Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định đa hình nucleotid đơn (SNP) của vùng gen ty thể HV1, HV2 trên 2 dân tộc Kinh và dân tộc Mường Việt Nam. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để phân tích 100 mẫu DNA của 2 dân tộc (50 mẫu dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường), kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn rCRS, từ đó phân loại sơ bộ theo các nhóm đơn bội và dưới đơn bội.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐA HÌNH THÁI ĐƠN NUCLEOTID VÙNG GEN TY THỂ HV1 VÀ HV2 TRÊN NGƯỜI DÂN TỘC KINH VÀ DÂN TỘC MƯỜNG CỦA VIỆT NAM Trần Thị Thúy Hằng, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu thực nhằm: xác định đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen ty thể HV1, HV2 dân tộc Kinh dân tộc Mường Việt Nam Kỹ thuật giải trình tự gen áp dụng để phân tích 100 mẫu DNA dân tộc (50 mẫu dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường), kết giải trình tự so sánh với trình tự chuẩn rCRS, từ phân loại sơ theo nhóm đơn bội đơn bội Kết cho thấy, xác định tỷ lệ số SNP hay gặp mẫu nghiên cứu: SNP A73G A263G gặp 100% mẫu nghiên cứu, 315insC 97%, 309insC 50%, C16223T 44%, G16129A 39%, T16189C 32%, T16172C 30%, A16183C 26%, T16304C 24%, C150T 35%, 249Del A 29% Phân loại 22 nhóm đơn bội đơn bội với tần số xuất tương ứng là: F1a 16%, M7b1 15%, B4 9%, B5 10%, nhóm có tỷ lệ thấp gặp cá thể 100 mẫu nghiên cứu là: D4, D4a, F1b, F2a, N9a, nhóm Z Tính đa hình nucleotid đơn vùng gen ty thể HV1 HV2 đánh giá hai dân tộc Kinh Mường Việt Nam Từ khóa: DNA ty thể, gen HV1, gen HV2, dân tộc Kinh, dân tộc Mường I ĐẶT VẤN ĐỀ đoạn điều khiển cho trình phiên mã Bộ gen người giải trình tự hồn gen chức vùng mã hóa chỉnh cơng bố hai tạp chí khoa học danh [1] Đây xem vùng xuất nhiều đột tiếng Nature Science vào tháng năm 2001 biến với tần số cao so với vùng Hệ gen người gồm có hai phần: hệ gen nhân khác DNA ty thể, đặc biệt hai vùng (hệ gen nhiễm sắc thể) hệ gen tế bào chất gen HV1 HV2 [3] Sự đa hình trình tự (hệ gen ty thể) Hệ gen ty thể với kích thước DNA ty thể người có ý nghĩa quan trọng 16569 bp biết đến từ năm 1981 sau không nghiên cứu lịch sử mẫu hệ chỉnh sửa lại vào năm 1999, người đại mà có ý nghĩa quan coi trình tự chuẩn (trình tự đối chứng) trọng việc xác định mối quan hệ [1; 2] Về cấu trúc, DNA ty thể người phân chủng tộc vùng địa lý khác [4; tử DNA mạch vòng có kích thước 16569 bp, 5] Ngồi ra, thơng tin trình tự nucleotid bao gồm 37 gen, mã hóa cho 13 polypeptid DNA ty thể có ý nghĩa quan trọng tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 tRNA, chẩn đoán điều trị bệnh di truyền ty rRNA Khoảng 7% DNA ty thể gọi thể, giám định cá thể quan hệ huyết vùng điều khiển D-loop chứa trình tự khởi thống, điều tra tội phạm quản lý nhân đầu cho trình tái DNA ty thể Cho đến nay, có 300 trình tự hồn chỉnh gen ty thể người thuộc Địa liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 23/12/2016 Ngày chấp thuận: 26/2/2017 TCNCYH 106 (1) - 2017 chủng tộc người dân tộc khác nghiên cứu đăng ký Ngân hàng trình tự gen quốc tế (GeneBank) Các cơng bố cho thấy trình tự DNA ty thể chủng 33 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tộc dân tộc khác có khác biệt tổng thể tích 20µl [6] Với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC - hình nên vùng điều khiển D-loop, đặc biệt phút; 30 chu kỳ [94oC- 30 giây, 54oC - 30 giây, vùng gen HV1, HV2 tập trung nghiên 72oC - 30 giây]; 72oC - phút; bảo quản mẫu cứu nhiều cả, có nghiên cứu 15oC dân tộc người Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc chủng tộc người có mối quan hệ địa lý, chủng tộc gần gũi với dân tộc người Việt Nam [7 - 9] Nghiên cứu thực nhằm: xác định tính đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen ty thể HV1 HV2 người dân tộc Kinh dân tộc Mường Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Giải trình tự gen theo qui trình BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Tiến hành máy 3100Avant Genetic Analyzer hãng ABI-PRISM So sánh với trình tự GeneBank để xác định đa hình Kết giải trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự chuẩn J01415 GeneBank (National center for biotechnology information, NCBI) phần mềm phân tích CLC Main Workbench 6.01 để xác định đa Đối tượng 100 mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA) người bình thường, khỏe mạnh thuộc dân tộc Kinh Mường Việt Nam (50 mẫu dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường) hình hai vùng siêu biến HV1 HV2 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu Y học, phê duyệt chấp thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN, ngày Phương pháp 31/1/2013 Hội đồng Đạo đức nghiên DNA tổng số tách chiết từ mẫu cứu y sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội máu toàn phần theo phương pháp sử dụng enzym protease K phenol: chloroform: isoamyl alcohol Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng gen HV1 HV2: HV1-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA III KẾT QUẢ Sau tách chiết, tinh sạch, mẫu DNA kiểm tra chất lượng, nồng độ độ tinh cách đo phổ hấp thụ tử ngoại hai bước sóng 260 nm, 280 nm Các mẫu DNA AAG C -3’ HV1-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA tách chiết đạt nồng độ ≥ 40ng/µl, độ tinh TG -3’ HV2-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA sử dụng làm khuôn để khuếch đại vùng khoảng 1,8 - 2,0, không đứt gẫy gen HV1 HV2 CCA C -3’ HV2-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC đại đoạn gen HV1 từ vị trí nucleotid 15975 đến GCC A -3’ nucleotid 16517, có kích thước 543 bp Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch Thành phần phản ứng PCR: 1X đệm đoạn gen HV2 từ vị trí nucleotide đến nu- PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xi ngược; cleotide 429, có kích thước 422 bp Sản phẩm 0,5unit Taq polymerase; 50ng DNA H O, PCR thu có chất lượng tốt, gồm 34 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC băng đặc hiệu, kích thước phù hợp với tính J01415) để xác định đa hình nuleotid đơn tốn Sản phẩm PCR tiến hành giải trình (SNP) Một số kết giải trình tự gen hai tự gen máy 3100 - Avant Genetic vùng siêu biến HV1 HV2 thể Analyzer hãng ABI - PRISM So sánh với hình hình 2: tín hiệu đỉnh cao, rõ trình tự GeneBank (trình tự chuẩn gen ty thể - nét, không bị nhiễu, tín hiệu đường thấp Hình Hình ảnh giải trình tự số vùng SNP gen ty thể HV1 Hình Hình ảnh giải trình tự số vùng SNP gen ty thể HV2 Kết giải trình tự gen HV1 HV2 100 mẫu nghiên cứu tiến hành so sánh với trình tự chuẩn cho thấy, có nhiều vị trí đa hình so với trình tự chuẩn Mẫu có vị trí đa hình 6, mẫu có nhiều vị trí đa hình 16 Chúng tơi nhận thấy rằng, vị trí đa hình tập trung nhiều gen HV1 Các vị trí đa hình hay gặp mẫu nghiên cứu 315insC 97%, 309insC 50%, C16223T 44%, G16129A 39%, T16189C 32%, đặc biệt hai vị trí đa hình A73G A263G gặp 100% mẫu nghiên cứu Các đột biến thay phổ biến nhất, nucleotid thêm vào thường C nucleotide thường A Các kết TCNCYH 106 (1) - 2017 35 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thu vị trí đa hình hai vùng gen HV1 HV2 phản ánh đa hình cao hai vùng gen Bảng Bảng vị trí đa hình thường gặp gen HV1 HV2 Gen HV1 % Gen HV2 % T16189C 32/100 (32%) A73G 100/100 (100%) A16183C 26/100 (26%) 249DelA 29/100 (29%) C16223T 44/100 (44%) A263G 100/100 (100%) T16172C 30/100 (30%) C150T 35/100 (35%) T16304C 24/100 (24%) 309insC 50/100 (50%) G16129A 39/100 (39%) 315insC 97/100 (97%) Bảng Phân loại theo nhóm đơn bội dựa vị trí đa hình đặc trưng Halogrou p (%) Các SNP đặc trưng (+A73G, A263G) Halogroup (%) Các SNP đặc trưng (+A73G, A263G) B4 (9) T16189C, T16217C G2 (6) C16278T, T16362C B4a (2) T16189C, T16217C, M (6) C16223T B4b (2) T16136C, T16189C, M10 (6) T16311C B5 (10) T16140C, T16189C M7 (2) T146C/A, T199C B5a (5) T16140, T16189C, C16226A, M7b (3) T16297C, T150C, T199C D4 (1) T16362C M7b1 (15) G16129A, C16192T, T16297C, D4a (1) G16129A, T16362C, T152C M7c (3) C16295T, T146C/A, T199C F1a (16) G16129A, T16172C, M9 (2) C16234T, A153G F1b (1) T16189C, T16304C, 249delA N9a (1) C16257A, C16261T, T150C F (3) T16304C, 249delA R9a (4) T16298C, C16355T, T16362C, F2a (1) C16291T, T16304C, 249delA Z (1) C16185T, C16260T, T16298C, Phân nhóm đơn bội DNA ty thể theo Yao cộng năm 2002 (tác giả phân chia nhóm 36 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đơn bội (Haplogroup) dân tộc người Trung Quốc dựa vào vị trí đa hình đặc trưng hai gen HV1 HV2) [7] Kết cho thấy phân loại 22 nhóm đơn bội đơn bội với tần số xuất tương ứng là: F1a 16%, M7b1 15%, B5 10%, B4 9%, B5a 5%, G2, M, M10 6%, R9a 4%, M7c, M7b, F 3%, B4a, B4b, M7, M9 2%, nhóm D4, D4a, F1b, F2a, N9a, Z 1% nhóm có tần số xuất cao nhóm F1a chiếm 16%, nhóm có tần số xuất thấp nhóm D4, D4a, F1b, F2a, N9a, Z 1% IV BÀN LUẬN Những nghiên cứu gần giới Đa hình vị trí T16189C tạo nên vùng phân loại nhóm đơn bội DNA ty thể lặp nucleotid Cystein (poly C) từ vị trí 16183- dựa vào vị trí đa hình đặc trưng DNA 16193 vùng siêu biến HV1 Tỷ lệ đa hình ty thể mà đặc biệt vị trí đa hình gen T16189C thuộc vùng lặp nucleotid Cystein HV1 HV2 Năm 2002, nghiên cứu gen HV1 25,14% đa dạng di truyền 263 người thuộc dân tộc người Trung Quốc vùng lặp nucleotid Cystein gen HV1 phân loại nhóm đơn bội theo có ý nghĩa quan trọng việc giám định vị trí đa hình đặc trưng HV1 HV2, [7] hình gen di truyền quần thể [5] Nghiên Cụ thể tác giả phân loại 42 nhóm cứu chúng tơi cho kết tương tự đơn bội đơn bội nhóm D4 tỷ lệ đa hình SNP T16189C 32% chiếm tỷ lệ cao (27/263), nhóm A chiếm Đa hình vị trí A73G A263G gặp (18/263), nhóm F1a chiếm (15/263), nhóm 100% mẫu nghiên cứu, kết phù hợp có tỷ lệ thấp G2, T1, D, N, B5 (chỉ có với kết nghiên cứu năm 2002 263 1/263 cá thể nghiên cứu) [7] Có kết người thuộc dân tộc người Trung Quốc có lẽ số lượng mẫu, số lượng dân cho thấy đa hình hai vị trí tộc nghiên cứu lớn so với 100% [7] Tỷ lệ đa hình A263G A73G nghiên cứu gặp 100% mẫu nghiên cứu [11] Một Kết nghiên cứu 47 người Việt nghiên cứu năm 1999, 50 người Việt Nam (năm 2009) cho thấy, haplogroup F1a có Nam phát 20 đa hình vị trí tỷ lệ cao 10/47 haplogroup D4 7/47, enzym cắt DNA ty thể, đó, vị trí G2a 6/47, B4 N9a 3/47 [10] Trong enzym HaeII-13Viet, MspI-19Viet, MspI-20Viet nghiên cứu này, phân loại đa hình [12] Năm 2005, giải 22 haplogroups, tỷ lệ haplogroup F1a 100 trình tự vùng gen HV1 HV2 mẫu mẫu nghiên cứu chiếm tỷ dân tộc Kinh, dân tộc Tày dân tộc H’Mông, lệ cao 16% (16/100) Còn lại phát 26 vị trí đa hình HV1 vị haplogroup khác tương ứng là: M7b1 (15%), trí đa hình HV2 [13] B5 (10%), B4 (9%), B5a (5%), G2, M, M10 Nghiên cứu thống kê số vị 6%, R9a (4%), M7c, M7b, F 3%, trí đa hình hay gặp gen HV1 HV2 B4a, B4b, M7, M9 2% nhóm D4, DNA ty thể C16223T (44/100), G16129A D4a, F1b, F2a, N9a, Z 1% (39/100), T16189C (32/100), A73G (100/100), TCNCYH 106 (1) - 2017 37 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC A263G (100/100), 315insC (97/100), 309insC tục nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền (50/100), với tỷ lệ gặp 30%, đặc biệt DNA ty thể dân tộc khác Việt Nam vị trí A73G A263G gặp 100% mẫu nhằm khảo sát đặc điểm gen học Kết tương đồng với kết dân tộc người Việt Nam nghiên cứu tác giả (năm 2008) nghiên cứu 78 người Việt Nam V KẾT LUẬN thống kê 10 vị trí đa hình hay gặp Nghiên cứu đánh giá tính đa T16172C (22/78), A16183C (23/78), T16189C hình đơn nucleotid (SNP) vùng gen HV1 (31/78), C16223T (26/78), T16304 (26/78), HV2 DNA ty thể 50 mẫu dân tộc Kinh C150T (20/78), 249DelA (25/78), A263G 50 mẫu dân tộc Mường (75/78), 315C (24/78), A73G (78/78) vị trí A73G gặp 100% mẫu nghiên cứu, [14] Sự đa hình hai vùng siêu biến HV1 HV2 hầu hết đa hình đơn nucleotid (SNP) Các vị trí đa hình đột biến đồng hốn (transition) - đột biến thay nucleotid có gốc purin (A-G) pyrimidin (C - T); đột biến dị hốn (transversion) - đột biến thay nucleotid có gốc purin thành pyrimidin ngược lại (A T, C - G) Các đa hình hay gặp thay nucleotid, nucleotid chèn vào thường - Tỷ lệ SNP hay gặp gen HV1: C16223T 44%; G16129A 39%; T16189C 32% Tỷ lệ SNP hay gặp gen HV2 : A73G A263G 100%; 315insC 97%; 309insC 50% - Nghiên cứu bước đầu phân loại theo nhóm đơn bội DNA ty thể 50 mẫu nghiên cứu dân tộc Kinh 50 mẫu nghiên cứu dân tộc Mường: Xác định 22 haplogroup nhóm có tần số xuất cao nhóm F1a chiếm 16%, nhóm có tần số xuất thấp nhóm D4, D4a, F1b, F2a, N9a, Z 1% C nucleotid bị thường A Lời cảm ơn [14] Nghiên cứu nhận thấy đa hình thường gặp thay nucleotid C Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên Như vậy, nghiên cứu giải trình tự cứu số số sinh học, trình tự gen ty thể hoàn chỉnh hai gen HV1 HV2 100 mẫu người Việt Nam trưởng thành đột biến gen (50 mẫu nghiên cứu dân tộc Kinh 50 mẫu gây bệnh thalassemia” thuộc đề tài nhiệm vụ dân tộc Mường) Xác định tần suất Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người số đa hình hay gặp hai vùng siêu biến Việt Nam” HV1 HV2 DNA ty thể, phân loại 22 haplogroup dựa theo vị trí đa hình đặc TÀI LIỆU THAM KHẢO trưng hai vùng siêu biến HV1 HV2 Anderson A, Bankier AT, Barrel BG et DNA ty thể Các kết có ý nghĩa al (1981) Sequence and organisation of the human mitochondrial genome Nature, 290, 457 - 465 việc nghiên cứu di truyền quần thể tiến hóa dân tộc Việt Nam Trên sở kết nghiên cứu này, tiếp 38 Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PE TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC et al (1999) Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA Nature Genetics, 23, 147 Horai S, Hayasaka K, Kondo R et al (1995) Recent African origin of modern humans revealed by complete sequences of hominoid mitochondrial DNAs Proc Natl Acad lineages inferred from complete sequences Am J Hum Genet, 73(3), 671 - 676 Fucharoen G, Horai S (2001) Mitochondrial DNA polymorphisms in Thailand J.Hum.Genet, 46 (3), 115 - 125 10 Jin HJ, Chris TS, Kim W, (2009) The peopling of Korea revealed by analyses of Sci USA, 92 (2), 532 - 536 mitochrondrial Denaro M., Blanc H., Johnson MJ et al (1981) Ethnic variation in Hpa endonuclease cleavage patterns of human mitochondrial markers PloS ONE, 4(1), 4210 11 Abd Rashid Nur Haslindawaty., DNA Proc Natl Acad Sci USA, 78, 5768 5772 Chen F., Dang Y., Yan C et al (2009) DNA and Y-chromosomal Sundararajulu Panneerchelvam., Hisham Atan Edinur et al (2010) Sequence polymorphisms of mtDNA HV1, HV2, and HV3 regions in the Malay population of Peninsular Malay- Sequence-length variation of mtDNA HVS-I C- sia Int J Legal Med, 124, 415 - 426 stretch in Chinese ethenic groups J Zhejiang 12 Ivanova R, A.V.T (1999) Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese popula- Univ Sci B, 10(10), 711 - 720 Ingman M, Paabo S, Gyllensten U, (2000) Mitochondrial genome variation and the origin of modern humans Nature, 408 (6831), 708 - 713 Yao YG, Kong QP, Bandelt HJ et al (2002) Phylogeographic Differentiation of Mitochondrial DNA in Han Chinese Am J Hum Genet, 70, 635 – 651 Kong QP, Yao YG, Sun C (2003) Phylogeny of East Asian mitochrondrial DNA tion European Journal of Immunogenetics, 26, 417 - 422 13 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tơn, (2005) Phân tích trình tự vùng điều khiển (D - LOOP) genome ty thể cá thể người Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(1), 15 - 22 14 Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Thị Tú Linh, Vũ Hải Chi (2008) Đa hình đơn bội DNA ty thể cá thể người Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4), 579 - 590 Summary SINGLE NUCLEOTID POLYMORPHISMS OF MITOCHONDRIAL DNA HV1 AND HV2 GENE OF KINH AND MUONG ETHNIC IN VIETNAM The study was carried out to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) of the HV1 and HV2 on Kinh and Muong people in Vietnam (50 Kinh samples, 50 Muong samples) Sequencing method was used to analyze 100 DNA samples of Kinh and Muong The results were compared with the rCRS sequence, reported in the Human mitochondrial database and then classified those sequences into the mitochondrial DNA haplogroups It was found that the frequencies of SNP A73G and A263G were 100%, 315insC was 97%, 309insC was 50%, C16223T was 44%, G16129A was 39%, T16189C was 32%, T16172C was 30%; A16183C was 26%, T16304C was 24%, C150T was 35%, 249DelA was 29% We found 22 haplogroups or subhaplogroups: the haplogroup F1a with frequency of 16%, M7b1 15%, B4 9%, B4a 2%, B5 10%, D4, D4a, F1b, F2a, TCNCYH 106 (1) - 2017 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC N9a and Z haplogroup frequencies was the lowest, 1% In conclusion, we have assessed the single nucleotid polymorphisms of mitochondrial DNA HV1 and HV2 of 100 Kinh and Muong ethnic samples Key words: mtDNA, HV1 gene, HV2 gene, Kinh ethnic, Muong ethnic 40 TCNCYH 106 (1) - 2017 ... tộc gần gũi với dân tộc người Việt Nam [7 - 9] Nghiên cứu thực nhằm: xác định tính đa hình nucleotid đơn (SNP) vùng gen ty thể HV1 HV2 người dân tộc Kinh dân tộc Mường Việt Nam II ĐỐI TƯỢNG VÀ... TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thu vị trí đa hình hai vùng gen HV1 HV2 phản ánh đa hình cao hai vùng gen Bảng Bảng vị trí đa hình thường gặp gen HV1 HV2 Gen HV1 % Gen HV2 % T16189C 32/100 (32%) A73G 100/100... mẫu máu ngoại vi (chống đơng EDTA) người bình thường, khỏe mạnh thuộc dân tộc Kinh Mường Việt Nam (50 mẫu dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường) hình hai vùng siêu biến HV1 HV2 Đạo đức nghiên cứu