Đề tài này được thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxy hóa, ức chế xanthine oxydase của cao chiết từ Diệp hạ châu và râu mèo trên chuột nhắt trắng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, HẠ ACID URIC MÁU VÀ LỢI TIỂU CỦA CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU – RÂU MÈO TRÊN THỰC NGHIỆM Đỗ Thị Quỳnh Nga*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Cho tới nay, có số cơng trình nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ acid uric máu (do ức chế xanthine oxidase) lợi tiểu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn), tác dụng tăng thải acid uric qua nước tiểu chống oxy hóa Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) Xanthin oxydase chất oxy hóa xúc tác q trình tạo acid uric máu Đề tài thực với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxy hóa, ức chế xanthine oxydase cao chiết từ Diệp hạ châu Râu mèo chuột nhắt trắng Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao đặc Diệp hạ châu đắng Trung tâm dược liệu Miền trung sản xuất Cao khô Râu mèo công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp Nghiên cứu in vitro: Khảo sát hoạt tính ức chế xanthin oxidase (XO) cao Diệp hạ châu, cao Râu mèo cao phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo với tỷ lệ phối hợp khác Xác định khả ức chế peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl diadehyd (MDA) Nghiên cứu in vivo: Tác dụng hạ acid uric máu: Các cao thử cho uống dự phòng ngày trước gây mơ hình gây tăng acid uric cấp chuột nhắt trắng kali oxonat (tiêm phúc mơ 300 mg/kg) Ở mơ hình gây tăng acid uric mạn cách tiêm cách nhật liều kali oxonat giảm dần (từ 300 mg/kg xuống 150 mg/kg), cao thử cho uống liên tục 14 ngày Dùng Allopurinol 300mg làm đối chiếu dương Tác dụng lợi tiểu: Cho chuột uống liều cao thử sau nhịn đói khơng uống nước vòng 18 trước Dùng Furosemide 40mg làm đối chiếu dương Kết quả: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo tỷ lệ phối hợp 4:1 có hoạt tính ức chế XO với IC50 43,83µg/ml Tỷ lệ phối hợp phần cao đặc Diệp hạ châu phần cao khô Râu mèo cho hiệu chống oxy hóa tối ưu nhất, nồng độ 50µg/ml 66,79% tương đương với hoạt tính Trolox nồng độ 5mM (63,49%) Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo liều [100mg DHC + 25mg RM]/kg vừa có tác dụng lợi tiểu vừa thể khả hạ acid uric máu sử dụng với mục đích dự phòng điều trị tăng acid uric kéo dài tương tự Allopurinol Kết luận: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo có hoạt tính ức chế XO, hạ acid uric máu, có tác dụng chống oxy hóa lợi tiểu thực nghiệm Kết làm sở cho nghiên cứu ứng dụng cao chiết phối hợp điều trị tăng acid uric máu rối loạn khác chất oxy hóa gây Từ khóa: Diệp hạ châu đắng, Râu mèo, ức chế xanthine oxidase, chất oxy hóa, tác dụng chống oxy hóa ABSTRACT THE ANTIOXIDATIVE EFFECT OF PHYLLANTHUS AMARUS – ORTHOSIPHON STAMINEUS EXTRACT IN VITRO Do Thi Quynh Nga, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No – 2014: 227 - 234 Objectives: There have been researches proven the hypouricemic and diuretic effect of Phyllanthus amarus, the diuretic effect and uric excretion of Orthosiphon stamineus Xanthine oxidase is an oxidant that catalyses in * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Đỗ Thị Quỳnh Nga ĐT: 0984128211 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Email: dtquynhngath@hotmail.com.vn 227 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 uric acid producing process Our study is done with the aim of surveying antioxidative effect of coordinated extract from Phyllanthus amarus and Orthosiphon stemineus in vitro Methods: Aqueous extract of Phyllanthus amarus was produced by The Central of Research and Manufacture Mien Trung Dry extract of Orthosiphon stamineuswas provided by BV Pharma Company In vitro study: Surveying the xanthine oxidase (XO) inhibitory activity of extract from Phyl, extract from Orth and coordinated extract from Phyl and Orth Surveying the inhibition of lipid peroxidation through measuring malonyl diadehyde (MDA) content In vivo study: - Hyperuricemic reductive activity: Mice had been administered with coordinated herbal extract for days before making acute model The acute model of hyperuricemia was created by abdominal injection with potassium oxonate in mice (dose: 300mg/kg) In the chronic model, which was created by abdominal injection every other day with potassium oxonate in cutting down doses (from 300mg/kg to 150mg/kg), mice were administered continuously for 14 days with herbal extracts Allopurinol was used as a positive reference - Diuretic effect: Mice had not been served any food or water for 18 hours before administering the only dose of each herbal extracts Furosemide was used as a positive reference Results: The in vitro study confirmed that coordinated extract in 4:1 ratio has XO inhibitory activity with IC50at 43.83 µg/ml In vitro studies showed that coordinated extract at dose of (100mg Phyl + 25mg Orth)/kg has diuretic effect as well as hypouricemic activity in both purpose of prevention and treatment These effects are as similar as those by furosemide and allopurinol The in vitro study confirmed that coordinated extract in 4:1 ratio has XO inhibitory activity with IC50 at 43.83 µg/ml Coordinated extract in 1:1 ratio has optimal inhibitory effect, at 50µg/ml concentrationise quivalent to 66.79% of Troloxactivityat a concentration 5mM (63.49%) Conclusion: The coordinated extract of Phyllanthus amarus and Orthosiphon stamineus has XO inhibitory activity, antioxidative effect invitro These results will be the basis for researches and applications in the treatment of hyperuricemia and other disorders caused by oxidants Keywords: Phyllanthus amarus Schum et Thonn, Orthosiphon stamineusBenth., xanthine oxidase inhibitory activity, oxidant, antioxidative effect 47,2% dân số khác có xu hướng ĐẶT VẤN ĐỀ ngày gia tăng Trong đó, 90% tăng Gốc tự sản phẩm q trình oxy acid uric máu đơn khơng có triệu chứng hóa chất thể Tuổi cao thêm lâm sàng Trước đây, nói tới tăng acid uric vào thói quen lạm dụng độc chất (thuốc máu thường người ta nghĩ tới bệnh Gout, lá, cà phê, dược phẩm ), dinh dưỡng sai lầm nhiên có nhiều cơng trình nghiên làm cho lượng gốc tự thể cứu bệnh lý quan trọng khác như: tăng huyết áp, tăng lên nhiều bệnh mạch máu não, bệnh lý chuyển hóa, bệnh Khi có tăng nhiều gốc tự gây thận, tiền sản giật tình trạng viêm nhiễm quan, bệnh lý Diệp hạ châu Râu mèo hai thuốc tim mạch, bệnh thần kinh, đục thuỷ tinh nam chứng minh có tác dụng chống thể, thối hóa hồng điểm mắt, tăng nguy oxy hố cao có khả ức chế Xanthin bệnh ung thư sớm xuất hiện oxydase độc lập Đề tài thực với tượng lão hố mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxy hóa, ức Một gốc tự thường gặp Xanthin oxydase – gốc tự chịu trách nhiệm khâu trình tạo acid uric máu Mà tăng acid uric máu dạng rối loạn chuyển hóa thường gặp, chiếm tỉ lệ từ 2,6 – 228 chế xanthine oxydase cao chiết từ Diệp hạ châu Râu mèo để làm sở cho nghiên cứu chế phẩm Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU đo giảm Đối tượng nghiên cứu Quy trình thử hoạt tính ức chế xanthine oxidasetheo bảng sau: Cao đặc Diệp hạ châu chiết xuất từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), trồng theo tiêu chuẩn VietGAP Cao chiết thiết bị chiết đa Trung tâm dược liệu Miền trung Cao khô Râu mèo chiết xuất từ Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.), họ Hoa môi (Lamiaceae), công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, – tuần tuổi, trọng lượng 20 ± g, cung cấp Viện Pasteur TP HCM để ổn định tuần trước thử nghiệm Thuốc thử nghiệm Thuốc đối chiếu: Allopurinol 300 mg (công ty Domesco, Việt Nam, số đăng ký VNB-4166-05, số lô 010111, hạn sử dụng 170114) Viên nén Furosemide 40mg (công ty Mekophar, Việt Nam, hạn dùng 20/06/14) Mẫu trắng tiến hành tương tự thay enzym mẫu thử đệm.Mẫu chứng có dịch enzym khơng có mẫu thử mà thay đệm Đo mật độ quang bước sóng 290 nm liên tục phút 30 phút tính từ lúc cho xanthine vào cuvet Khả chống oxy hóa tính dựa phần trăm ức chế (%I) xác định theo công thức: I% = (1 – Ac/As) x 100 Hoá chất: xanthine (Sigma, USA); xanthine oxidase (Sigma); oxonat kali (Sigma Aldrich, USA); kit định lượng acid uric (uric acid liquicolor, Human ltd.Co., Đức); nước cất, NaCl 0,9%, EDTA; đệm phosphat 50 mM, pH = 7,5; đệm EDTA phosphat 50 mM, pH = 7,5 Với: Ac giá trịmật độ quang dung dịch khơng có mẫu thử (control) As giá trị mật độ quang dung dịch có chứa mẫu thử (sample) Phương pháp nghiên cứu(4) ức chế (%I) Lấy trung bình giá trị %I từ Phương pháp nghiên cứu in vitro xác định hoạt tính ức chế xanthine oxidase Xanthin oxidase (XO) có tác dụng xúc tác phản ứng oxy hóa xanthin thành uric acid, đồng thời hình thành gốc tự Ta sử dụng phương pháp trắc quang để khảo sát khả ức chế enzym XO mẫu thử thông qua mật độ quang sản phẩm acid uric hình thành Acid uric có bước sóng hấp thu cực đại 290nm Chất có khả ức chế XO cao ức chế hình thành uric acid, mật độ quang Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Mỗi nồng độ tiến hành lần, ứng với nồng độ ta tính giá trị phần trăm ta xác định giá trị phần trăm ức chế ứng với nồng độ khảo sát Mỗi mẫu thử pha thành bốn nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10µM Nếu hoạt tính mẫu thử ức chế 50% 10µM thử tiếp nồng độ nhỏ 5; 2; 1; 0,5; 0,2µM để tìm giá trị IC50 Giá trị IC50 µg/ml (nồng độ có khả ức chế 50%) mẫu tính dựa đồ thị hồi quy tương quan nồng độ (Cpư) khả ức chế (I%) 229 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Khả ức chế peroxy hóa lipid(1,1) Xác định khả ức chế peroxy hóa lipid mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng MDA, sản phẩm q trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin có đỉnh hấp thu cực đại λ = 532 nm 0,1ml mẫu thử nồng độ thử nghiệm cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não đệm phosphate 50 mM vừa đủ ml Ủ hỗn hợp phản ứng 370C 15 phút dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Sau ly tâm lấy dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% 15 phút nhiệt độ 1000C, làm lạnh tiến hành đo quang bước sóng λ = 532 nm Trolox (Calbiochem Ltd Co.), đồng phân vitamin E dùng làm chất đối chiếu Cơng thức tính phần trăm (%) hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): (ODC − ODT ) ×100 OD C HTCO (%) = ODC: Mật độ quang mẫu đối chứng (DMSO) ODT: Mật độ quang mẫu thử Các số liệu kết thử nghiệm biểu thị trị số trung bình lần đo khác Cách tính IC50 : Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả dập tắt gốc tự chất cần thử nghiệm phần mềm Excel Từ đồ thị, nội suy giá trị nồng độ dập tắt gốc tự IC50 cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b y = 50 để suy IC50 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ acid uric thực nghiệm(3,5) Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric dự phòng mơ hình tăng acid uric cấp Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô Cho chuột uống nước 230 cất thuốc nghiên cứu với thể tích 0,1 ml/10g chuột -Lô chứng trắng (lô BT): uống nước cất -Lô chứng bệnh lý (lô MH): uống nước cất -Lô đối chiếu (Lô A): uống Allopurinol 10 mg/kg thể trọng -Lô DHC: uống cao chiết Diệp hạ châu 200 mg/kg thể trọng -Lô RM: uống cao chiết Râu mèo 200 mg/kg thể trọng -Lô 4DHC:1RM(1): uống cao chiết phối hợp DHC (100 mg/kg) Râu mèo (25 mg/kg) -Lô 4DHC:1RM(2): uống cao chiết phối hợp DHC (200 mg/kg) Râu mèo (50 mg/kg) -Lô 4DHC:1RM(4): uống cao chiết phối hợp DHC (400 mg/kg) Râu mèo (100 mg/kg) Áp dụng mơ hình gây tăng cấp acid uric kali oxonat, chuột uống nước cất thuốc thử nghiệm vào định vòng ngày trước làm thử nghiệm Trước dùng nước cất thuốc thử nghiệm 1,5 giờ, chuột không ăn uống nước bình thường Ngày thứ 5, chuột lô chứng trắng tiêm màng bụng với nước cất 0,1ml/10g thể trọng, lơ lại tiêm kali oxonat 0,1ml/10g với liều 300 mg/kg thể trọng trước uống thuốc lần cuối Sau uống thuốc giờ, lấy máu đuôi chuột để định lượng nồng độ acid uric huyết Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric mơ hình tăng acid uric kéo dài 14 ngày Chuột chia thành lô (mỗi lô – con) Cho chuột uống nước cất thuốc nghiên cứu với thể tích 0,2 ml/10g chuột, tối đa 0,5 ml cho chuột -Lô chứng trắng (lô BT): uống nước cất -Lô chứng bệnh lý (lô MH): uống nước cất -Lô A (đối chiếu): uống Allopurinol 10 mg/kg thể trọng -Lô DHC: uống cao chiết Diệp hạ châu 200 mg/kg thể trọng Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học -Lô RM: uống cao Râu mèo 200 mg/kg thể trọng -Lô 4DHC:1RM(1): uống cao chiết phối hợp DHC (100 mg/kg) Râu mèo (25 mg/kg) -Lô A cho uống Allopurinol 10 mg/kg vào ngày thứ liên tục ngày sau DHC (100 mg/kg) Râu mèo (25 mg/kg) -Lô F: uống Furosemid 40mg/kg liều 10mg/kg thể trọng Các lơ lại uống nước cất thuốc thử nghiệm vào định ngày liên tục 14 ngày Phương pháp xử lý số liệu thống kê thực nghiệm Dùng phần mềm Stata 10.0 để tính giá trị thống kê mơ tả: số trung bình, độ lệch chuẩn Lơ BT tiêm phúc mơ nước cất 0,1ml/10g chuột, tất lơ lại tiêm phúc mơ kali oxonat cách ngày, liều 300 mg/kg (ngày 1), giảm dần xuống 250 mg/kg (ngày 3), 200 mg/kg (ngày 5) trì liều 150 mg/kg (ngày 7, 9, 11, 13) Lấy máu đuôi chuột thời điểm ngày 14 để định lượng acid uric huyết Nghiên cứu tác dụng lợi tiểu(6) Trước làm thử ngiệm, không cho chuột ăn uống nước vòng 18 Sau đó, chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô Cho chuột uống nước cất thuốc nghiên cứu với thể tích 0,2 ml/10g chuột -Lơ BT: uống nước cất -Lô DHC: uống cao đặc Diệp hạ châu 200mg/kg thể trọng -Lô RM: uống cao khô Râu mèo liều 200mg/kg thể trọng -Lô 4DHC:1RM: uống cao chiết phối hợp Bảng 1: Kết thử hoạt tính ức chế xanthin oxidase Tên mẫu 4DHC:1RM 3DHC:1RM 2DHC:1RM DHC 100 (µg/mL) 71,0 ± 1,5 61,2 ± 2,9 63,3 ± 1,8 69,05 ± 0,80 RM 57,2 ± 2,2 30,7 ± 1,3 43,80 ± 0,97 40,97 ± 1,8 32,8 ± 1,5 32,0 ± 2,2 30,38 ± 0,39 30,09 ± 0,61 35,04 ± 0,81 20,95 ± 0,82 15,3 ± 2,0 24,2 ± 2,5 18,7 ± 2,1 17,1 ± 2,7 1DHC:2RM 1DHC:3RM 3DHC:2RM 2DHC:5RM 1DHC:4RM 1DHC:1RM Allopurinol Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Ứng dụng phép kiểm t – Student độc lập để so sánh số trung bình lô khác thời điểm Ứng dụng phép kiểm Anova yếu tố để đánh giá khác biệt trị số acid uric lô thử nghiệm thời điểm KẾT QUẢ Tác dụng ức chế Xanthin oxidase tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo khác Thuốc đối chiếu Allopurinol có khả ức chế XO nồng độ thấp cho kết IC50 = 0,063 µg/ml Cả cơng thức phối hợp thể tác dụng ức chế XO, thứ tự khả ức chế giảm dần là: 4DHC:1RM > 3DHC:1RM > 2DHC:1RM > 1DHC:2RM > 1DHC:3RM > 2DHC:5RM > 1DHC:4RM > 1DHC:1RM Phần trăm ức chế 50 (µg/mL) 25 (µg/mL) 52,2 ± 3,5 43,23 ± 0,45 41,6 ± 1,4 21,84 ± 0,78 34,61 ± 0,99 24,1 ± 1,4 48,6 ± 1,9 33,9 ± 2,6 STT 10 11 Sau uống nước cất thuốc nghiên cứu, chuột khơng ăn uống thêm Hứng đo lượng nước tiểu chuột sau giờ, 24 10 (µg/mL) 16,7 ± 2,7 8,76 ± 0,59 9,6 ± 4,3 19,7 ± 1,9 IC50 (µg/mL) 43,83 71,36 76,81 84,46 5,9 ± 2,2 2,31 ± 0,81 87,65 19,0 ± 3,0 6,6 ± 1,6 2,9 ± 2,3 18,9 ± 1,6 9,8 ± 1,9 6,1 ± 3,5 9,4 ± 1,9 5,2 ± 2,3 3,6 ± 2,9 - > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 0,063 231 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học Khả ức chế peroxy hóa lipid Bảng Kết thử test MDA tỷ lệ phối hợp cao chiết Diệp hạ châu Râu mèo Nồng độ (µg/ml) 2000 1000 500 250 100 50 10 HTCO (%) 1DHC:1 2DHC:1 3DHC:1 4DHC:1 5DHC:1 RM RM RM RM RM 91,30 86,72 86,26 84,96 75,88 91,30 80,38 79,01 76,64 76,18 90,46 73,82 67,63 65,80 62,82 89,16 53,59 57,71 63,36 54,96 82,37 30,76 53,82 56,34 45,50 66,79 20,38 48,24 46,49 40,23 32,52 5,73 24,35 27,02 16,56 Cả tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo nghiên cứu thể hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tăng theo nồng độ khảo sát Trong đó, nhìn sơ cho thấy tỷ lệ phối hợp phần cao đặc Diệp hạ châu phần cao khô Râu mèo cho hiệu ức chế tối ưu Tỷ lệ phối hợp đạt hoạt tính chống oxy hố nồng độ 50µg/ml 66,79% tương đương với hoạt tính Trolox nồng độ 5mM (63,49%) Bảng Kết thử mẫu đối chiếu Nồng độ (mM) 0,1 0,5 10 Trolox/MDA OD 0,529 0,445 0,376 0,203 0,124 HTCO% 4,86 19,96 32,37 63,49 77,70 Kết nghiên cứu tác dụng hạ acid uric dự phòng mơ hình tăng acid uric cấp Lơ chuột uống cao chiết độc vị Diệp hạ châu liều 200 mg/kg, lô uống cao chiết độc vị Râu mèo liều 200 mg/kg, lô uống cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo theo tỷ lệ 4:1 có tác dụng hạ acid uric máu chuột thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,001) tương tự lô uống Allopurinol Bảng Hàm lượng acid uric máu lô thử nghiệm mơ hình tăng acid uric cấp Lơ N Liều dùng Đối chứng trắng Đối chứng bệnh Alopurinol Râu mèo Diệp hạ châu Lô 4DHC:1RM (4) Lô 4DHC:1RM (2) Lô 4DHC:1RM (1) 6 6 6 6 10 mg/kg 200 mg/kg 200 mg/kg (400 mg DHC + 100 mg RM)/kg (200 mg DHC + 50 mg RM)/kg (100 mg DHC + 25 mg RM)/kg Nồng độ acid uric (mg/dl) 1,29 ± 0,23 1,83 ± 0,12 0,95 ± 0,22** 1,02 ± 0,14** 0,93 ± 0,08** 0,86 ± 0,1** 0,88 ± 0,1** 0,75 ± 0,28** Tỷ lệ giảm so với lô đối chứng bệnh # 48% 44% 49% 53% 52% 59% #P< 0,001: So với lô chứng trắng; **P