Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết hoàng liên giải độc thang bằng phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng berberin - hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hồng liên giải độc thang (HLGĐ) thuốc nhiệt giải độc có xuất xứ từ Trung Quốc, ghi tác phẩm Ngoại đài bí yếu tác giả Vương Đảo (Nhà Đường) Bài thuốc sử dụng rộng rãi nhân dân để điều trị số bệnh viêm nhiễm viêm phổi, mụn nhọt, kiết lỵ… Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh thuốc có hiệu điều trị đái tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư… thực nghiệm Để tiện lợi việc sử dụng thuốc nghiên cứu điều trị, xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết HLGĐ phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- thuốc Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu khoa Dược- Cơ sở Bệnh viện Đại học Y Dược TP HCM cung cấp Áp dụng phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật phản ứng hóa học kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid kỹ thuật quang phổ Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % độ tro tồn phần trung bình 8,46% Xác định diện alkaloid flavonoid cao HLGĐ Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định cao HLGĐ có đủ dược liệu cấu thành thuốc Hàm lượng Berberin cao 0,852% Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin góp phần xây dụng tiêu chuẩn sở cao HLGĐ Từ khóa: Hồng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hố, sắc ký lớp mỏng ABSTRACT PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR “HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 203 - 208 Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China, that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao It is used widely to treat some infectious diseases such as pneumonia, furuncles, dysentery…Many studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes, enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation In order to make HLJDT more convenient in research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination As well, berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical Center HoChiMinh City Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the chemical components Berberin was determined by means of the spectral methods ∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP Hồ Chí Minh Địa liên hệ: Bs Trần Thu Nga ĐT: 0989231241 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Email: thunga149@yahoo.com 203 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46% There are alkaloid and flavonoid in the product TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs Berberin concentration in the product is 0.852% Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method and berberin determination to standardize the HLJDT extract Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography định kiểm tra chất lượng thuốc Dược ĐẶT VẤN ĐỀ điển Việt Nam Hoàng liên giải độc thang (gồm vị thuốc: Phương pháp Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Điều chế cao chiết thuốc Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) Chi tử (Fructus Gardeniae)) thuốc cổ Chiết xuất dược liệu phương pháp sắc phương có tác dụng nhiệt giải độc Bài dung môi nước Sau thu dịch thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, ghi chiết, tiến hành lọc cô cách thủy để thu tác phẩm Ngoại đài bí yếu tác giả Vương cao HLGĐ (1) Đảo (Nhà Đường) Công dụng thuốc Xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết ghi số tài liệu ứng dụng điều trị số thuốc(2) bệnh viêm nhiễm viêm phổi, mụn nhọt, kiết Độ ẩm lỵ…(1, 7) Nhiều công trình nghiên cứu chứng Cân xác khoảng 0,5 g cao vào minh thuốc có hiệu điều trị đái chén cân, đem sấy 1050C tủ sấy tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer, áp suất thường đến khối lượng không đổi xơ vữa động mạch…trên thực nghiệm (3,5,8,9) Một Tính độ ẩm: nghiên cứu gần kết luận tác dụng thuốc gây chết theo chương trình ngừng chu kỳ tế bào dòng tế bào ung thư gan in vitro in vivo (4) Ngoài ra, mơ hình gây độc cyclophosphamid, cao chiết Hồng liên giải độc thang cho thấy có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa, giải độc (6) Để thuận lợi cho việc nghiên cứu sử dụng thuốc điều trị, áp dụng phương pháp phân tích hóa học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng định lượng hoạt chất berberin cao HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết thuốc ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) Chi tử (Fructus Gardeniae) cung cấp khoa Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP HCM Mỗi dược liệu chuẩn hố theo quy 204 H% = a−b × 100 a a: khối lượng bột dược liệu trước sấy (g); b: khối lượng bột dược liệu sau sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl) Độ tro toàn phần Cân xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén nung Trải dược liệu đáy chén đốt cẩn thận bếp điện dược liệu cháy hồn tồn chén khơng bốc khói Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung 500- 600 0C vơ hóa hồn tồn (tro khơng màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút bình hút ẩm Cân ghi lại lượng cân Đặt chén đựng tro vào lò nung lại tiếp tục nung nhiệt độ Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút bình hút ẩm Cân Tiếp tục làm đến kết lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 lệch khơng q 0,5 mg Tro tồn phần tính dược liệu khơ kiệt theo cơng thức: A= (a − b )× 100 % c − (c × h ) A%: tro toàn phần (%) dược liệu; a: khối lượng chén có tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng; h: độ ẩm (%) dược liệu Định tính Phương pháp hóa học: Hợp chất alkaloid: Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc H2SO4 5% chia vào ống nghiệm để làm phản ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat quan sát màu ống nghiệm sau phản ứng Hợp chất flavonoid: Lấy g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml MeOH, lọc Dịch lọc đến cắn Hồ cắn với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc Dịch lọc chia vào ống nghiệm làm phản ứng với NaOH 10%, FeCl3 3% cồn thuốc thử chì acetat Quan sát màu ống nghiệm sau phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu trắng đục Phương pháp sắc kí lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng thực mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck) Lấy khoảng 0,1 g dược liệu, cho vào cốc có mỏ 50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút, lọc Tập trung lọc 1ml làm dung dịch chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu làm đối chiếu sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tương thích tham khảo dược điển Định lượng Hàm lượng berberin cao HLGĐ xác định dựa vào đường cong chuẩn độ berberin chuẩn methanol máy quang Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS Xác định đỉnh hấp thu cực đại: Đỉnh hấp thu cực đại berberin chuẩn methanol λmax = 266 nm Xây đựng đường chuẩn berberin Thiết lập giai mẫu Cân xác mg berberin chuẩn, hòa tan 10 ml methanol cho vào bình định mức 10 ml (dung dịch chuẩn A) Dùng micro pipette lấy xác dung dịch chuẩn A tích là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400 µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm Mẫu thử Cân xác khoảng 100 mg cao, cho vào bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm nhiều lần methanol dịch chiết methanol khơng phản ứng chất berberin Dịch chiết khoảng 10 ml cho vào bình định mức 10 ml, lắc Dùng micro pipet hút xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định mức 10 ml thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm Bảng Mật độ quang giai mẫu berberin chuẩn Bình định mức Hàm lượng berberin (µg/ml) µg µg µg µg µg µg Mật độ quang (OD) 0,262 0,340 0,421 0,491 0,566 0,636 Cơng thức tính hàm lượng berberin mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x + 0,0413 C(%) = At − 0,0413 100 b × × ×10−6 0,0748 0,5 p 205 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học A t: Độ hấp thu mẫu thử b: Khối lượng 100 g cao HLGĐT khô kiệt (g) p: Khối lượng cao HLGĐT đem thử trừ ẩm (g) y = 0,0748x + 0,0413 Đường chuẩn BERBERIN R 2= 0,9994 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 HÀM LƯỢNG (µg/ ml) Biểu đồ Đường chuẩn dung dịch chuẩn berberin KẾT QUẢ Bào chế cao HLGĐ 80 0C -1000C 10 lít nước 60 phút Dược liệu 2440 g Dịch chiết 2500 ml nước Bã dược liệu 800C-1000C 5000 ml nước 30 phút Dịch chiết 1200 ml Dịch chiết 1+2 Lọc Cô cách thủy Cao HLGĐ (650g) Sơ đồ Qui trình bào chế cao HLGĐ Hiệu suất chiết cao: 18,13% 206 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Độ ẩm cao HLGĐ Cao Khối lượng Cao HLGĐT (g) Tro tồn phần (%) Trung bình (%) Bảng Độ ẩm cao HLGĐ Cao Khối lượng Cao HLGĐT(g) Độ ẩm (%) Trung bình (%) Lần 0,5183 32,22 Lần Lần 0,4998 0,5078 31,63 31,88 31,91 Tro toàn phần cao HLGĐ Nghiên cứu Y học Lần Lần Lần 0,5254 0,5512 0,5390 8,36 8,31 8,72 8,46 Định tính - Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid alkaloid: dương tính - Phương pháp sắc kí lớp mỏng: Bảng Độ tro toàn phần cao HLGĐ Bảng Sắc ký đồ cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu Nguyên liệu Hoàng liên Hoàng bá Hoàng cầm Chi tử Hệ dung môi khai triển Số vết nguyên Số vết Số vết trùng liệu đối chiếu cao nguyên liệu với cao Phát n-butanol:acid Phun TT Dragendorff quan sát ánh sáng thường acetic:nước đèn UV λ= 366 nm (7 : : 2) n-butanol:acid Phun TT Dragendorff quan sát ánh sáng thường acetic:nước đèn UV λ= 366 nm (7 : : 2) Toluen : ethyl Phun FeCl3 quan sát ánh sáng thường đèn UV acetat : acid formic λ= 366 nm (2 : : 2.2) Ethyl acetat : aceton : Phun H2SO4 quan sát ánh sang thường đèn UV acid formic : nước λ=366nm (5 : : : 1) 3 6 6 Kết phân tích sắc ký lớp mỏng chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có diện dược liệu: Hồng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử Chứng tỏ phương pháp chiết xuất giữ thành phần chủ yếu công thức cổ truyền Kết nghiên cứu hàm lượng berberin cao HLGĐ thu 0,852 % chiếm tỷ lệ 62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự đoán Như vậy, kết định lượng cao HLGĐ cho thấy phương pháp chiết xuất thu gần hết thành phần alkaloid có dược liệu Định lượng Cao HLGĐ xây dựng tiêu chuẩn chất lượng độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần (Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép đánh giá tính ổn định chế phẩm, bảo đảm tính xác kết mà nghiên cứu thu Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1) đơn giản, có hiệu quả, dễ thực dễ ứng dụng sản xuất sau Hàm lượng berberin cao HLGĐ Bảng Hàm lượng berberin cao HLGĐ Khối lượng Khối lượng Hàm lượng Mật độ STT Mẫu chưa Mẫu thử berberin cao quang trừ ẩm (g) trừ ẩm (g) HLGĐT khô kiệt (%) 0,1178 0,0802 0,282 0,802 0,1073 0.0730 0,276 0,858 0,1187 0.0808 0,312 0,895 Trung bình 0,852 BÀN LUẬN Kết định tính phương pháp hóa học cho thấy cao HLGĐ có diện hợp chất flavonoid, alkaloid kết sắc ký lớp mỏng (Bảng 4) có diện dược liệu cấu thành thuốc giúp khẳng định phương pháp chiết xuất có hiệu Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền KẾT LUẬN Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % độ tro tồn phần trung bình 8,46% Định tính phương pháp hóa học cho thấy cao HLGĐ có diện hợp chất flavonoid alkaloid Trên sắc kí đồ cao HLGĐ xác định diện dược liệu: Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử 207 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Hàm lượng Berberin cao HLGĐ trung bình 0,852% TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y Tế (2008) Y lý y học cổ truyền Nhà xuất Y Học, tr 91, 148, 149 Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất Y Học, tr 733, 778, 779, 783 Fang Q, Zhan XP, Mo JL, Sun M (2004) “The effect of Huanglian jiedu tang on Alzheimer's disease and its influence on cytokines” Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol 29(6), pp 575-578 Hsu YL, Kuo PL, Tzeng TF, Sung SC, Yen MH, Lin LT, Lin CC (2008) “Huang-lian-jie-du-tang, a traditional Chinese medicine prescription, induces cell-cycle arrest and apoptosis in human liver cancer cells in vitro and in vivo” J Gastroenterol Hepatol, vol 23, pp 290-299 Mizukawa H, Yoshida K, Honmura A, Uchiyama Y, Kaku H, Nakajima S, Haruki E (1993) “The effect of orengedokuto on experimentally-inflamed rats” Am J Chin Med, vol 21(1), pp 71-78 Trần Thu Nga, Nguyễn Phương Dung (2012) Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa cao chiết Hồng liên giải độc 208 chuột nhắt tổn thương gan cyclophosphamid Y học TP Hồ Chí Minh, tập 16, phụ số 1, tr 157-161 Trần Văn Kỳ (2008) 250 thuốc đông y cổ truyền chọn lọc Nhà xuất Thanh Niên, tr 49 Watanabe-Fukuda Y, Yamamoto M, Miura N, Fukutake M, Ishige A, Yamaguchi R, Nagasaki M, Saito A, Imoto S, Miyano S, Takeda J, Watanabe K (2009) “Orengedokuto and berberine improve indomethacin-induced small intestinal injury via adenosine” J Gastroenterol, vol 44(5), pp 380-389 Yu YL, Lu SS, Yu S, Liu YC, Wang P, Xie L, Wang GJ, Liu XD (2009) “Huang-lian-jie-du-decoction modulates glucagon-like peptide-1 secretion in diabetic rats, Ethnopharmacol, vol 124(3), pp 444- 449 Ngày nhận báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày báo đăng: 02/01/2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... berberin cao HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn sở cao chiết thuốc ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Nguyên liệu Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae), Hoàng bá (Cortex... ĐẶT VẤN ĐỀ điển Việt Nam Hoàng liên giải độc thang (gồm vị thuốc: Phương pháp Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix Điều chế cao chiết thuốc Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri)... Kết phân tích sắc ký lớp mỏng chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có diện dược liệu: Hồng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử Chứng tỏ phương pháp chiết xuất giữ thành phần chủ yếu công thức