỹ với tỷ lệ khoảng 11% tổng số đột biến tìm thấy gen COL1A1 Trường hợp bệnh nhân mã số 03, xuất hai đỉnh trùng hai vị trí 653, 654 (NM_000088.3, NCBI) tạo mã kết thúc (nonsense mutation) Tuy nhiên, phân tích bố, mẹ bệnh nhân vị trí khơng thấy có đột biến chứng tỏ bệnh nhân khơng nhận 24 KẾTLUẬN Đã phát 5/7 bệnh nhân có đột biến gen COL1A1 trường hợp di truyền từ bố trường hợp di truyền từ mẹ, trường hợp đột biến phát sinh Chú thích: Nghiên cứu thực Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội sở đề tài cấp Bộ: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen (COL1A1, COL1A2) gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta: OI) trẻ em Việt Nam” - Chủ nhiệm đề tài: TS.TRẦN VÂN KHÁNH - Với tài trợ kinh phí từ Ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học cấp Bộ Y tế duyệt năm 2011 TÀILIỆUTHAMKHẢO Bùi Thị Hồng Châu, Trần Vân Khánh, Hồ Cẩm Tú, Trần Huy Thịnh, Vũ Chí Dũng, Tạ Thành Văn (2012), “Một trường hợp đột biến tạo mã kết thúc gen COL1A1 bệnh nhân tạo xương bất tồn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr 10-3 Buisson O, Senat MV, Laurenceau N, Ville Y (2006), “Prenatal diagnosis of type II osteogenesis imperfecta, describing a new mutation in the COL1A1 gene”, Prenat Diagn., 26, pp 394 Frank Rauch, Francis H Glorieux (2004), “Osteogenesis Imperfecta”, The Lancet, 363 Hồ Cẩm Tú, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Bùi Thị Hồng Châu, Lê Hoài Chương, Tạ Thành Văn (2012), “Phát đột biến gen COL1A1 bệnh nhi tạo xương bất tồn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr 5-10 Leśniewicz R and al (2001), “Prenatal and neonatal diagnosis of osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol., 72, pp 456-465 Leśniewicz R, Galicka A, Anchim T, Skotnicki M, Wołczyński S, Urban J (2001), “Prenatal and neonatal diagnosis of osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol., 72, pp 456-65 Liu W and al (2007), “A novel COL1A1 nonsense mutation causing osteogenesis imperfecta in a Chinese family”, Mol Vis., 13, pp 360-5 Pollitt R, McMahon R, Nunn J, Bamford R, Afifi A, Bishop N, Dalton A (2006), “Mutation analysis of COL1A1 and COL1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV”, Hum Mutat., 27, pp 716 Trần Vân Khánh (2011), “Bệnh tạo xương bất toàn”, Bệnh học phân tử, Nhà xuất y học, tr 208-16 Ngày nhận bài: 10/12/2012 Ngày phản biện đánh giá báo: 06/01/2013 Ngày báo đăng: 31/01/2013 ... hợp Phân tích gen COL1A1 bố mẹ bệnh nhân số 20 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 7599-31C>T intron 31, người mẹ bệnh nhân khơng có đột biến Như bệnh nhân số 20 có đột biến 7599-31C>T... Serin (p.Gly821Ser), người bố bệnh nhân khơng có đột biến Bệnh nhân số 23 có đột biến nhận alen đột biến từ người mẹ Kết phân tích gen COL1A1 gia đình bệnh nhân bệnh nhân mã số 03, exon có thay... giải trình tự gen trực tiếp để xác định đột biến, kết cho thấy 5/7 bệnh nhân phát có đột biến điểm gen COL1A1 Bố, mẹ bệnh nhân tiến hành xác định đột biến để tìm nguyên nhân gây bệnh người có