Xác định đa hình thái gen TY thể HV1 và HV2 ở một số nhóm người thuộc dân tộc kinh và dân tộc mường người VN

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vùng siêu biến HV1, HV2 (Hypervariable region 1, 2) đoạn DNA nằm vùng điều khiển DNA ty thể Đây vùng có tần số đột biến cao hệ gen ty thể người [1] Do đó, có nhiều nghiên cứu tập trung tìm hiểu mối liên hệ với loại bệnh tật bệnh ung thư, bệnh di truyền, bệnh cơ, bệnh thần kinh… Hiện nay, người ta thống kê 150 bệnh di truyền khác DNA ty thể định [2] Các bệnh rối loạn DNA ty thể thường biểu đa dạng, liên quan đến rối loạn trình tổng hợp protein chúng đơn biểu đột biến điểm nucleotid Như vậy, tính đa hình/ đột biến DNA ty thể có liên quan đến nhiều loại bệnh tật khác Vì vậy, kết nghiên cứu tính đa hình DNA ty thể sở khoa học cần thiết cho nghiên cứu bệnh lý di truyền liên quan đến DNA ty thể Trong năm gần đây, hướng nghiên cứu sử dụng DNA ty thể thị sinh học phát triển nhanh DNA ty thể với đặc điểm ưu tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, khơng tái tổ hợp, số lượng lớn đồng đã, công cụ hữu hiệu nghiên cứu y học, sinh học phân tử di truyền học…[3] Các kết quan tâm nhiều đa hình vùng điều khiển D-loop, đặc biệt hai vùng siêu biến HV1và HV2 Ở Việt Nam nghiên cứu DNA ty thể người, vùng điều khiển D - loop đặc biệt hai vùng siêu biến HV1, HV2 triển khai năm gần đây, nhiên mang tính đơn lẻ Vì vậy, đề tài nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích: - Xác định tỷ lệ số đa hình thái gen ty thể HV1 HV2 đối tượng nghiên cứu thuộc dân tộc Kinh dân tộc Mường người Việt Nam - Phân loại nhóm đơn bội DNA ty thể đôi tượng nghiên cứu thuộc dân tộc Kinh dân tộc Mường người Việt Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu tính đa hình thái đơn nucleotid (SNP) Hệ gen người giải trình tự cơng bố hai tạp chí khoa học danh tiếng Nature Science vào tháng năm 2001 tạo cột mốc vô quan trọng sinh học phân tử Trình tự hệ gen sau cơng khai để nhà khoa học khắp giới tiếp cận sử dụng Trình tự xem “trình tự chuẩn” hay “trình tự tham chiếu” giúp tiếp tục đến với nghiên cứu sâu Hệ gen người có biến thể di truyền khác làm nên khác biệt người với người Kết quan trọng sau có đồ gen người cho thấy rằng, chủng tộc, cá thể người giống đến 99,9% khác tỷ lệ nhỏ (0,1%) cấu trúc hệ gen Tuy nhiên, phần khác biệt nhỏ lại có ý nghĩa định đặc điểm nhân chủng học dân tộc, yếu tố di truyền liên quan đến sức khỏe dân tộc cá thể Trong 0,1% khác biệt hai người có đến 80% điểm đa hình vị trí nucleotid định làm thay đổi mã di truyền, điểm khác biệt gọi điểm đa hình đơn nucleotid (Single Nucleotid Polymorphinsms - SNP) SNP loại biến đổi di truyền phổ biến nhất, đại diện cho khác biệt nucleotid hệ gen người SNP diễn bình thường DNA người, chúng xảy trung bình lần 300 nucleotid Như vậy, có khoảng 10 triệu SNP gen người Các SNP trung tâm thông tin Công nghệ sinh học (NCBI), dự án quốc tế HapMap tiến hành thống kê cách đầy đủ có hệ thống Cho đến có 62.676.337 SNP người xác định (http://ncbi.nlm.nih.gov tháng năm 2013) Các dạng đa hình đơn nucleotid xuất vùng mã hóa, vùng khơng mã hóa protein vùng hai khu vực mã hóa khơng mã hóa SNP làm thay đổi mã di truyền không làm thay đổi mã di truyền Các SNP sử dụng dấu ấn sinh học giúp nhà khoa học xác định gen có liên quan đến bệnh tật để theo dõi di truyền bệnh Các SNP dạng đột biến gen tạo nên đa dạng mặt di truyền cá thể loài người, yếu tố có nguy cao gây phát sinh, đáp ứng với tác nhân gây bệnh, đáp ứng với thuốc điều trị bệnh bệnh lỗng xương [4], thiếu máu hồng cầu hình liềm, β-Thalassemia, xơ nang hóa, bệnh thần kinh thị giác Leber… Do đó, việc nghiên cứu SNP vơ quan trọng, cụ thể có nhiều SNP sử dụng làm công cụ hữu ích lĩnh vực y học, dược học, hình sự, nghiên cứu di truyền… Nghiên cứu tính đa hình di truyền người ngày vấn đề nhà khoa học quan tâm nhằm hiểu rõ mối liên hệ gen bệnh Có hai hướng nghiên cứu chính: Hướng thứ tập trung nghiên cứu hình thái tương đồng giải phẫu, lập phả hệ nghiên cứu di truyền tế bào; hướng thứ hai nghiên cứu di truyền phân tử Theo hướng thứ nhất, nghiên cứu hình thái chủ yếu dựa đặc điểm giải phẫu như: màu mắt, màu da, tầm vóc… Các nghiên cứu theo phương pháp lập phả hệ cho phép theo dõi di truyền bệnh qua hệ, đồng thời xác định bệnh gen trội hay lặn chi phối, bệnh liên quan đến giới tính hay khơng…Phương pháp xác định đặc điểm di truyền số bệnh như: bệnh Hemophilia, bệnh mù màu, bệnh thần kinh thị giác…Phương pháp di truyền tế bào sở phân tích NST mang lại nhiều thành tựu cho di truyền y học chẩn đoán sớm trước sinh bệnh: Hội chứng Down, Hội chứng Patau, bệnh khuyết tật ống thần kinh… Hướng thứ hai nghiên cứu sinh học phân tử Với phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử, kỹ thuật DNA ngày phát triển, phương pháp đời sử dụng enzym cắt giới hạn, kỹ thuật DNA tái tổ hợp, giải trình tự DNA đặc trưng cá thể, giúp phát đa hình di truyền phân tử hệ gen, so sánh khác biệt hệ gen người với người khác từ nhằm tìm hiểu mối liên quan DNA với bệnh Sự tồn đa hình phân tử quần thể người lần nhà khoa học Hirszfeld (năm1919) chứng minh nghiên cứu kháng nguyên nhóm máu ABO Trước đây, phương pháp miễn dịch học phương pháp phù hợp cho việc phát đa hình di truyền Pauling cộng đưa phương pháp điện di để tách đột biến khác Hemoglobin [5], phương pháp ứng dụng rộng rãi để phân tích tính đa hình protein máu Đến năm 1986, kỹ thuật PCR phát triển việc nghiên cứu tính đa hình DNA trở nên dễ dàng thuận tiện nhiều Sau đó, vào năm 90 kỷ XX, phát triển kỹ thuật đọc trình tự DNA máy tự động mở nhiều ứng dụng nghiên cứu tính đa hình DNA Trong năm qua, thành tựu công nghệ di truyền phân tử mở kỷ nguyên cho nghiên cứu mối liên quan bệnh tật với tính đa hình DNA, với đột biến DNA Các nhà khoa học ứng dụng thị DNA: RFLP, nhiễm sắc thể Y, DNA ty thể, SNPs,… nhiều lĩnh vực sinh học, dược học đặc biệt y học Nhờ vậy, mà số bệnh làm sáng tỏ chế gây bệnh, mức độ nguy cơ, đáp ứng với thuốc điều trị,….Điều có ý nghĩa lớn lĩnh vực y học: chẩn đoán, điều trị dự phòng bệnh tật 1.2 Đặc điểm đa hình DNA ty thể 1.2.1 Ty thể Ty thể bào quan có hình tròn hình trụ dài, toàn cấu trúc ty thể bao bọc hai lớp màng cấu tạo protein lớp phospholipid kép Không gian bên chứa chất nền, sợi DNA ty thể, ribosom… Ty thể trung tâm hô hấp tế bào, nơi sản sinh ATP, cung cấp lượng cho tế bào Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả tự sinh sản cách phân đôi ty thể mẹ để sinh ty thể con, [6] 1.2.2 Cấu trúc DNA ty thể DNA ty thể có cấu trúc sợi kép, mạch vòng khơng liên kết với protein histon, nằm chất ty thể chiếm khoảng 5% tổng số DNA tế bào Mỗi ty thể có từ đến 10 DNA tế bào có hàng trăm, hàng ngàn DNA ty thể, số phụ thuộc vào mức độ chuyển hóa tế bào, tế bào nhiều hoạt động chuyển hóa nhiều DNA ty thể Trình tự DNA ty thể hoàn chỉnh người Anderson đồng tác giả khác công bố năm 1981 Cambridge gọi trình tự chuẩn Cambridge (Cambridge Reference Sequence, CRS), [7] Đến năm 1999, Andrews tác giả chỉnh sửa lại trình tự gọi “trình tự chuẩn Cambridge chỉnh sửa - rCRS”, [8] DNA ty thể có kích thước 16569 bp, mã hóa cho 37 gen, gồm hai chuỗi khác thành phần nucleotid: chuỗi nặng có chứa nhiều guanin, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosin Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã hóa cho gen Trong số 37 gen có 22 gen mã hóa cho 22 tRNA, gen mã hóa cho rRNA 13 gen mã hóa cho 13 polypeptid thành phần phức hệ chuỗi hơ hấp tế bào Các chuỗi polypeptid lại cần thiết cho cấu trúc chức ty thể mã hóa gen nhân tổng hợp ribosom tế bào chất Có thể thấy hệ gen ty thể người gọn hầu hết tham gia vào mã hóa gen Đa số gen phiên mã từ chuỗi nặng, trừ tiểu phần ND6 phức hệ I (NADH dehydrogenase) phân tử tRNA phiên mã từ chuỗi nhẹ Vùng khơng mã hóa DNA ty thể vùng điều hòa hay gọi vùng D-loop, chiếm khoảng 7% chiều dài ty thể gồm 1121 bp, chứa trình tự khởi đầu chép hai chuỗi nặng nhẹ Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo chi tiết DNA ty thể người (Theo Alexeyv M cộng sự) Chú thích: Phân tử DNA mạch vòng, kép, kích thước 16569 bp.Chuỗi nhẹ nằm phía chuỗi nặng nằm phía ngồi Vị trí gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptid, RNA ribosom (12S 16S) 22 RNA vận chuyển biểu diễn tương ứng hình trên.Vùng điều khiển D-loop chứa điểm khởi đầu chép, promoter chuỗi nặng, nhẹ chứa vùng siêu biến HV1 HV2 1.2.3 Gen HV1 HV2 DNA ty thể 1.2.3.1 Vùng điều khiển D-loop Ở người vùng điều khiển DNA ty thể gọi vùng D - loop (Displacement loop) vùng hệ gen ty thể khơng mã hóa protein Vùng D-loop chiếm khoảng 7% tổng lượng DNA ty thể, chứa trình tự khởi đầu cho trình tái DNA ty thể đoạn điều khiển cho trình phiên mã gen chức vùng mã hóa [9] Vùng D-loop có chiều dài khoảng 1,1kb, nằm từ vị trí 16024 - 16569/0 - 576 hai gen tRNA vận chuyển cho Phenyanalin Prolin Do khơng mang gen mã hóa nên vùng xem vùng xuất nhiều đột biến với tần số đột biến cao vùng khác hệ gen ty thể, nói cao nhất, cao vùng khác từ 1,8 đến 4,4 lần [10] Trình tự hồn chỉnh vùng D-loop nhiều dân tộc thuộc châu lục giới cơng bố (http://www.mitomap.org), có có vài nghìn trình tự vùng D-loop cơng bố Năm 2003, Ingman Gyllensten thơng báo có 186 trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể người thuộc chủng tộc khác nghiên cứu đăng ký ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL/Genbank/DDBJ [11] Đến nay, có 5189 trình tự hồn chỉnh hệ gen ty thể người thuộc chủng tộc người khác nghiên cứu công bố (MITOMAP, 2008) Số lượng trình tự D- loop toàn hệ gen ty thể cá thể người thuộc dân tộc khác giới giải mã tăng lên không ngừng Tuy nhiên, với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng siêu biến HV1 HV2 tập trung nghiên cứu nhiều 1.2.3.2 Vùng siêu biến HV1, HV2 Năm 1981, Anderson cộng xác định hai đoạn DNA vùng D-loop gọi vùng siêu biến (HV1- Hypervariable region 1) có kích thước 359bp, nằm vị trí 16024 - 16383 vùng siêu biến (HV2Hypervariable region 2) có kích thước 315bp, nằm vị trí 57- 372 [7] Với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng tập trung nghiên cứu nhiều cả, đặc biệt vùng siêu biến Vị trí hai vùng siêu biến HV1, HV2 thể hình đây: Hình 1.2: Vị trí vùng siêu biến HV1, HV2 vùng D-loop DNA ty thể Ở số cá thể vùng siêu biến HV1, HV2 có đoạn lặp lại liên tiếp nucleotid Cytosin, thường gọi đoạn poly C Ở gen HV1 đoạn poly C nằm từ vị trí 16183 – 16193 gen HV2 đoạn poly C nằm từ vị trí 303 -327 Ở trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh người Anderson cộng công bố vào năm 1981 [7] - trình tự chuẩn CRS, đoạn poly C gen HV1 ngắt quãng nucleotid Thymin vị trí 16189 Tuy nhiên, nhiều trình tự DNA ty thể có đột biến T16189C tạo thành chuỗi có 10 nucleotid Cystosin liên tiếp Đột biến T16189C xem đột biến có tốc độ cao hệ gen ty thể người [12] Các nghiên cứu cho thấy, tế bào, có nhiều loại DNA ty thể có chiều dài trình tự đoạn poly C khác Đây tượng “dị tế bào chất” đoạn poly C Tỷ lệ phần trăm phân tử DNA ty thể mang độ dài đoạn poly C khác ổn định cá thể, di truyền theo dòng mẹ tạo q trình phát triển [13] Việc phân tích đa hình di truyền DNA ty thể nhằm làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền cá thể, đồng thời nghiên cứu mối liên quan DNA ty thể với bệnh di truyền theo dòng mẹ Đa số nghiên cứu dựa 10 tính đa hình vùng điều khiển D- loop Do tần số đột biến cao vùng D- loop, đặc biệt vùng siêu biến HV1và HV2 nên thu hút tập trung nghiên cứu mối liên quan với bệnh ung thư, bệnh cơ, bệnh thần kinh, bệnh lão hóa… (Phụ lục 1) Đa số nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ định bệnh với trạng thái “dị tế bào chất” DNA ty thể bệnh nhân [14] Mặc dù, nghiên cứu vùng siêu biến HV1 HV2 thực nhiều năm gần đây, người ta chưa tìm thấy mối liên quan vùng siêu biến HV1 vùng siêu biến HV2 DNA ty thể Các nghiên cứu khác đánh giá tốc độ đột biến liên quan tới di truyền vùng HV1 HV2 gây tranh cãi Do DNA ty thể không tái tổ hợp nên tồn phân tử DNA có lịch sử tiến hóa chung Tuy nhiên, hai vùng HV1 HV2 lại có tốc độ đột biến khác khác tốc độ đột biến đủ lớn yếu tố đa hình hai vùng siêu biến phản ánh trình tiến hóa khác [15] Có nhiều loại đột biến vùng điều khiển DNA ty thể: đột biến thay thế, đoạn, thêm đoạn hay gặp loại đột biến thay nucleotid Tốc độ đột biến DNA ty thể cao vùng D-loop, đặc biệt vùng siêu biến HV1và HV2, tốc độ phụ thuộc vào vị trí nucleotid khác [3] Một vài vị trí nucleotid vùng điều khiển bị đột biến thường xuyên vị trí khác gọi vùng đột biến phổ biến (mutational hotspots) [16] Việc nghiên cứu hệ gen ty thể, giải mã trình tự nucleotid vùng điều khiển D- loop gen khác DNA ty thể, dẫn đến việc giải mã toàn hệ gen ty thể nhiều đại diện dân tộc người khác giới, với nghiên cứu đặc điểm, tính đa hình thái vùng siêu biến HV1 HV2 cung cấp số liệu cần thiết cho nghiên cứu y học, di truyền học nhiều lĩnh vực có liên quan khác 162 159 C-G T-A non-coding non-coding - + + 152 T-C non-coding + + 150 148 C-T A-G non-coding non-coding + - + + 146 146 137 125 124 122 121 117 115 114 112 107 106 100 98 97 T-C T-C A-G T-C G-A C-T G-A T-C T-C C-T C-T G-del G-A G-A C-del G-A non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding + + + + + - + + + + + + + + + + + POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle aging brains, elderly fibroblasts, ovarian carcinoma, breast tumor elderly fibroblasts/leukocytes, lung, thyroid, prostate tumors control skeletal muscle elderly fibroblasts, aging/AD brains, POLG/PEO & control muscle, prostate tumor ovarian carcinoma POLG/PEO muscle POLG/PEO & control muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle control skeletal muscle thyroid tumor POLG/PEO muscle, bladder tumor back-mutation control skeletal muscle thyroid tumor prostate tumor POLG/PEO muscle thyroid tumor POLG/PEO muscle 1 1 1 1 1 94 92 91 84 80 74 74 74 G-A G-A C-T A-G C-A T-A T-G G-A non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding + + + + + + + + - 73 72 67 66 64 64 62 59 A-G T-C G-A G-A C-T C-A G-C T-C non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding non-coding + - + + + + + + + + prostate tumor aging brains control skeletal muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle head/neck tumor aging brains, POLG/PEO & control muscle, buccal cell, thyroid & prostate tumors aging brains, POLG/PEO & control muscle POLG/PEO muscle POLG/PEO muscle aging brains POLG/PEO muscle aging brains control skeletal muscle 1 1 1 1 1 PHỤ LỤC 2: Kết đo OD mẫu nghiên cứu (a) Dân tộc Mường Mẫu nghiên cứu Nồng độ DNA (ng/μl) A260/280 M1 54.5 1.84 M2 163.1 1.90 M3 65.1 1.83 M4 37.9 1.83 M5 39.7 1.95 M6 58.8 1.90 M7 79.9 1.91 M8 51.4 1.98 M9 295.0 1.93 M10 82.3 1.94 M11 37.0 1.83 M12 63.5 1.96 M13 59.2 1.94 M14 80.1 1.93 M15 78.9 1.94 M16 56.7 1.89 M17 190.5 1.92 M18 73.4 1.97 M19 101.4 1.93 M20 118.5 1.90 M21 43.1 2.02 M22 112.3 1.93 M23 46.1 1.91 M24 86.0 1.95 M25 72.0 1.92 M26 80.8 1.94 M27 80.1 1.82 M28 41.2 1.96 M29 88.4 1.93 M30 84.6 1.83 M31 62.5 1.86 M32 61.2 1.94 M33 127.3 1.92 M34 139.1 1.89 M35 94.7 1.92 M36 118.4 1.83 M37 58.1 1.90 M38 46.8 1.92 M39 44.7 2.01 M40 88.0 1.93 M41 83.3 1.95 M42 74.6 1.93 M43 129.8 1.91 M44 37.4 2.02 M45 93.4 1.89 M46 56.4 1.95 M47 176.3 1.91 M48 165.3 1.91 M49 128.6 1.92 M50 112.2 1.91 (b) Dân tộc Kinh Mẫu nghiên cứu Nồng độ DNA (ng/μl) Tỷ lệ A260/280 K1 75.1 1.86 K2 57.3 1.86 K3 37.8 1.85 K4 59.6 1.89 K5 50.2 1.87 K6 42.3 1.87 K7 55.5 1.89 K8 73.1 1.88 K9 44.0 1.89 K10 48.6 1.91 K11 51.8 1.88 K12 43.9 1.84 K13 14.6 2.00 K14 45.3 1.92 K15 76.4 1.82 K16 47.3 1.87 K17 48.2 1.90 K18 45.2 1.90 K19 49.9 1.81 K20 42.0 1.89 K21 49.3 1.84 K22 42.0 1.90 K23 37.5 1.92 K24 39.7 1.83 K25 44.7 1.91 K26 39.0 1.87 K27 47.3 1.91 K28 43.0 1.91 K29 45.8 1.86 K30 49.3 1.85 K31 43.7 1.87 K32 45.4 1.88 K33 42.3 1.87 K34 56.3 1.89 K35 42.0 1.87 K36 50.1 1.88 K37 38.9 1.88 K38 51.3 1.87 K39 49.9 1.88 K40 50.5 1.87 K41 55.4 1.86 K42 39.0 1.89 K43 39.3 1.89 K44 40.0 1.90 K45 57.1 1.88 K46 49.0 1.90 K47 46.6 1.89 K48 69.2 1.90 K49 45.9 1.86 K50 63.7 1.89 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN TH THY HNG XáC ĐịNH TíNH ĐA HìNH THáI GEN TY THể HV1 Và HV2 MộT Số NHóM NGƯờI THUộC DÂN TộC KINH Và DÂN TộC MƯờNG NGƯờI VIệT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60720106 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến GS.TS Tạ Thành Văn – Phó Hiệu trưởng, Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội người Thầy tận tình báo, hướng dẫn bổ sung kiến thức cần thiết cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Trần Vân Khánh – Phó Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, tồn thể Thầy Cơ, anh, chị bạn học viên Trung tâm tạo điều kiện hướng dẫn, giúp đỡ q trình học tập kỹ thuật, hồn thiện quy trình kỹ thuật phân tích kết Trung tâm Xin cảm ơn thầy cô Hội đồng chấm khóa luận tồn thể thầy mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, nhiệt tình bảo, tạo điều kiện củng cố thêm nhiều kiến thức cho trình thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo bạn bè đồng nghiệp Bệnh viện 19/8 tạo điều kiện cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ln ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2014 Học viên cao học khóa 21 Trần Thị Thúy Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Thị Thúy Hằng, học viên cao học khóa XXI Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy GS.TS Tạ Thành Văn Công trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2014 Học viên Trần Thị Thúy Hằng KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài Nhánh cấp nhà nước “Đánh giá số sinh học, xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia giải trình tự gen ty thể người Việt Nam” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” Chủ nhiệm Đề tài nhánh TS Trần Vân Khánh Chủ nhiệm đề tài Quỹ gen PGS.TS Nguyễn Đức Hinh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pair (cặp bazơ) ddNTP : Dideoxyribonucleotid triphosphat D-loop : Displacement loop DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotid triphosphat EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid HV : Hypervariable Region (vùng siêu biến) kb : Kilo base NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học) NST : Nhiễm sắc thể PBS : Phosphat- buffer saline PCR : Polymerase chain reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SNP : Single Nucleotide Polymorphinsms MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu tính đa hình thái đơn nucleotid 1.2 Đặc điểm đa hình DNA ty thể 1.2.1 Ty thể 1.2.2 Cấu trúc DNA ty thể 1.2.3 Gen HV1 HV2 DNA ty thể 1.2.4 Đặc điểm di truyền ứng dụng DNA ty thể y học 12 1.2.5 Một số phương pháp phát đa hình thái gen ty thể 19 1.2.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể người Việt Nam 25 1.3 Một số đặc điểm dân tộc dân tộc người Việt Nam 27 1.3.1 Dân tộc Kinh 28 1.3.2 Dân tộc Mường 28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.3 Phương tiện nghiên cứu 30 2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị 30 2.3.2 Hoá chất 31 2.4 Kỹ thuật nghiên cứu 32 2.4.1 Tách chiết DNA 32 2.4.2 Phương pháp quang phổ 33 2.4.3 Điện di DNA sau tách chiết 34 2.4.4 Phản ứng PCR nhân đoạn gen HV1, HV2 35 2.4.5 Giải trình tự đoạn HV1 HV2 36 2.4.6 Phân tích trình tự đoạn HV1 HV2 phần mềm 37 2.5 Vấn đề đạo đức đề tài 37 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Tách chiết DNA tổng số 39 3.2 Kết khuyếch đại đoạn gen HV1, HV2 DNA ty thể 40 3.3 Kết Sequencing đoạn gen HV1, HV2 41 3.4 Kết phân tích đa hình gen HV1 HV2 44 3.4.1 Phân chia nhóm đơn bội dân tộc Việt Nam 44 3.4.2 Các vị trí đa hình thường gặp mẫu nghiên cứu 50 3.4.3 Tổng số đa hình mẫu nghiên cứu 51 Chương 4: BÀN LUẬN 53 4.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 53 4.2 Tách chiết DNA 54 4.3 Khuếch đại đoạn gen HV1 HV2 DNA ty thể 55 4.4 Phân tích đa hình gen ty thể HV1 HV2 số dân tộc người Việt Nam phương pháp giải trình tự gen 57 KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân chia nhóm đơn bội DNA ty thể dựa vào vị trí đa hình đặc trưng gen HV1 HV2 16 Bảng 3.1: Phân chia nhóm đơn bội dạng SNP gen HV1, HV2 mẫu nghiên cứu 45 Bảng 3.2: Bảng tần suất theo Haplogroup 49 Bảng 3.3: Bảng vị trí đa hình thường gặp gen HV1 HV2 50 Bảng 3.4: Tổng số đa hình mẫu nghiên cứu 51 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo chi tiết DNA ty thể người Hình 1.2: Vị trí vùng siêu biến HV1, HV2 vùng D-loop DNA ty thể Hình 1.3: Chu trình PCR dạng sơ đồ 21 Hình 1.4: Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 23 Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 39 Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen HV1 40 Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen HV2 40 Hình 3.4: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (C16257A, C16261T, C16223T) vùng gen ty thể HV1 41 Hình 3.5: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (G16213A, T16217C, C16192T) vùng gen ty thể HV1 42 Hình 3.6: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (T16311C, C16278T, C16291A, T16298C) vùng gen ty thể HV1 42 Hình 3.7: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (T199C, 309insC, 315insC) vùng gen ty thể HV2 43 Hình 3.8: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (249DelA, A263G, T146C, C150T) gen ty thể HV2 43 Hình 3.9: Hình ảnh giải trình tự vùng SNP (T152C, 309insCC, 315insC) vùng gen ty thể HV2 44 7,21,23,41-44 1-6,8-20,22,24-40,45-82,87-1-6,8-20,22,24-37,45-7,9,21,23,38-44 ... quốc gia đa dân tộc (54 dân tộc) Dân tộc Kinh chiếm 87% dân số lại dân tộc người phân bố rải rác địa bàn nước Tính cố kết dân tộc, hòa hợp dân tộc cộng đồng thống trở thành truyền thồng dân tộc Việt... dựa vào vị trí đa hình đặc trưng hai gen HV1 HV2 [30] Cụ thể nhóm đơn bội vị trí đa hình đặc trưng chúng gen HV1 HV2 trình bày bảng sau: 16 Bảng 1.1: Phân chia nhóm đơn bội DNA ty thể dựa vào... tộc Kinh dân tộc Mường người Việt Nam - Phân loại nhóm đơn bội DNA ty thể đôi tượng nghiên cứu thuộc dân tộc Kinh dân tộc Mường người Việt Nam 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nghiên cứu tính đa