nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - T ị NGHI N ỨU I NĐ I Ủ Ở TS G N T TH NH UNG THƯ ĐẠI TRỰ TR NG Chuyên ngành: S ọ v vật Mã số: 62420104 Ự TH T TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC Hà N i - 2016 ô r g trì ng Đ i h i h ớng dẫn khoa h c: ợc hoàn thành t i: ho h nhi n ĐH GH G r nh H ng h i TS Tô Thanh h Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án đ ợc bảo vệ tr ớc Hội đ ng cấp sở chấm luận án tiến sĩ h pt i vào h i gi phút, ngà th ng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án t i: - h viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - h viện Đ i h c Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ung th đ i tr tràng (U Đ ) lo i ung th phổ biến, giới U Đ xếp thứ s u ung th phổi ung th tiền liệt tuyến nam giới đứng thứ h i s u ung th v nữ giới tổng số lo i ung th Ở Việt m U Đ đứng thứ năm s u ung th g n phổi, d dày, vú Tỷ lệ mắ U Đ khoảng 8,7% tổng số bệnh nhân ung th (globo n 2012) Có nhiều yếu tố nguy ảnh h ởng đến U Đ nh hế độ ăn uống, nối sống, nghề nghiệp hội chứng đ pol p theo gi đình Đặc biệt, nghiên gần đâ đ ho thấ đột biến ADN ty thể yếu tố góp phần làm tăng ngu mắc bệnh Kết nghiên cứu đột biến ADN ty thể cho thấ đâ h ớng nghiên cứu tiềm để tìm th ho ung th ( umitr s 2014; Ann s 2010) Ở Việt m tr n đối t ợng bệnh U Đ nghi n ứu chủ yếu tập trung vào vấn đề li n qu n đến d ch tễ h lâm sàng ph ơng ph p điều tr nh ng h ó ông trình nghiên cứu đột biến ADN ty thể mối liên quan giữ đột biến ADN ty thể với bệnh U Đ Xuất phát từ th c tế trên, tiến hành đề tài luận án: “ ” Mụ t u ủ uậ : X đ nh tỷ lệ đo n 4977 bp đ nh l ợng mứ độ đo n lớn số s o A t thể t ơng đối mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng Khảo sát biến đổi số gen: ND1, ND3, COX-1, COX-2 mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân ung th đ i tr tràng mẫu m u ủ ng i h e m nh bình th ng kỹ thuật sinh h c phân tử Đ nh gi mối liên quan d ng biến đổi gen, tỷ lệ đo n lớn, mứ độ đột biến đo n lớn s th đổi số l ợng ADN ty thể với số đặ điểm bệnh h c bệnh nhân U Đ Việt Nam Đố t ợ ứu ủ uậ Nghiên cứu đ ợc th c tr n 86 ặp mẫu mô mẫu máu bệnh nhân b bệnh U Đ ẫu ung th đ ợc cung cấp từ Bệnh viện ệnh viện iệt Đức Hà Nội từ năm 2012 - 2015 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh bình th ng Bệnh viện huyết h c truyền m u rung ơng ung ấp Ý ĩ k o ọc thực tiễn củ ề t uậ - Với kết mà đề tài luận n thu đ ợc góp phần cung cấp ngu n liệu biến đổi số gen ty thể (ND1, ND3, COX-1, COX-2), tỷ lệ mứ độ đo n lớn, s th đối số l ợng ADN ty thể bệnh nhân U Đ tr n sở ó thể l a ch n đ ợ đột biến, biến đổi có nhiều tiềm để nghiên cứu sâu giúp cho việc hỗ trợ chẩn đo n điều tr bệnh U Đ Đó -Đ óp ới củ ề tài hảo s t x đ nh đ ợ tỷ lệ biến đổi nucleotide: A4164G, A10398G, C6340T, G7853A hệ gen ty thể bệnh nhân U Đ - Đ x đ nh đ ợc tỷ lệ đ nh l ợng đ ợ mứ độ đo n lớn s th đổi số l ợng ADN ty thể bệnh nhân U Đ - Đ đ nh gi đ ợc mối liên quan giữ biến đổi nucleotide, tỷ lệ, mứ độ đo n lớn s th đổi số l ợng ADN ty thể với số đặ điểm bệnh h c bệnh nhân U Đ - Là ông trình phát thấy số đột biến đo n mới: 5094bp 5169 bp 5104bp HƯƠNG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Thực tr ng mắ u t i trực tràng Ung th đ i tr tràng (U Đ ) lo i ung th phổ biến chiếm tỉ lệ cao thứ b tr ng hợp ung th nam giới, thứ hai n giới (Globocan, 2012) T i Việt lệ mắc tử vong m U Đ xếp thứ nam giới, xếp thứ nữ giới tỷ 1.1.2 Các hệ thố p â o n bệ ou t i trực tràng Có nhiều hệ thống phân gi i đo n ho ung th Đối với U Đ th ng sử dụng phổ biến hai hệ thống là: hân gi i đo n ung th theo d vào í h th ớc khối u (T), mức độ lâ l n đến h ch b ch huyết (N) s diện củ di ăn ( ) ( umor- l mph ode - et st ses ) phân gi i đo n theo Dukes (Sobnin, 2009) 1.1.3 Các yếu tố uy ây u t trự tr Có nhiều yếu tố đ ợc biết làm tăng giảm ngu U Đ ụ thể: Yếu tố tuổi tác, yếu tố di truyền tiền sử gi đình tiền sử nhân Đặ biệt số đột biến tr n A t thể ng đ đ ợ x đ nh làm tăng ngu mắ bệnh 1.2 TY TH NGƯỜI 1.2.1 u tr v ứ ủ ty t ể Ty thể bào quan có mặt tế bào chất hầu hết tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác xong hình d ng đặ tr ng thon dài với đ ng kính 0,5-2 µm chiều dài 7-10 µm Bao b c bên ty thể hai lớp màng lipoprotein, hai lớp màng khoang gian màng, bên hai màng chất Màng ty thể ăn sâu vào chất t o thành mào l ợ t thể nhà m t o l ợng cho tế bào th m gi vào qu trình l o hó qu trình t chết tế bào số qu trình h ủ thể 1.2.2 Hệ gen ty thể Bào quan ty thể có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân ADN ty thể ng i t n t i d ng m ch vòng, sợi đôi ó í h th ớc 16.569bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA 13 phân tử protein thuộc phức hợp chuỗi hô hấp 1.2.3 Sự di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể S di truyền gen ADN ty thể di truyền qua tế bào chất (di truyền theo dòng mẹ) g i mẹ truyền hệ gen ty thể ho truyền hệ gen ho hệ 1.2.4 Hiệ t ợng dị tế bào ch t v ng i có ng ỡng biểu củ i gái t biến ADN ty thể Do hệ gen ty thể có nhiều sao: vài ty thể, hàng nghìn tế bào.Vì vậy, ADN ty thể có t ợng đặc thù - t ợng d tế bào hất (heteropl sm ) tế bào hất t ợng t n t i đ ng th i ADN ty thể b đột biến ADN ty thể d ng d i mô, tế bào Nếu tất ADN ty thể giống g i tính đ ng (homopl sm ) Ở tr ng th i bình th ng phần lớn A t thể t n t i d ng đ ng tế bào hất h i niệm ng ỡng biểu củ đột biến đ ợ dùng để khả h u đ ng tế bào tr ớc tỷ lệ số ADN ty thể m ng đột biến tổng số s o ỷ lệ ty thể đột biến phải đ t đến ng ỡng gây kiểu hình lâm sàng bệnh ( l s 1996) g ỡng biểu củ đột biến th đổi phụ thuộc lo i đột biến lo i mô ( ll e cs, 2013) 1.3 Đ T I N N T TH V NH UNG THƯ hiều d ng biến đổi tr n A t thể đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến bệnh ung th Các biến đổi d ng đ hình ng ó thể đột biến làm th đổi axit amin dẫn đến th đổi cấu trúc enzyme thuộc chuỗi hô hấp, dẫn đến việc hông đảm bảo ó thể làm ảnh h ởng tới dòng vận chuyển điện tử bình th ng Các biến đổi thuộ vùng ghi m đặc biệt biến đổi gen ND1, ND3, COX-1, COX-2 đ đ ợ x đ nh nhiều lo i ung th ó ung th đ i tr c tràng ất đo n lớn tr n A t thể ó đo n phổ biến 4977bp đ ợ oi ngu n nhân hính ủ số bệnh t thể ó thể đóng v i tr trung tâm qu trình l o hó goài r đo n 4977bp ng đ đ ợ x đ nh ó li n qu n đến nhiều lo i bệnh ung th h nh u nh ung th v niêm m c tử cung, th c quản, d dà đ i tr c tràng, gan, phổi, thận, da tuyến giáp ( hen s 2011; e s 2008; i s 2006; Demberg, 2015) u nhi n mứ độ ảnh h ởng ủ đo n đến biểu bệnh n li n qu n đến mứ độ ủ đo n o tế bào ó từ hàng tr m đến hảng nghìn s o A t thể s th đổi số l ợng ADN ty thể đ ợc coi dấu hiệu quan tr ng bệnh ung th u nhiên, vai trò s th đổi số l ợng ADN ty thể xảy gi i đo n đầu, gi i đo n tiến triển bệnh ung th nói U Đ nói ri ng n h thống 1.4 Á HƯƠNG HÁ HÁT HI N Đ T BI N GEN TY TH Để x đ nh đ nh l ợng biến đổi tr n A t thể th ng p dụng số ph ơng ph p s u: PCR-RFLP giải trình t gen e ltime H L số ph ơng ph p h ph ơng ph p ó thể dùng ết hợp với nh u để tăng độ hính x ủ ết phân tí h HƯƠNG NGU N I UV HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU 2.1 NGUYÊN LI U 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 86 mẫu mô ung th g m mô u lân cận u bệnh nhân U Đ ng i Việt Nam, bệnh nhân có mẫu máu kèm theo Các mẫu mô máu bệnh nhân ung th đ ợc thu thập từ bệnh viện K bệnh viện Việt Đức Hà Nội từ năm 2012 đến năm 2015 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh đến cho máu đ ợc thu thập từ Viện huyết h c truyền m u rung ơng mẫu m u đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2015 Các mẫu nghiên cứu đ ợc bảo quản tủ - 800C 2.1.2 ó t ợ s ụ Các cặp m i dùng ho phân tí h tro - FL x ứu đ nh đo n, HPLC, Realtime PCR (IDT, Invitrogen (Mỹ), Maxima Hot Start PCR Master Mix 2x (Thermo Scientific, Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), Các enzyme cắt giới h n Ferment s (Đứ ) số hó hất h đ t độ tinh hiết ho phân tí h sinh h phân tử 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ Các máy móc dùng nghiên cứu bao g m: máy NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy nhân gen PCR Biorad (Mỹ), máy Realtime PCR Mygopro (IT-IS Life Science (Anh), máy ly tâm 5417 (l tâm 5mlendorf Đức), thiết b điện di ng ng điện di đứng (Biorad) hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad), tủ l nh -20OC -80OC (Nuaire, Mỹ) m mó thiết b h thuộ ph ng roteomi s inh h ấu tr thuộ ph ng thí nghiệm tr ng điểm ông nghệ en me rotein- r ng ĐH H hi n 2.3 HƯƠNG HÁ NGHI N ỨU 2.3.1 T ết N tổng số từ mẫu ôu t i trự tr v ẫu u Tiến hành tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u it t h hiết QIAamp A ini it IA mp lood mini it ( IAGE Đứ ) b t h hiết theo h ớng dẫn nhà sản xuất 2.3.2 Tách chiết ADN plasmid A pl smid đ ợc tách tinh s ch kit QIAprep-miniprep củ b tiến hành theo theo h ớng dẫn ủ nhà sản xuất 2.3.3 Đ ện di kiể tr v ị ợng ADN tổng số i gen sản phẩm S có mặt ADN tổng số điện di gel agarose pol 2.3.4 Nhân bả đ ợc kiểm tra ph ơng ph p r l mide nhuộm ethidiumbromie o n gen ty thể t biến kỹ thuật PCR đo n ADN thuộc gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, đo n 4977bp thuộc ADN ty thể đ ợc sàng l đột biến/đ hình đ ợc khuế h đ i phản ứng PCR với cặp m i đặc hiệu (bảng 2) Khuôn cho phản ứng PCR ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu bệnh nhân U Đ mẫu máu củ ng ì 2.3.5 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật i kh e m nh ều o n cắt giới h n (PCR-RFLP) Trong nghiên cứu này, biến đổi (đột biến điểm/đ hình) tr n A phát kỹ thuật PCR- FL (và đ ợc khẳng đ nh kỹ thuật x t thể đ ợc đ nh trình t nu leotide) en me đ ợ sử dụng g m: NlaIII, DdeI, HincII, HincII (bảng 1) Phản ứng cắt đ ợc th c với thành phần theo h ớng dẫn nhà sản xuất Tên Trì ả tự â zy ết enzyme tro Vị tr ứu Sả (gen) ế p ổ ô ế ổ NlaIII DdeI 5'- A G↓-3' 5’-C↓TNAG-3’ A4164G, T4216C  202bp; 133bp (T4216C)  335bp  185bp; 150bp (A4164G) (ND1)  203 185 150 133bp ( 4216 A4164G) A10398G  38 bp 50bp 158 bp  50 bp 196 bp  113 bp 144 bp 215bp  257 bp 215 bp  161bp  128bp 33bp (ND3) HincII BccI 5’-GTY↓RAC-3’ G7853A R=G, A; Y=T, C (COX-2) 5’CCATC(N4) ↓3' C6340T (COX-1) ả 2.2 C T p tro G t vị tr qu tâm p ND1.1 COX-1.1 op ả ứ COX-1/ C6340T COX-2.1 p mtDNA Trì bp) (v trí) ND1/ T4216C, A4164G ND3/ A10398G ND3 ứu 335 (4015-4349) CGA CCC TAC TTC TAA CC CGA CCC TAC TTC TAA CC 246 (1030710552) 161 CTG CCA CTA ATA GTT ATG TC GAT ATG AGG TGT GAG CGA TA 472 GAA GAA GGT GGT GTT GAG GTT G TCC CTC TCT CCT ACT CTA AGA TAG AGG CCT GTT C AGA CAC CTG CTA Rx 433 (3457-3889) 496 (8167-13639) 381 (8196 -13553) 4977-1 4977-2 p o ợ 5’-3’) R-RFLP op ả ứ ND1 tự xuô (5’-3’) R ể ị t o GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC ả trì CCC TCT CTC CTA CTC CTG CTC GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG GTT GAC CTG GGG TGA GAA G GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC tự trự t ếp COX1.2 COX-1 1745 (5851-7595) CTT TAG ATT TAC GT CCA ATG CTT CATGTGCCATTA AGATATATA GGAT COX2.2 COX-2 1050 (7375-84340 ACC TGG AGT GAC TAT ATG GAT GAT GAG GAA TAG TGT AAG GAG 2.3.6 Nhân dòng trực tiếp o n gen Nhân dòng phân tử g m nhóm  Phân lập đo n gen (A t biến vào vector pJet1.2 ph ơng ph p nhằm: ) đặc hiệu từ hỗn hợp phân tử A b n đầu đ ợc tách chiết từ mẫu sinh h c có thành phần phức t p  Nhân đo n trình t A đ ợc quan tâm lên l ợng đủ lớn để tiến hành phân tích cấu trúc gen t ơng ứng 2.3.7 G ả trì tự o ứ t biến ết - FL đ ợ hẳng đ nh ph ơng ph p giải trình t gen 2.3.8 Đ ện di ADN gel polyacrylamide - ùng để x đ nh s dụng ph ơng ph p ó mặt ủ - FL băng A đ ợ nhân l n từ băng ủ sản phẩm en me ặp m i sử 2.3.9 Tinh s ch sản ph m PCR inh s h sản phẩm rodu t le nup 2.3.10 Đị IAqui gel extr tion Exo A -I ùng để thu sản phẩm tinh s h ho gi it rình t A ợ ứ t o tr tiếp v số ADN ty thể kỹ thuật Realtime PCR D a giá tr Ct, số ADN ty thể so với số ADN nhân (giá tr t ơng đối) tính toán theo công thức: -∆C Trong đó: ∆Ctc= CtND1.3 - CtHBB Mứ độ đo n đ ợc tính theo công thức m t o n (%) = (1-1 2Δ t ) *100% Mứ Trong đó: Δ td = tND4.2 − CtND1.3 ặp m i dùng ho phân tí h đ nh l ợng mứ độ đo n số s o A t ơng đối ph ơng ph p e ltime đ ợ trình bà rong bảng ả 2.3 Trì tự p s ụ op ả ứ R â o t thể N ể â T G t xuô (5’-3’) ( bp) p o â ND1.2 ND1 293 HBB.1 HBB 272 p ND1.3 or ND1 t 115 ể ự ợ 5’-3’) u CCT AGC CAT CAT TCT ACT ATC AACA GAA AAT AGA CCA ATA GGC AGA GAG A ACC CTC ACC ACT ACA ATC TTC C GTC AGA AGC AAA TGT AAG CAA TAGA AGT GGC TCC TTT GGT TGG TCT CTG R Hì 3.4: o n trình tự ADN ty thể bệnh nhân UTĐTT t o A: m t đoạn 4977bp (bệnh nhân #4169B), B: m t đoạn 5169bp (bệnh nhân #36924), C: m t đoạn 5094bp (bệnh nhân #42308), D: m t đoạn 5104bp (bệnh nhân # 10731 ( ũi tên hỉ v trí nối sau m t đoạn T ệ t o 4977 p t o ể ệ ọ â s heo độ tuổi: ỷ lệ đo n nhóm bệnh nhân 50 tuổi 100 o so với nhóm bệnh nhân tr n 50 tuổi (93 ) ỷ lệ đo n n m giới 97 o so với nữ giới (93 ) nhóm ung th đ i tràng đ i tr tràng ó tỷ lệ đo n t ơng đ ơng với nhóm ung th tr tràng heo mứ độ biệt hó nhóm bệnh nhân ó mứ độ biệt hó r biệt hó ém ó tỷ lệ đo n 100 o so với nhóm bệnh nhân mứ độ biệt hó vừ (94 ) heo í h th hối u nhóm bệnh nhân ó í h th u nh m ó tỷ lệ đo n o (100 ) s u đến nhóm bệnh nhân ó í h th hối u lớn m thấp nhóm bệnh nhân ó í h th hối u từ 33,5cm heo gi i đo n tỷ lệ đo n giảm dần theo thứ t lần l ợt 98 gi i đo n No, 96 gi i đo n 75 gi i đo n heo gi i đo n : tỷ lệ đo n nhóm bệnh nhân gi i đo n o (100 ) tiếp đến nhóm bệnh nhân gi i đo n (97 ) thấp nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n (94 ) heo gi i đo n bệnh: tỷ lệ đo n nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n II o (100 ) tiếp đến nhóm bệnh nhân gi i đo n I (96 ) thấp nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n III I Sử dụng test xác củ Fisher iểm đ nh hi bình ph ơng ( HI E ) để đ nh giá mối liên quan đo n 4977 bp với đặ điểm bệnh h c lâm sàng bệnh U Đ ết iểm đ nh ả h i ph ơng ph p ho thấy đo n 4977 bp hông li n qu n đến đặ điểm bệnh h c bao g m: độ tuổi, giới tính í h th ớc khối u, v trí ung th mứ độ biệt hó gi i đo n 3.3 Mứ m t o tr ứ độ đo n lớn tr n A gi i đo n bệnh ủ bệnh nhân (p>0 05) N ty t ể ệ â u t trự tr t thể đ ợ đ nh l ợng ph ơng ph p re ltime Để x đ nh độ hính x ổn đ nh ủ ph ơng ph p h i đ ng huẩn đ ợ hiệu đ ng đ ng H đ ợ h ng xâ d ng nghi n ứu nà vào hệ số t ơng qu n giữ số s o b n đầu hu ỳ ng ỡng ủ re time hiệu huế h đ i hệ số biến thi n theo hu ỳ ng ỡng giữ đ nh gi độ hính x ổn đ nh ủ ph ơng ph p lần lặp l i ủ đ ng huẩn để h ng đ d ng đ ợ đ ng chuẩn ND1 với ph ơng trình: = -3,40x + 33,27, giá tr hệ số t ơng qu n số ADN ty thể số chu kỳ ng ỡng 0,999, hiệu 96 độ dố 40 (hình 5) ơng t đ ng huẩn H ng đ ợ d ng ó ph ơng trình: = -3,5x + 36,2, giá tr hệ số t ơng qu n số ADN ty thể số chu kỳ ng ỡng 0,993, hiệu 91 độ dố -3 56 (hình ) Hì 3.5: ểu khuế v p trì củ o n gen ND1 (A), HBB (B) ờng chu n Đị ợng mứ m t o n mẫu nghiên cứu D a vào chu kỳ ng ỡng, công thức tính mứ độ đo n đ n u phần ph ơng ph p h ng đ x đ nh đ ợ 52/86 ( 60 46 ) bệnh nhân U Đ ó mứ độ đo n mô u o so với mô lân cận, có 34/86 (39,54%) bệnh nhân có đo n mô u thấp mô lân ận u Mứ độ đo n trung bình mô u (55,93%±6,55) t ơng đ ơng với mô lân cận u (55,69±8,01) Giá tr trung v mứ độ đo n mô u 56,02 (52,70 – 58,81) mô lân cận u 55,05(51,15-59,51) Trên mẫu mô U Đ phần lớn bệnh nhân có mứ độ đo n thuộc khoảng 45%-70% Trên mô u mứ độ đo n lớn 78,15%, nh 26 t ơng ứng mô lân cận u 81,86 % 31,65% Sử dụng test Wilcoxon Signed-Rank để so sánh s khác biệt mứ độ đo n mô u lân cận u không nhận thấy có s khác biệt m ng (p=0,163) nghĩ thống kê Mứ độ đo n mẫu máu bệnh nhân U Đ đ ợc cung cấp kèm theo mẫu mô 67 mẫu máu củ ng i kh e m nh làm đối chứng t ơng ứng 64 63 67 (52,08% ±6,25) Sử dụng test thống kê Mann-Whitney, nhận thấy có s khác biệt mang ý nghĩ thống kê mứ độ đo n mẫu máu bệnh nhân U Đ với mẫu máu đối chứng (P= 50 Giới tính Nam Nữ í h th ớc u (cm) =3, 3,5 V trí khối u ể ệ ọ ủ P theo d/theo mô u 0,095/0,163 55,35±3,88 56,02±7,19 0,232/0,315 41 45 55,82± 8,51 55,58 ± 7,62 56,3±7,81 55,59±5,2 0,704/0,172 21 16 42 54,41 ± 8,07 57,23± 6,64 55,70 ± 8,89 56,15±5,48 59,22±6,49 55,10±6,78 0,06/0,173 Tr c tràng 41 Đ i tràng + Đ i tr c tràng 45 Mứ độ biệt hóa Cao 10 Vừa 39 Thấp Mứ độ xâm lấn khối u (T) T1 T2 35 T3+T4 40 H h di ăn ( ) N0 51 N1+N2 32 Gi i đo n bệnh (TNM) I 30 II 21 III+IV 33 t t op p p 55,59 ± 5,80 56,92±6,22 55,79 ± 9,66 54,84±6,79 0,687/0,559 57,03 ±10,33 56,22 ± 7,86 58,03 ±12,03 54,82±3,58 56,9±5,03 55,77±8,16 0,019/0,447 52,61± 5,32 56,88 ± 6,45 55,47 ± 9,69 58,64±6,76 56,05±4,91 55,85±6,15 55,80 ± 8,36 55,73 ± 7,84 55,41±4,78 55,72±6,80 0,0968/0,0261 0,532/0,198 55,93 ± 6,89 55,38 ±10,26 55,84 ± 7,74 55,97±5,29 54,67±3,86 57,47±6,85 pháp Man-Whitney, *: p tính theo p d= s mô U-s mô lân cận u p p krusk waliss ảng ho thấ mứ độ đo n hông li n qu n đến đặ điểm bệnh h lâm sàng g m: độ tuổi giới tính í h th hối u mứ độ biệt hó gi i đo n gi i đo n bệnh ( >0 05) nh ng li n qu n với gi i đo n ủ bệnh (p= 50 18 66 1393,96 ± 1678,52 1193,61± 835,28 889,36± 689,59 1092,72±763,05 Nam 41 Nữ 45 t ớc u (cm) =3, 3,5 42 Vị trí khối u Tr c tràng 45 Đ i tràng +Đ i tr c tràng 41 Mứ biệt hóa Cao 10 Vừa 39 Thấp Mứ xâm l n khối u (T) T1 T2 35 T3+T4 40 H N) N0 51 N1+N2 32 G o n bệnh (TNM) I 30 II 21 III+IV 33 1128,04 ±862,49 1337,17 ± 1198,67 1011,03±738,73 1063,55±755,00 0,176 /0,2709 Giới tính Ghi chú: ệ trự tr Số ADN ty thể t Số bệnh nhân ểm ố tru t t p p p 0,239/ 0,759 * 934,70 ± 576,38 1375,04 ± 1170,37 1361,71 ± 1248,03 938,48± 479,52 1043,14± 928,22 1054,02± 832,25 0,050/ 0,050 1357,19 ± 1291,09 959,83± 772,90 1128,38 ± 770,39 1110,19± 716,52 0,524/ 0,425* 1141,60 ± 858,09 935,75 ± 581,73 1175,65 ± 662,21 1058,58± 719,17 834,94± 654,13 716,63± 370,13 0,05) Tuy nhiên, tỷ lệ d ng biến đổi 4164G máu bệnh (22 ) ó xu h ớng o so với m u đối chứng (11,9%) (p>0,05) 3.5.2 Biế ổi A10398G gen ND3 bệ â t i trực tràng Bằng ph ơng ph p - FL với ặp m i en me DdeI để sang l c biến đổi A10398G, giải trình t A để khẳng đ nh kết PCR-RFLP Kết - FL giải trình t số mẫu đ ợc minh h a hình 3.10 Hì 3.10: ện di sản ph m PCR-RF trình tự o n ADN chứa vị tr 10398 o n ADN chứa vị trí 10398 (A) t biến k ô t biến (B) (Điện di ge polyacrylamide 8%, nhuộm ethidium bromide) Giếng M: Thang chuẩn p, giếng : Đối chứng âm, giếng 1, 3, 5: sản phẩm cắt b ng enzymecủa BN#9802 mô u,LCU, BN# 8619 mô u, giếng 2, 4, sản phẩ PCR tương ứng Từ hình 3.10 cho thấy, có mẫu sản phẩm PCR sau cắt enzyme DdeI ho băng ó í h th t ơng ứng 196, 50bp (mẫu d ng 10398A)- giếng hình 3.10A, có mẫu sau cắt en me ho băng ó í h th t ơng ứng 158, 50, 38bp (d ng 10398G) - giếng 1, hình 3.10A Để khẳng đ nh kết PCR-RFLP, 02 mẫu có d ng 10398A 10398G đ ợ nhân d ng giải trình t Kết giải trình t cho thấy hoàn toàn phù hợp với kết PCR-RFLP (hình 3.10B) Kết phân tích PCR-RFLP cho thấy: tần suất d ng 10398G nhóm bệnh nhân 50 tuổi (78 ) o so với nhóm d ới 50 tuổi (53,1%), nhóm nam giới (61%) cao so với nữ giới (53,5%), nhóm bệnh nhân đ i tràng đ i tr tràng (65 ) o so với nhóm tr c tràng (48,8%), nhóm biệt hóa rõ vừ o nhóm biệt hóa kém, gi i đo n o so với gi i đo n N0, gi i đo n III I o so với gi i đo n I II Tuy nhiên, s khác biệt tần suất d ng 10398G theo đặ điểm bệnh h c kể tr n hông ó nghĩ thống kê (P>0,05) Theo đặ điểm gi i đo n T í h th ớc khối u cho thấy: Ở nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n í h th ớc u 3,5cm; thấp nhóm bệnh nhân thuộ gi i đo n í h th ớc u >=3; 0 05) iến đổi G7853A li n qu n với giới tính gi i đo n T bệnh (p0,05) 3.2.4 Các biế ổi gen COX-1 ty thể Giải trình t đo n ADN chứa toàn gen C nhân U Đ 3.13) h ng đ sàng l Hì 3.13: -1t thể 25 mẫu mô u 25 bệnh đ ợc 4/17 biến đổi làm th t số vị trí biế đổi axit amin (hình ổi gen COX-1 ty thể A, B: biến đổi T6253C, C6340T/C (dạng không đồng nh t) - mẫu #17401 C: biến đổi C6455T- mẫu #17180; D: Biến đổi A7299G - mẫu 3753 Biến đổi C6340T d ng biến đổi tr ng th i d tế bào hất làm th đổi axit amin từ Thrionine thành Isoleucine t i v trí 146 phân tử protein gen COX-1 mã hóa Vì vậy, v trí biến đổi 6340 đ ợc l a ch n để sàng l c ph ơng ph p -RFLP với mẫu l i Tổng số mẫu sàng l c biến đổi C6340T h i ph ơng ph p giải trình t PCR-RFLP 86 mẫu rong tr n mẫu u hỉ có (1,16%) mẫu biến đổi hoàn toàn từ C thành T, mẫu (1,16%) có biến đổi d ng d tế bào hất (heteropl smy) Trên mô lân cận u có mẫu biến đổi hoàn toàn (1,16%) mẫu có biến đổi d ng d tế bào hất ính tr n ả mô u lân cận u tần suất biến đổi C6340T chiếm 3,48% (3/86 mẫu) T UẬN Luận n đ th đ ợ nội dung hính mụ ti u đ đề r : ết luận n đ đ p ứng đ ợ Luận n đ th đ ợ nội dung hính mụ ti u đ đề r : ết luận n đ đ p ứng đ ợ Đ x đinh đ ợ tỷ lệ đo n 4977 bp đ nh l ợng đ ợ mứ độ đo n lớn số s o A t thể mẫu mô m u ủ bệnh nhân U Đ m u đối hứng: - - ỷ lệ đo n 4977 bp tr n mẫu mô mẫu m u bệnh nhân U Đ lần l ợt 95 35 14 28 tr n mẫu m u đối hứng 14 29 X đ nh đ ợ đo n 5169 5094 5104 bp ất đo n 4977 bp lo i đo n phổ biến thuộ d ng đột biến sôm ứ độ đo n lớn tr n mô u lân ận u mẫu m u ủ bệnh nhân U Đ m u đối hứng t ơng ứng là: 55 93 55; 55 69 01; 64 63 67 52.08% ±6.25 - Giá tr trung bình số ADN ty thể t ơng đối mô lân cận u (1237 46 1051 12) mô u (1038 50 743 36); m u bệnh nhân (149,49±80,85) Đ hảo s t x đ nh đ ợ tần suất biến đổi g m: A4164G A10398G 6340 G7858A thuộ gen ND1, ND3, COX-1, COX-2 t ơng ứng mẫu mô mẫu m u ủ bệnh nhân U Đ mẫu m u đối hứng Đ đ nh gi đ ợc mối liên quan biến đổi A4164G, A10398G, G7853A, số s o t ơng đối, mứ độ đo n lớn ADN ty thể với số đặ điểm bệnh h c lâm sàng - Các biến đổi A4164G, A10398G, G7853A, số s o t ơng đối, mứ độ - - đo n lớn ADN ty thể có mối liên quan với gi i đo n T bệnh U Đ (P