Bài viết đưa ra 3 mục tiêu chính: 1. Phân lập curcumin II, III từ bột nghệ; 2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcumin I, curcumin II, curcumin III; 3. Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho viên nang mềm chứa nanocurcumin.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG MỀM CHỨA NANOCURCUMIN Nguyễn Tường Vân*, Vĩnh Định** TÓM TẮT Mục tiêu: Phân lập curcumin II, III từ bột nghệ Thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcumin I, curcumin II, curcumin III Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho Viên nang mềm chứa nanocurcumin Đối tượng phương pháp: - Viên nang mềm chứa nanocurcumin liposom nghiên cứu công thức tiêu chuẩn kỹ thuật bao gồm: Curcumin toàn phần 15,0 mg v| c{c t{ dược Sáp ong trắng, Dầu cọ, Lecithin, Dầu đậu nành - Curcumin I, h|m lượng 99,26% (ChromaDex, USA) - Phân lập curcumin từ nguyên liệu sắc ký cột với hệ dung mơi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần - X{c định c{c đặc tính (màu sắc v| độ tan curcumin II, curcumin III phân lập), độ tinh khiết (SKLM với ba hệ dung mơi có độ phân cực kh{c nhau; x{c định nhiệt độ nóng chảy v| độ tinh khiết chất phân lập phương ph{p quét nhiệt vi sai-DSC; đ{nh gi{ độ tinh khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic) cấu trúc chất thu (phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR) Kết quả: Đã ph}n lập CX2 (x{c định curcumin II), CX3 (xác định curcumin III) có nhiệt độ nóng chảy 169,71 oC 219,08 oC với độ tinh khiết 99,45% 98,30% kỹ thuật DSC Đã x}y dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcuminoid ứng dụng chế phẩm chứa nanocurcumin liposom Sơ thử độ hòa tan viên nang mềm nanocurcumin liposom X{c định kích thước hạt dung dịch thuốc viên nang mềm chứa nanocurcumin dạng liposom Kết luận: Việc phân lập curcumin II, curcumin III SK cột đơn giản v| áp dụng quy mơ điều chế để thiết lập chất đối chiếu Quy trình định lượng xây dựng chủ yếu phương ph{p SKLHNC với đầu dò PDA C{c điều kiện sắc ký chọn dựa vào tiêu chí thành phần dung mơi đơn giản, an tồn; cột sắc ký phổ biến; thời gian lưu < 30 phút v| độ phân giải pic curcumin > Việc thẩm định quy trình thực theo hướng dẫn thường quy Từ khóa: nghệ, curcumin, Demethoxycurcumin, Bisdemethoxycurcumin, nanocurcumin ABSTRACT DEVELOPMENT OF IN-HOUSE SPECIFICATION OF SOFTGEL CONTAINING NANOCURCUMIN Nguyen Tuong Van, Vinh Dinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:155 - 161 Objectives: Isolate Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder extract Validate the simutaneous determination of Curcumin, Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy curcumin by RP-HPLC method with PDA detector Establish in-house specifications for soft capsules containing nanocurcumin liposome Materials and methods: - Soft capsules CLINOVA which is being studied technical specifications *Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành **Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Vĩnh Định ĐT: 0903639586 Chuyên Đề Dƣợc Email: npvdinh@yahoo.com 155 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 contain: Curcuminoid 15.0 mg in form of nanoliposome and recipients (White bee wax, palm oil, lecithin, soybean oil) - Curcumin 99.26% (ChromaDex, USA) - Isolate demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder extract by traditional column chromatography, mobile phase is composed of CHCl3-MeOH with incerasing polarity - Determine characteristics of isolated demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin: color and solubility, puri lẫn với curcumin I Đặc điểm cảm quan: CX2 tinh thể dạng bột, m|u đỏ cam, tan cloroform, tan methanol dimetylsulfoxid CX3 tinh thể dạng bột, màu vàng nhạt, tan cloroform, tan methanol dimetylsulfoxid Độ tinh khiết SKLM Sắc ký đồ CX2 CX3 sắc ký với hệ dung mơi có độ phân cực khác Phát mắt thƣờng CX2 CX3 cho vết mỏng khai triển với ba hệ dung mơi có độ phân cực khác Vậy chất phân lập đƣợc đạt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng Độ tinh khiết xác định kỹ thuật quét nhiệt vi sai (DSC) Curcumin II Curcumin III tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy lần lƣợt 172 oC 222 oC Dựa v|o đó, kỹ thuật DSC x{c định nhiệt độ nóng chảy CX2 CX3 lần lƣợt 169,71 oC 219,08 oC, với độ tinh khiết lần lƣợt 99,45% 98,30% Sơ đồ 1: Quy trình phân lập CX2, CX3 từ bột nghệ Sản phẩm phân lập đƣợc 30 mg CX2 (hiệu suất 2,0%) 25 mg CX3 (hiệu suất 1,67%) Lặp lại quy trình phân lập lần Gộp trộn sản phẩm phân lập thu đƣợc tổng cộng 60 mg CX2, 50 mg CX3 Mỗi lần phân lập tiến hành sắc ký cột lần Hàm lƣợng curcumin thu đƣợc không giống với tỉ Chuyên Đề Dƣợc Hình 1: Phổ DSC CX2 (trái) CX3 (phải) 157 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Độ tinh khiết sắc ký lỏng CX2 v| CX3 đạt độ tinh khiết sắc ký lỏng 98% tính theo% diện tích pic Mặt khác, độ tinh khiết săc ký đầu dò PDA (λmax = 420 nm) cho thấy không lẫn pic tạp chất khác Xác định cấu trúc phƣơng pháp phổ Phổ hồng ngoại Phổ IR hai chất CX2 CX3 có dao động đặc trƣng tƣơng có nhóm chức giống nhóm O-H (3331,0 cm-1), C=O (1625 cm-1), C=C anken (1602 cm-1), C=C aren (1573 cm-1), C-H aren para (826 cm1).Riêng CX3 không cho đỉnh hấp thu liên kết C-H alkan (2943 cm-1) Hình 2: Phổ IR CX3 Phổ khối Khối lƣợng phân tử CX2 CX3 lần lƣợt l| 338,9 đ.v.C v| 308,9 đ.v.C Hình 3: Phổ khối ESI MS+ CX2 (trái, M = 338,9), CX3 (phải, M = 308,9) 158 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bảng 1: Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO) CX2 (ppm; j Curcumin CX3 (ppm; (1) Hz) II j Hz) OCH3 3,836 (s) 3,82 6,048 (s) 6,02 6,047 (s) 6,682 6,67 (d; 16 Hz) (d; 15 Hz) 6,682 (d; 16 Hz) 6,749 6,67 3’ (d; 16 Hz) (d; 15 Hz) 6,815 6.81 9’; 9’ (d; 7,5 Hz) (d; Hz) 6,818 6,828 (d; 8,5 Hz) N/A (d; 1,5 Hz) 7’ 7,140 6.91 10 (dd; 8; Hz) (d; Hz) 7,315 7,13 7,558 10’ (dd;, 8; Hz) (dd; Hz) (d;, 8,5 Hz) 7,561 7.31 6, 6’ (dd; 8; Hz) (d, Hz) 7,537 7.53 (d; 16 Hz) (d, 15 Hz) 7,539 (d; 16 Hz) 7,545 5(d, 7.53 4’ (d, 15 Hz) 16 Hz) 8, 8’ 10,066 Vị trí Curcumin (1) III 5.99 (s) 6.67 (d; 15,8 Hz) CX2 Curcumin (1) II 55,69 100,85 55,7 100,9 111,27 111,2 115,68 9’; 115,90 115,7 115,7 / 115,9 120,83 120,8 3’ 121,04 10,10’ 123,15 5’ 6’ 4’ 7’ 8’ 2’ 125,81 126,34 130,30 140,34 140,67 147,99 149,34 159,78 183,11* 183,25* 121,1 123,2 / 123,1 125,8 126,4 130.4 140,4 140,7 148.0 149,8 159,8 183,1 183,2 Dữ liệu phổ UV (λmax = 420 nm), IR NMR chứng tỏ CX2 tƣơng ứng với Curcumin II có cơng thức phân tử C20H18O5 Phổ 13CNMR CX3 cho thấy tín hiệu cộng hƣởng δ = 55,69 ppm C Methoxy Dữ liệu phổ UV, IR NMR chứng tỏ CX3 tƣơng ứng với curcumin III có cơng thức phân tử C19H16O4 Cấu tạo curcumin II v| III nhƣ sau: 6.91 (d; 8,5 Hz) 7.57 (d; 8,5 Hz) Demethoxy curcumin 7.61 (d; 15,8 Hz) Bảng 2: Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO) Vị trí Nghiên cứu Y học Bisdemethoxy curcumi Vị trí CX3 Curcumi (1) n III Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời curcumin I, curcumin II, curcumin III 7; 7’; 9; 9’ 3; 3’ 100,90 100,9 115,93 115,9 120,83 121,1 Chế phẩm Viên nang mềm CLINOVA chứa hoạt chất curcuminoid dạng nanoliposom 5; 5’ 125,86 126,8 130,31 130,0 140,36 140,1 8; 8’ 159,78 159,7 2; 2’ 183,21 183,2 6; 6’; 10; 10’ 4; 4’ Mỗi viên nang mềm có chứa 250 mg nanocurcumin 6% (kl/kl) (tƣơng ứng 15 mg curcuminoid dạng nano) số t{ dƣợc: sáp ong trắng, dầu cọ, lecithin, dầu đậu nành Điều kiện sắc ký lỏng Đầu dò: PDA2998, λ = 420 nm Ct: Lunađ àm C18, 100 Ao Pha ng: Acid acetic 2% - Acetonitril (55:45) Thể tích tiêm: 10 µL Tốc độ dòng:1 mL/phút Nhiệt độ cột: 25 oC Chuyên Đề Dƣợc 159 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Tính tương thích hệ thống Tiêm lần dung dịch chuẩn curcumin I 20 µg/ml, curcumin II 20 µg/ml, curcumin III 20 µg/ml v|o hệ thống sắc ký lỏng Ghi nhận thông số thời gian lƣu (tR), diện tích đỉnh (S), hệ số bất đối (As), hệ số dung lƣợng (k’), số đĩa lý thuyết (N) lần tiêm để tính kết phân tích tính tƣơng thích hệ thống Độ Thêm vào dung dịch chuẩn curcumin mức nồng độ 100%, 120%, 150% lƣợng curcumin mẫu thử Tính độ phục hồi, tỉ lệ phần trăm lƣợng chuẩn phát đƣợc so với lƣợng thực tế cho vào Độ phục hồi curcumin I, curcumin II, curcumin III từ 94 – 105% Quy trình có độ phục hồi tốt Tính tƣơng thích hệ thống HPLC phân tích ba curcumin đạt yêu cầu để thẩm định quy trình phân tích với giá trị % RSD, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, hệ số dung lƣợng đạt theo tiêu chuẩn chấp nhận Định tính Theo sắc ký đồ mẫu thử, có pic ứng với thời gian lƣu curcumin mẫu chuẩn Vậy mẫu thử có chứa curcumin I, curcumin II, curcumin III Tính đặc hiệu Tiêm dung dịch mẫu Trắng, BI (curcumin I 20 µg/ml), BII (curcumin II 20 µg/ml), BIII (curcumin III 20 µg/ml), D (20 µg/ml curcumin), mẫu Thử mẫu Thử thêm chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic curcumin I, curcumin II, curcumin III có thời gian lƣu lần lƣợt khoảng 22,601 phút, 20,97 phút, 18,75 phút, trùng với thời gian lƣu pic curcumi I, curcumin II, curcumin III dung dịch chuẩn Mẫu trắng khơng có pic vị trí Độ xác Phân tích dung dịch mẫu thử khác nhƣng có nồng độ giống Dựa vào kết phân tích, ghi nhận thơng số cho curcumin: thời gian lƣu (tR), diện tích pic (S) H|m lƣợng viên lần định lƣợng có kết lặp lại, quy trình có tính xác Tính tuyến tính Tiêm dung dịch chuẩn chung curcumin I, curcumin II, curcumin III mức nồng độ 5, 10, 20, 25, 100, 200 µg/ml Ghi nhận diện tích pic Vẽ đƣờng biểu diễn phụ thuộc diện tích pic theo nồng độ Đƣờng tuyến tính ba curcumin có hệ số tƣơng quan R2 ≥ 0,995 160 Định tính định lƣợng Định lượng H|m lƣợng curcumin toàn phần 121,39% so với h|m lƣợng ghi nhãn Độ hòa tan So s{nh độ hồ tan 30 phút, 45 phút, 60 phút Ở thời điểm 30 phút, viên giải phóng 70% hoạt chất, tiến h|nh đo độ hòa tan viên Tất giải phóng 70% hoạt chất Kích thƣớc hạt Chế phẩm có kích thƣớc hạt trung bình 14,54 nm PDI < 0,2 Yêu cầu chất lƣợng - Hình thức: viên nang mềm màu vàng, bề mặt viên lành lặn, không mùi không vị - Độ đồng khối lƣợng: ± 7,5% khối lƣợng trung bình viên - Độ hòa tan: 70% lƣợng curcumin toàn phần so với lƣợng ghi nhãn đƣợc hòa tan thời gian khơng 30 phút - Định tính: sắc ký đồ dung dịch chế phẩm có píc với thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu curcumin I, II, III chuẩn - Định lƣợng: h|m lƣợng curcumin tồn phần khơng thấp lƣợng ghi nhãn Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 BÀN LUẬN Xác định cấu trúc Phổ IR hai chất CX2 v| CX3 tƣơng tự chứng tỏ chúng có khung cấu trúc nhóm chức giống nhƣ: có nh}n thơm vị trí para (CX2 826,7 cm -1 , CX3 -1 830,9 cm ) có nhóm chức alcol, ceton, có C sp liên kết đơi Riêng CX3 không cho đỉnh hấp thu liên kết C-H alkan vùng 3000-2800 cm -1 Phổ khối ESI+ CX2 CX3 cho pic lần lƣợt 338,9 308,9 gần với số khối curcumin II curcumin III Phổ H-NMR CX2: ba proton methoxy, proton alken, bốn proton bốn C lai hố sp2 cấu hình trans, bảy proton nh}n thơm Phổ 13 C-NMR CX2 có 18 tín hiệu cộng hƣởng 20 carbon, carbon methoxy, C β nhóm diketon, bốn C lai hố sp2, hai nhóm carbonyl, C lai hoá sp2 nằm vùng dịch chuyển hoá học nh}n thơm Kết liệu phổ IR, MS NMR CX2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc curcumin II (1) Phổ H-NMR CX3: khơng có tín hiệu proton methoxy, proton alken, bốn proton bốn C lai hố sp2 cấu hình trans, bốn proton nh}n thơm, bốn proton nh}n thơm, hai proton nhóm hydroxyl Phổ 13 C-NMR CX3: có tín hiệu cộng hƣởng 19 carbon, C β nhóm Diketon, hai C nhóm carbonyl, C lai hoá sp2 nằm vùng dịch chuyển hố học nh}n thơm v| alken có mơi trƣờng hố học (hay có đối xứng phân tử) nên tín hiệu tăng gấp đơi hay gấp bốn so với tín hiệu C nhóm diketon δ = 100,90 ppm Kết liệu phổ IR, MS NMR CX3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc curcumin II (1) Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời ba curcumin Quy trình định lƣợng sử dụng chuẩn curcumin I (USP) curcumin II, curcumin III phân lập đƣợc Kết cho thấy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống, đặc hiệu, độ xác, tính tuyến tính v| độ Có thể áp dụng quy trình để định lƣợng thẩm định chế phẩm chứa curcumin liposom (M Hasan cộng sự, 2013) Kích thƣớc hạt nanocurcumin liposom Một sản phẩm tốt phải có kích thƣớc hạt nhỏ kích thƣớc nanomét, đồng bền trình bào chế Kết đo kích thƣớc hạt chế phẩm cho thấy, hạt nanocurcumin có kích thƣớc trung bình 14,54 nm, PDI < 0,2 KẾT LUẬN Việc phân lập curcumin II, curcumin III SK cột đơn giản, {p dụng đƣợc quy mô điều chế để thiết lập chất đối chiếu Quy trình định lƣợng đƣợc xây dựng chủ yếu phƣơng ph{p SKLHNC với đầu dò PDA C{c điều kiện sắc ký đƣợc chọn dựa vào tiêu chí thành phần dung mơi đơn giản, an tồn; cột sắc ký phổ biến; thời gian lƣu < 30 phút v| độ phân giải pic curcumin > Việc thẩm định quy trình thực theo hƣớng dẫn thƣờng quy TÀI LIỆU THAM KHẢO Péret-Almeida L, Cherubino APF (2005), “Separation and determination of the physico-chemical characteristics of curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin”, Food Research International, 38, 1039–1044 Trần Thị Ngần, Nguyễn Ngọc Vinh (2013), Phân lập chất đối chiếu curcuminoid từ nghệ đỏ Rhizoma Curcumae xanthiorrhizae Yadav VR, Sarasija S (2009), “A Sensitive Reversed Phase HPLC Method for the Determination of Curcumin”, Pharmacognosy margazine, Al-Ameen college of Pharmacy, 5(17), pp.71-74 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 161 ... phẩm Viên nang mềm CLINOVA chứa hoạt chất curcuminoid dạng nanoliposom 5; 5’ 125,86 126,8 130,31 130,0 140,36 140,1 8; 8’ 159,78 159,7 2; 2’ 183,21 183,2 6; 6’; 10; 10’ 4; 4’ Mỗi viên nang mềm. .. < 0,2 Yêu cầu chất lƣợng - Hình thức: viên nang mềm màu vàng, bề mặt viên lành lặn, không mùi không vị - Độ đồng khối lƣợng: ± 7,5% khối lƣợng trung bình viên - Độ hòa tan: 70% lƣợng curcumin... lý thuyết, hệ số dung lƣợng đạt theo tiêu chuẩn chấp nhận Định tính Theo sắc ký đồ mẫu thử, có pic ứng với thời gian lƣu curcumin mẫu chuẩn Vậy mẫu thử có chứa curcumin I, curcumin II, curcumin