NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THư vú

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Tú Linh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ GEN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ VÚ Chuyên ngành: Mã số: Nhân chủng học 62310302 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2016 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Sinh lý học Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trịnh Hồng Thái PGS TS Tạ Văn Tờ Phản biện:………………………………………… Phản biện:………………………………………… Phản biện:………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại……………………………………… vào hồi: ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ung thư vú loại ung thư phổ biến nguyên nhân gây tử vong hàng đầu loại ung thư nữ giới (Globocan 2012), nhiên, tỉ lệ sống sót cải thiện bệnh nhân chẩn đoán giai đoạn sớm bệnh (Anderson, 2008) Đối với sàng lọc chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh thăm khám vú phương pháp chuẩn lâm sàng (Vahabi, 2003), nhiên nguy phát dương tính giả cao (Elmore, 2010) Điều cho thấy cần phải có thị sinh học đặc hiệu sàng lọc phát sớm bệnh ADN ty thể từ lâu cho có mối liên quan với trình phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), có thay đổi số lượng sao, biến đổi mức độ biểu hoạt động tiểu đơn vị chuỗi hô hấp đột biến điểm ADN ty thể (Tseng, 2006; Fan, 2009) Tuy nhiên, kết nghiên cứu nhóm bệnh nhân khác gây tranh cãi Trên đối tượng bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về biến đổi gen ty thể chưa có tính hệ thống Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi số gen ty thể bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp liệu có tính hệ thống ban đầu biến đổi số gen ty thể, bao gồm biến đổi số ADN ty thể, mức độ đoạn lớn, biến đổi gen ATP6, tARN, ND1 ND3, đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam; (2) Xác định mối liên quan biến đổi với đặc điểm bệnh học ung thư vú Kết thu luận án tiền đề phát triển để sử dụng đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng bệnh Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ VÚ 1.1.1 Tình hình mắc ung thƣ vú giới Việt Nam Trong loại ung thư nữ giới, ung thư vú dạng ung thư phổ biến nguyên nhân gây tử vong hàng đầu toàn giới Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010) 1.1.2 Các yếu tố nguy gây ung thƣ vú Các yếu tố nguy cho nguyên nhân gây ung thư vú bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, hóa chất gây ung thư, chế độ ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh số yếu tố sinh sản nữ giới Các yếu tố gây đột biến gen tiền ung thư gen ức chế ung thư, từ gây ổn định tế bào sửa chữa lỗi di truyền dẫn đến hoạt hóa gen gây ung thư 1.1.3 Các giai đoạn ung thƣ vú Đánh giá giai đoạn ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại TNM, dựa vào kích thước mức độ lan rộng khối u thể qua yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch vùng M (Metastase) – di xa (Edge, 2010) 1.1.4 Các thị sinh học ung thƣ vú Các thị sinh học ung thư vú áp dụng chủ yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp theo dõi điều trị (Ludwig, 2005) Thăm khám vú chụp nhũ ảnh phương pháp chuẩn sàng lọc chẩn đoán sớm, nhiên lại có tỉ lệ phát dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010) Do đó, cần phải tìm kiếm thị sinh học đặc hiệu sử dụng sàng lọc phát sớm bệnh 1.2 TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƢỜI ADN ty thể phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37 gen mã hóa cho 13 protein phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa (OXPHOS), 22 tARN rARN 1.3 BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ Biến đổi gen ty thể cho có liên quan với trình tạo u tế bào ung thư sử dụng đường OXPHOS so với tế bào bình thường (Warburg, 1956) Biến đổi bao gồm: thay đổi số ADN ty thể, giảm biểu gen ty thể biến đổi hoạt tính enzyme ty thể đột biến soma đột biến dòng mầm ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon, 2006) 1.4 MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ VÚ 1.4.1 Biến đổi số ADN ty thể Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương tế bào ung thư, ty thể thay đổi số lượng ADN chúng để phản ứng lại với tượng (Pelicano, 2004) Đối với ung thư vú, số ADN ty thể cho giảm mô u so với mô không ung thư (Tseng, 2006) có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình trạng thụ thể estrogen progesteron, kích thước khối u (Yu, 2007; Fan, 2009; Bai, 2011) Ngược lại, số ADN ty thể có xu hướng tăng mẫu máu bệnh nhân ung thư vú so với đối chứng cho có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen, 2009; Lemnrau, 2015) Các kết gây tranh cãi nhiều điều cần làm sáng tỏ 1.4.2 Mất đoạn lớn ADN ty thể Hệ gen ty thể đặc trưng số trình tự lặp đóng vai trò điểm cắt để tạo đoạn lớn ADN ty thể (Dakubo, 2010) Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977), dạng biến đổi thường gặp nhất, tạo phân tử ADN ty thể nhỏ bình thường chép tích lũy với tỉ lệ khác mô sau nguyên phân Trong nghiên cứu Zhu (2004), ∆mtDNA4977 cho không đặc trưng ung thư vú Ngược lại, ∆mtDNA4977 tìm thấy 28/60 mẫu mô vú thường (47%) có 3/60 mẫu u (5%) có đoạn (Tseng, 2006) Các kết thu nhiều mâu thuẫn, cần phải tiếp tục nghiên cứu để đưa kết luận xác 1.4.3 Biến đổi gen ATP6 Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 ADN ty thể, mã hóa cho đơn vị a tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát thấy có biến đổi gen ATP6 Tuy nhiên, số nghiên cứu khác lại phát thấy tỉ lệ biến đổi gen ATP6 khoảng từ 72% – 82,14%, có số biến đổi cho làm tăng nguy mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a; Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016) 1.4.4 Biến đổi gen tARN ty thể Đột biến gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính aminoacyl hóa phân tử tARN, từ ảnh hưởng đến trình tổng hợp biểu protein chức enzyme OXPHOS (Abbott, 2014) Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Grzybowska-Szatkowska (2012) cho biến đổi A15924G, A12308G, T7581C, A8348G, T10034C T10463C có mối liên quan với ung thư vú Ngược lại, Meng (2015) cho biến đổi T7581C A12308G có vai trò tiềm biểu lâm sàng ung thư vú, biến đổi khác không Có thể thấy hiểu biết vai trò biến đổi gen tARN ty thể bệnh ung thư vú hạn chế, gây khó khăn việc dự đoán tác động đến biểu hiệu lâm sàng bệnh 1.4.5 Biến đổi gen ND3 Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine thành Alanine sản phẩm gen ND3 ty thể Các nghiên cứu trước phân tích mối liên quan biến đổi A10398G nguy mắc ung thư vú, nhiên kết thu mâu thuẫn gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007) 1.4.6 Biến đổi gen ND1 Gen ND1 ty thể mã hóa cho tiểu đơn vị phức hệ hô hấp I bước chuỗi vận chuyển điện tử ty thể Biến đổi gen ND1 cho làm thay đổi cấu trúc chức protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ thúc đẩy trình phát sinh khối u Một số biến đổi gen ND1 báo cáo có liên quan với ung thư vú T3398C, T4216C, A3796G coi thị sinh học phát sớm ung thư vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015) Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho biến đổi gen thuộc phức hệ V thường gặp so với gen ND1 bệnh nhân ung thư vú Do cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi gen nhóm đối tượng khác kết xác 1.5 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM Tại Việt Nam, nghiên cứu biến đổi gen ty thể đối tượng bệnh nhân ung thư vú chưa có tính hệ thống Do đó, nghiên cứu thực với mục đích xác định biến đổi số gen ADN ty thể bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam phân tích mối liên quan với đặc điểm lâm sàng bệnh, góp phần làm sáng tỏ vai trò ADN ty thể bệnh ung thư vú cung cấp liệu có tính hệ thống ban đầu cho nghiên cứu nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng bệnh hiệu Chƣơng – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng Mẫu mô u (được lấy vị trí khối u) mô lân cận u (cách vị trí có khối u từ – 10 cm) 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u mô máu 20 bệnh nhân mắc u xơ vú mẫu máu 65 người cho máu khỏe mạnh 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất mua từ hãng tin cậy (Sigma, Merk) đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử 2.1.3 Thiết bị Các thiết bị sử dụng thuộc phòng Proteomics sinh học cấu trúc (KLEPT) Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN có độ xác tin cậy cao 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô Mẫu mô tách chiết QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình nhà sản xuất 2.2.1.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu Mẫu máu tách chiết GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit theo quy trình nhà sản xuất 2.2.2 Điện di kiểm tra sản phẩm gel agarose polyacrylamide 2.2.3 Khuếch đại đoạn gen quan tâm phƣơng pháp PCR 2.2.4 Tinh sản phẩm PCR Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình nhà sản xuất 2.2.5 Phân tích PCR-RFLP Các đột biến điểm ADN ty thể phát kỹ thuật PCR-RFLP sử dụng enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I, SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình nhà sản xuất 2.2.6 Nhân dòng tách chiết ADN plasmid Nhân dòng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit Fermentas Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin Miniprep Kit (Qiagen) thực theo quy trình nhà sản xuất 2.2.7 Định lƣợng ADN realtime PCR Định lượng số đoạn lớn ADN ty thể phương pháp realtime PCR dựa gen HBB đại diện cho ADN nhân), gen ND1 (nằm vùng đoạn) gen ND4 (nằm vùng hay xảy đoạn) đại diện cho ADN ty thể Hiệu suất khuếch đại phản ứng realtime PCR xác định dựa vào đường chuẩn theo công thức: % Hiệu suất = (10-1/slope – 1) x 100% Trong đó: slope hệ số góc đường chuẩn định lượng Công thức xác định số tương đối ADN ty thể là: Số tƣơng đối ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1) Mức độ đoạn ADN ty thể xác định công thức: Mức độ đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4))*100% 2.2.8 Định lƣợng ADN HPLC Phương pháp HPLC sử dụng để định lượng số ADN ty thể dựa gen ACTB đại diện cho ADN nhân gen ND1 đại diện cho ADN ty thể Tỉ số ADN ty thể so với ADN nhân tính toán dựa theo công thức: Số tƣơng đối ADN ty thể = k x S1/S2 Trong đó: k = 1,235 S1: Diện tích đỉnh sắc ký sản phẩm gen ND1 S2: Diện tích đỉnh sắc ký sản phẩm gen ACTB 0,0143) mô lân cận u (p = 0,0001) bệnh nhân mắc ung thư vú Bên cạnh đó, số ADN ty thể máu bệnh nhân u xơ cao có ý nghĩa thống kê so với số máu người khỏe mạnh bình thường với mức ý nghĩa 0,05 (p = 0,0003) Trong nghiên cứu trước đây, số ADN ty thể máu cao cho làm tăng nguy mắc ung thư vú (Shen, 2009; Lemnrau, 2015) So sánh thay đổi số ADN ty thể theo đặc điểm lâm sàng cho thấy mối liên quan có ý nghĩa thống kê số ADN ty thể theo độ tuổi (< 50 ≥ 50), kích thước khối u (< ≥ cm3), số hạch (< 10 ≥ 10), kích thước hạch (< 0,5 ≥ 0,5 cm), giai đoạn hạch N, mức độ biệt hóa giai đoạn bệnh Tuy nhiên, số ADN ty thể thấp có ý nghĩa thống kê giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 (p = 0,0058) nhóm bệnh nhân ung thư vú Tương tự với nghiên cứu Mambo cs (2005), kết không thấy có mối liên quan biến đổi số với độ mô học khối u di căn, biến đổi cho xảy giai đoạn sớm trình phát sinh khối u sử dụng công cụ chẩn đoán phân tử để xác định bất thường di truyền khối u 3.3 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ MẤT ĐOẠN LỚN CỦA ADN TY THỂ 3.3.1 Xác định đoạn 4977 bp Xác định ∆mtDNA4977 dựa phản ứng nhân đoạn gen ND1 đại diện cho vùng không đoạn ADN ty thể, gen ND3 thuộc vùng đoạn 4977 bp đoạn ADN nằm trình tự lặp 13 bp (ngoài vùng đoạn 4977 bp) phương pháp PCR lồng 12 Thực phân tích mẫu xác định tỉ lệ ∆mtDNA4977 61.76% (63/102 mẫu) mô u, 77.45% (79/102 mẫu) mô lân cận u 15.38% (10/65 mẫu) máu người bình thường Bên cạnh đó, tỉ lệ đoạn 4977 bp xác định thấp có ý nghĩa thống kê mô u so với mô lân cận u, máu người bình thường so với mẫu mô u lân cận u bệnh nhân ung thư vú (OR = 8,88, 95% CI = 1,2 – 5,7, p < 0,05) Kết thống với số kết nghiên cứu trước (Dani, 2004; Tseng, 2006; Ye, 2008), từ ủng hộ quan điểm ∆mtDNA4977 đóng vai trò vào phát sinh khối u tiến triển ung thư vú Nguyên nhân tượng giảm số mô u mở rộng dòng tế bào ung thư trình phát triển tế bào có đột biến ∆mtDNA4977 bị loại bỏ trình apoptosis (Wu, 2005) Phân tích mối liên quan tỉ lệ đoạn 4977 bp với đặc điểm bệnh học bệnh ung thư vú cho thấy đoạn 4977 bp có mối liên quan có ý nghĩa thống kê với di hạch (thấp giai đoạn N0 so với giai đoạn N1-2) (p = 0,0416) Bên cạnh đó, khác biệt có ý nghĩa thống kê tần số đoạn 4977 bp đặc điểm bệnh học khác 3.3.2 Xác định đoạn lớn khác bệnh nhân ung thƣ vú Kết phản ứng PCR lồng phát thấy băng có kích thước khác với băng 381 bp đại diện cho đoạn 4977 bp Một số trường hợp thể đồng thời nhiều đoạn với kích thước khác Các băng lạ có kích thước lớn nhỏ 381 bp tinh sạch, giải trình tự so sánh với trình tự chuẩn ADN ty thể Hình 3.18 minh họa số đoạn lớn khác ADN ty thể xác định thông qua giải trình tự trực tiếp 13 Hình 3.3 Mất đoạn lớn khác 4977 bp ADN ty thể đƣợc xác định thông qua giải trình tự trực tiếp (A): vị trí nối sau đoạn 4977 bp (B): đoạn 5156 bp (C): đoạn 5266 bp (D): đoạn 5012 bp Mũi tên vị trí nối sau đoạn, trình tự lặp màu xanh: 13 bp (A), bp (B) Kết thu đoạn 4977 bp, phát thấy 18 đoạn lớn mô u, 11 đoạn lớn mô lân cận u bệnh nhân ung thư vú chưa công bố trước sở liệu MITOMAP Các đoạn lớn khác tìm thấy với tỷ lệ 52,94% (54/102 mẫu) mô u, 45,1% (45/102 mẫu) mô lân cận u 27,69% (18/65 mẫu) mẫu máu đối chứng Sự tăng dần đoạn lớn máu bình thường, mô lân cận u mô u khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Tuy nhiên, kết chưa đủ sở để trả lời câu hỏi liệu biến đổi ADN ty thể có phải yếu tố góp phần vào trình phát sinh ung thư hay đột biến đơn giản phát sinh phần hiệu ứng phụ trình tiến triển ung thư phụ thuộc vào nhiều yếu tố, số có mức độ 14 đoạn mô Do đó, để trả lời câu hỏi vai trò đoạn lớn đến ung thư vú cần phải tiến hành nghiên cứu 3.3.3 Xác định mức độ đoạn lớn realtime PCR Mức độ đoạn lớn ADN ty thể xác định phương pháp realtime PCR dựa có mặt gen ND1 (nằm vùng xảy đoạn) gen ND4 (nằm vùng hay xảy đoạn) Mức độ đoạn loại mẫu khác thể Hình 3.20 Hình 3.20 Mức độ đoạn lớn ADN ty thể loại mô nghiên cứu (*: p < 0.05) Kết cho thấy mức độ đoạn lớn ADN ty thể cao mô u (54,6 ± 6,69) giảm dần mô lân cận u (53,7 ± 7,00), máu người bình thường (51,7 ± 5,77), máu bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) thấp mô bệnh nhân mắc u xơ (45,3 ± 7,24) Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức độ đoạn lớn mô u lân cận u bệnh nhân ung thư vú, máu bệnh nhân mắc u xơ máu người bình thường Ngược 15 lại, mức độ đoạn mẫu mô u xơ (45,3 ± 7,24) so với mẫu máu bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) mô u xơ so với mô u lân cận u bệnh nhân ung thư vú (54,6 ± 6,69 53,7 ± 7,00) có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết trái ngược với nghiên cứu Ye cs (2008) không tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê mức độ đoạn 4977 bp mô u lân cận u bệnh nhân mắc ung thư vú u xơ Nie cs (2015) lại thấy tỉ lệ đoạn lớn máu bệnh nhân ung thư vú cao có ý nghĩa thống kê so với máu bệnh nhân mắc u vú lành tính (p < 0,001) Như thấy mức độ đoạn ADN ty thể giảm kết trình tiến triển ung thư thông qua phân chia tế bào cách nhanh chóng kết tác động chọn lọc thông qua chế (ví dụ chết theo chương trình) dẫn đến tế bào có mức độ đoạn lớn bị loại bỏ mô ung thư (Wu, 2005) Trong nghiên cứu này, so sánh mức độ đoạn lớn ADN ty thể mô u với đặc điểm bệnh học ung thư vú, kết cho thấy mức độ đoạn cao bệnh nhân có kích thước hạch lớn (≥ 0,5 cm) so với bệnh nhân có kích thước hạch nhỏ 0,5 cm Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,024 Trong nghiên cứu trước đây, mức độ đoạn lớn ADN ty thể, cụ thể ∆mtDNA4977, thấy giảm với giai đoạn tiến triển ung thư đại trực tràng (p = 0,031) nhiên số ADN ty thể lại thấy tăng lên (Chen, 2011b) Ngược lại, nghiên cứu Ye (2008), mức độ đoạn 4977 bp lại thấy mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với đặc điểm lâm sàng ung thư vú độ tuổi, độ mô học, giai đoạn khối u tình trạng 16 ER/PR bệnh nhân ung thư vú bệnh nhân mắc u lành tính Sự mâu thuẫn liên quan đến kỹ thuật sử dụng phân tích đặc điểm nhóm mẫu khác (ví dụ mẫu mô đông lạnh so với mẫu cố định formalin, độ tuổi nhóm bệnh nhân khác nhau, loại mẫu mô hay máu) (Ye, 2008) 3.4 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ATP6 Đoạn ADN chứa gen ATP6 tiến hành nhân giải trình tự trực tiếp Kết giải trình tự xác định 20 biến đổi mẫu mô u, có 13 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin, 13 biến đổi mẫu máu người bình thường, có 12 biến đổi công bố biến đổi (9183insC) Trong đó, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao mô u so với mô máu G9053A (22,86%, 8/35 mẫu) lựa chọn để sàng lọc mấu nghiên cứu Kết xác định thấy tỉ lệ dạng biến đổi 9053A 21,57% (22/102 trường hợp) mô bệnh nhân ung thư vú 11,76% (12/65 trường hợp) mẫu máu người khỏe mạnh bình thường Tuy nhiên, khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Kết phân tích cho thấy mối liên quan biến đổi G9053A với đặc điểm bệnh học ung thư vú độ tuổi, kích thước u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn, di hạch, mức độ biệt hóa giai đoạn bệnh 3.5 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN tARN TY THỂ 3.5.1 Xác định tần suất biến đổi gen tARN ty thể Đoạn ADN chứa gen: MT-TI (tARNLeu), MT-TQ (tARNGln), MT-TM (tARNMet), MT-TW (tARNTrp), MT-TA (tARNAla), MT-TN (tARNAsn), MT-TC (tARNCys) MT-TY (tARNTyr) nhân giải trình tự trực tiếp Kết xác định tổng số 12 biến đổi 17 20,4% bệnh nhân (10/49 trường hợp) thuộc gen tARN nghiên cứu, trừ gen MT-TM (mã hóa cho tARNMet) Hầu hết biến đổi tập trung gen MT-TA (mã hóa cho tARNAla) (41,67%, 5/12 biến đổi) Đáng ý có biến đổi thuộc gen MT-TW (A5536T), MTTA (G5645T) MT-TN (A5724G) chưa công bố sở liệu Mitomap trước Đây biến đổi gen tARN ty thể đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Mặt khác, biến đổi phát với tần suất thấp biến đổi biến đổi nhóm bệnh nhân Tuy nhiên, khác biệt có ý nghĩa thống kê tần suất biến đổi với đặc điểm bệnh học ung thư vú 3.5.2 Dự đoán thay đổi cấu trúc bậc phân tử tARN có biến đổi Để nghiên cứu sâu tác động biến đổi chưa công bố (A5536T, G5645T A5724G) lên cấu trúc bậc phân tử tARN, sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc bậc RNAfold WebServer Sự tác động biến đổi lên cấu trúc bậc phân tử tARN tương ứng thể Hình 3.27 Theo đó, có biến đổi A5536T G5645T làm thay đổi cấu trúc bậc phân tử tARNTrp tARNAla, biến đổi A5724G không làm ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử tARNAsn Tuy nhiên, số có biến đổi A5536T làm giảm lượng tự tối thiểu (MFE) phân tử tARNTrp, điều cho thấy biến đổi A5536T đóng vai trò quan trọng bệnh ung thư vú A MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -10,00 kcal/mol 18 B MFE: -4,90 kcal/mol MFE: -4,70 kcal/mol C MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -9,60 kcal/mol Hình 3.4 Dự đoán thay đổi cấu trúc phân tử tARN có biến đổi A5536T, G5645T A5724G 3.5.3 Sàng lọc biến đổi A5536T mẫu nghiên cứu Đoạn ADN gen MT-TW chứa vị trí 5536 nhân sàng lọc mẫu nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR-RFLP 19 Kết sàng lọc 91 bệnh nhân phát trường hợp có biến đổi A5536T bệnh nhân # 26137 Biến đổi gen tARN ty thể tác động đến cấu trúc bậc phân tử ảnh hưởng đến trình dịch mã tổng hợp protein ty thể cải biến trình sinh học liên quan đến tiến triển ung thư vú 3.6 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ND3 Đoạn gen ND3 chứa vị trí 10398 nhân sử dụng enzyme DdeI để sàng lọc biến đổi A10398G mẫu nghiên cứu Kết cho thấy có khác biệt tỉ lệ biến đổi A10398G loại mô, tỉ lệ dạng biến đổi G 59,8% (61/102 trường hợp) mô lân cận u, 57,8% (59/102 trường hợp) mô u 47,7% (31/65 trường hợp) mẫu máu đối chứng Theo Hình 3.33, thấy dạng biến đổi 10398G nhiều dạng 10398A mẫu mô lại dạng 10398A mẫu máu nhóm đối chứng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 (Hình 3.33) Hình 3.5 Phân bố biến đổi A10398G nhóm nghiên cứu 20 Kết khác so với nghiên cứu công bố trước Trong nghiên cứu Czarnecka (2010a) đối tượng phụ nữ Ba Lan, tỉ lệ 10398G 23% 10398A 77% Nghiên cứu Nadiah cs (2012) phụ nữ Mã Lai thấy tần suất dạng 10398A 27% 10398G 73% nhóm bệnh nhân Jiang cs (2014) nghiên cứu máu ngoại vi bệnh nhân ung thư vú người Hán Trung Quốc thấy khác biệt đa hình A10398G máu ngoại vi nhóm bệnh nhân (10398A = 48,6%, 10398G = 51,4%) so với nhóm đối chứng Tỉ lệ nhóm bệnh nhân người Bangladesh 75% 10398A 25% 10398G (Ismaeel, 2013) Như vậy, thấy tần suất dạng 10398A 10398G thay đổi phụ thuộc vào nhóm tộc người khác Hình 3.6 Phân bố biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa mô Kết phân tích cho thấy mối liên quan biến đổi A10398G với đặc điểm bệnh học ung thư vú độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai đoạn T), di hạch (giai đoạn N) giai đoạn bệnh Tuy nhiên, phân tích biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa u cho thấy khác biệt dạng 10398A 10398G mức độ biệt hóa khác 21 khác (Hình 3.34) Ở mức độ biệt hóa rõ kém, tần suất dạng biến đổi 10398G thấp so với 10398A Trong mức độ biệt hóa vừa, tần suất xuất 10398G (63,64%) cao rõ rệt so với 10398A (36,36%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α = 0,05 (p = 0,004) Mức độ biệt hóa dùng để mức độ giống tế bào bình thường loại mô tế bào u Mức độ ác tính ung thư có liên quan trực tiếp đến phát triển, xâm lấn di tế bào ung thư Thông thường, khối u có tính biệt hóa rõ, tế bào ung thư thường phát triển chậm, mức độ ác tính thấp, di chậm Mặt khác khối u có tính biệt hóa độ ác tính lại cao, di nhanh Do đó, biến đổi A10398G có mối liên quan với tiến triển bệnh ung thư vú 3.7 PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI A4164G CỦA GEN ND1 Đoạn gen ND1 chứa vị trí 4164 nhân sử dụng enzyme NlaIII để sàng lọc biến đổi A4164G mẫu nghiên cứu Kết cho thấy tần suất biến đổi A4164G 15,69% (16/102 trường hợp) mẫu mô bệnh nhân ung thư vú 10,77% (7/65 trường hợp) mẫu máu người khỏe mạnh bình thường (đối chứng) Mặc dù biến đổi A4164G thấy xuất người bình thường, nhiên, tỷ lệ biến đổi thành G vị trí 4164 nhóm bệnh nhân ung thư vú cao nhóm đối chứng Tuy nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (Hình 3.38) 22 Hình 3.7 Tỉ lệ biến đổi A4164G nhóm nghiên cứu Phân tích mối liên quan với số đặc điểm bệnh học ung thư vú cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê biến đổi A4164G gen ND1 với đặc điểm bệnh học ung thư vú độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa giai đoạn bệnh Trong nghiên cứu trước đây, A4164G tìm thấy với tần suất thấp bệnh nhân mắc bệnh Liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON) (< 4%) bệnh nhân mắc ung thư phổi (3/30 mẫu bệnh nhân) (Fujitake, 2002; Fang, 2015) Trong nghiên cứu này, tần suất biến đổi A4164G đối tượng bệnh nhân ung thư vú thấp không thấy có mối liên quan với đặc điểm bệnh học bệnh Do đó, cho mối liên quan biến đổi với bệnh ung thư vú ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN (1) Luận án công trình Việt Nam cung cấp liệu có tính hệ thống biến đổi số gen ty thể, bao gồm: biến đổi số mtDNA, đoạn lớn mtDNA, biến đổi 23 gen ATP6, tARN ty thể, ND3 & ND1 đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam (2) Đã phát thấy số biến đổi ADN ty thể bệnh nhân ung thư vú, gồm: đoạn lớn ADN ty thể, biến đổi gen mã hóa cho phân tử tARN, 9183insC gen ATP6 số biến đổi khác (3) Luận án đưa bước phát số đột biến gen ty thể bệnh ung thư vú Kết thu luận án tiền đề phát triển để sử dụng đánh giá nguy hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng bệnh KẾT LUẬN Từ kết thu được, rút số kết luận sau: Đã xác định biến đổi số gen ty thể bệnh nhân ung thư vú Việt Nam, bao gồm: - Giảm số ADN thể, giảm tỉ lệ đoạn 4977 bp, tăng mức độ đoạn lớn mô u so với mô lân cận u bệnh nhân ung thư vú - Xác định số đoạn ADN ty thể; 20 biến đổi mẫu mô u gen ATP6, có biến đổi 9183insC chưa công bố trước đây; 12 biến đổi thuộc gen tARN ty thể, có biến đổi A5536T, G5645T A5724G chưa công bố trước Đã xác định tỉ lệ dạng biến đổi A10398G gen ND3 A4164G gen ND1 tương ứng 57,8% 15,69% mô u; 47,7% 10,77% mẫu máu người khỏe mạnh bình thường Đánh giá mối liên quan biến đổi với đặc điểm bệnh học bệnh ung thư vú cho thấy: 24 - - Số ADN ty thể thấp giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 nhóm bệnh nhân ung thư vú Tỉ lệ đoạn 4977 bp thấp giai đoạn N0 so với giai đoạn N1-2 Mức độ đoạn cao hạch có kích thước lớn (≥ 0.5 cm) so với hạch có kích thước nhỏ 0.5 cm Không có mối liên quan tần suất biến đổi G9053A gen ATP6, biến đổi A4164G gen ND1 biến đổi gen tARN với đặc điểm bệnh học ung thư vú Biến đổi A10398G gen ND3 có mối liên quan với mức độ biệt hóa khối u KIẾN NGHỊ Từ trình nghiên cứu thực tế đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục sàng lọc biến đổi gen khác ADN ty thể bệnh nhân ung thư vú Phát triển kết ban đầu thu luận án xác định định lượng số biến đổi ADN ty thể để áp dụng đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng bệnh 25 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Tú Linh, Nguyễn Bỉnh Hiếu, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Phân tích biến đổi A10398G ty thể bệnh nhân ung thư vú Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 31(2), tr 36-43 Lưu Huyền Trang, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Mất đoạn 4977 bp ADN ty thể bệnh nhân ung thư vú”, Tạp chí Sinh học, 37(1se), tr 111-116 Tô Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Biến đổi gen ND1 ty thể bệnh nhân ung thư vú”, Tạp chí Sinh học, 37(1se), tr 143-149 Jan Dimberg, Thai Trinh Hong, Linh Tu Thi Nguyen, Marita Skarstedt, Sture Löfgren and Andreas Matussek, (2015), “Common 4977 bp deletion and novel alterations in mitochondrial DNA in Vietnamese patients with breast cancer", Springer Plus, pp 4-58 Linh Thi Tu Nguyen, My Thi Tra Quach, Dung Thi Do, Ha Minh Do, To Van Ta, Thai Hong Trinh, (2015), “Novel alteration of mitochondrial tRNATrp in a group of Vietnamese breast cancer patients”, Ann Transl Med, 3(S2): AB110, pp 72-73 ... tài: Nghiên cứu biến đổi số gen ty thể bệnh ung thư vú nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp liệu có tính hệ thống ban đầu biến đổi số gen ty thể, bao gồm biến đổi số ADN ty thể, mức độ đoạn lớn, biến. .. ty thể, giảm biểu gen ty thể biến đổi hoạt tính enzyme ty thể đột biến soma đột biến dòng mầm ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon, 2006) 1.4 MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ VÚ 1.4.1... BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM Tại Việt Nam, nghiên cứu biến đổi gen ty thể đối tượng bệnh nhân ung thư vú chưa có tính hệ thống Do đó, nghiên cứu thực với mục đích xác định biến đổi số gen