Chùm ngây chứa nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa, đặc biệt là isoquercitrin. Đề tài này nhằm khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá chùm ngây (moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thương do rượu gây ra trên dòng tế bào HepG2.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) PHÒNG NGỪA TỔN THƢƠNG DO RƢỢU GÂY RA TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Đỗ Thị Hồng Tươi*, Trần Nguyễn Thủy Tiên*, Nguyễn Hoàng Quân*,Dương Thị Mộng Ngọc* TÓM TẮT Mở đầu: Chùm ngây chứa nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa, đặc biệt isoquercitrin Đề t|i n|y “Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thương rượu gây dòng tế b|o HepG2” Phương pháp: HepG2 ni cấy môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin Xử lý tế bào với isoquercitrin (IQ), cao ethyl acetat (EC), cao cồn 70% (CC) từ Chùm ngây với h|m lượng isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml (ký hiệu NĐ1, NĐ2, NĐ3) có/khơng bổ sung ethanol 100 mM 24 Đ{nh gi{ t{c dụng bảo vệ gan phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế bào (test MTT), tích lũy lipid (nhuộm dầu đ O), hoại tử tế bào (test LDH), tình trạng stress oxy hóa qua lượng glutathion nội bào, hoạt hóa apoptosis (nhuộm AO/EB, định lượng ADN phân mảnh v| điện di ADN gel) Kết quả: Sau 24 giờ, so với mẫu sinh lý, ethanol 100 mM làm giảm 25,6% tỷ lệ sống tế bào HepG2, 31,3% h|m lượng GSH v| l|m tăng 39,4% lượng lipid nội bào, 30% hoạt tính LDH ngoại b|o v| 65,2% lượng ADN phân mảnh Cả mẫu thử từ l{ Chùm ng}y thể tác dụng phòng ức chế tăng trưởng nồng độ khảo sát với hiệu khoảng 42 - 250% Bổ sung IQ EC NĐ2, NĐ3 giúp tăng lượng GSH tế bào HepG2 so với mẫu ethanol với hiệu 100 - 173% Tác dụng gây hoại tử tế bào ethanol 100 mM giảm khoảng 77 - 170% bổ sung EC, CC nồng độ IQ NĐ2 Đối với apoptosis, tỷ lệ ADN phân mảnh giảm 70 - 100% bổ sung IQ nồng độ, EC CC NĐ3 Kết phù hợp với hình ảnh nhuộm AO/EB v| điện di ADN gel agarose Kết luận: Các mẫu thử từ l{ Chùm ng}y, đặc biệt cao ethyl acetat có tác dụng phòng ngừa tổn thương tế bào gan HepG2 ethanol 100 mM gây sau 24 Như vậy, nghiên cứu phát triển thuốc từ Chùm ng}y để phòng và/hoặc điều trị bệnh gan nói chung v| rượu nói riêng Từ khóa: Chùm ngây, bảo vệ tế b|o gan, rượu, dòng tế bào HepG2 ABSTRACT STUDY ON HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF MORINGA OLEIFERA LAM TO PREVENT HEPATOCYTE ALCOHOL-INDUCED LESSON IN HEPG2 CELL LINE Do Thi Hong Tuoi, Tran Nguyen Thuy Tien, Nguyen Hoang Quan, Duong Thi Mong Ngoc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 359 - 367 Background: Moringa oleifera Lam is rich of strong antioxidant reagents, especially isoquercitrin This work has studied on effect of M oleifera Lam leaves to prevent alcohol-induced hepatotoxicity in HepG2 cell line Methods: HepG2 cells were cultured in EMEM supplemented with 10% FCS, mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin Cells were treated with different samples including isoquercitrin (IQ), ethyl acetate (EC) or 70% ethanolic extracts (CC) from M oleifera Lam leaves at concentrations * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Đỗ Thị Hồng Tƣơi ĐT: 0908683080 Chuyên Đề Dƣợc Email: hongtuoi@ump.edu.vn 359 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 corresponding to that of isoquercitrin at 2.5, 5, 10 μg/ml (NĐ1, NĐ2 and NĐ3, respectively) alone or combined with 100 mM ethanol for 24h Hepatoprotective effect was evaluated through several assays including cell proliferation (MTT test), lipid accumulation (O red oil staining), necrosis (LDH test), oxydant stress (cellular glutathione content) and apoptosis activation (AO/EB staining, DNA fragmentation) Results: After 24 hours, ethanol 100 mM decreased 25.6% cell viability and 31.3% GSH content, on the other hand, increased 39.4% lipid accumulation, 30% extracellular LDH activity and 65.2% DNA fragmentation compared to control All of samples IQ, EC and CC from Moringa leaves have been shown prevention of antiproliferation at tested concentrations with efficiency of 42-250% The addition of IQ, EC at NĐ2, NĐ3 inscreased 100 - 173% of intracellular GSH level Necrotic effect of 100 mM ethanol was decreased 77-170% in presence of EC, CC at tested concentrations and IQ at NĐ2 For apoptosis, DNA fragmentation was decreased 70 - 100% in presence of IQ at tested concentrations, EC and CC at NĐ3 compared to ethanol alone This result corresponded to AO/EB staining and agarose gel electrophoresis Conclusion: Three samples from M oleifera Lam Leaf, especially ethyl acetate extract were shown to prevent HepG2 cells injury induced by 100 mM ethanol treatment for 24h Therefore, M oleifera Lam leaf could be studied to develop drugs for prevention and/or treatment of liver diseases in general and alcoholic liver diseases in particular Key words: Moringa oleifera Lam, hepatoprotective effect, alcohol, HepG2 cell line Lam.) có khả chống oxy hóa bảo vệ gan ĐẶT VẤN ĐỀ chuột nhắt trắng(12) Tuy nhiên, chƣa có Gần đ}y, tỷ lệ ngƣời Việt Nam mắc bệnh gan nghiên cứu sàng lọc cách hệ thống cấp độ nói chung bệnh gan rƣợu nói riêng ngày tế b|o để chứng minh sở khoa học cách c|ng tăng Một nguyên nhân đầy đủ tác dụng dƣợc liệu Gần đ}y, tình trạng lạm dụng rƣợu bia Tỷ lệ lạm nhóm nghiên cứu chúng tơi x}y dựng dụng nghiện rƣợu thành phố 10% đƣợc mơ hình in vitro sử dụng dòng tế bào gan vùng núi khoảng 17%, đa số nam giới HepG2 mơ tình trạng tổn thƣơng tế ban độ tuổi 20-30 tuổi Ƣớc tính khoảng 5% số dân gan rƣợu(3) Đề tài tiến h|nh “Khảo sát tác nƣớc ta bị xơ gan, 65% trƣờng hợp xơ dụng bảo vệ tế bào gan Chùm ngây gan rƣợu (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thƣơng Các nhóm thuốc hóa tổng hợp rƣợu gây dòng tế b|o HepG2” với interferon để kiểm soát bệnh gan cho kết mục tiêu sàng lọc tác dụng bảo vệ tế bào gan không ổn định, nguy xảy tác dụng phụ cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ v| gi{ th|nh tƣơng đối đắt Do vậy, xu hƣớng Chùm ngây mơ hình mơ tình trạng phát triển sử dụng thuốc từ dƣợc tổn thƣơng tế b|o gan thƣờng gặp bệnh liệu giúp bảo vệ gan giai đoạn sớm, điều nhân bị bệnh gan rƣợu trị bệnh gan kịp thời nhằm cải thiện tiên lƣợng ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU tính an tồn sử dụng thƣờng xun, Dòng tế bào lâu dài Việt Nam có nguồn dƣợc liệu đa dạng, nhiều dƣợc liệu đƣợc dùng trị bệnh gan nhƣ củ Nghệ, Diệp hạ châu Chùm ngây với tác dụng bảo vệ gan đƣợc quan tâm nghiên cứu Gần đ}y, b{o c{o Nguyễn Bảo Trân cho thấy cao cồn từ Chùm ngây (Moringa oleifera 360 HepG2 (ATCC HB8065R) hoạt hóa Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Hóa chất Mơi trƣờng EMEM, huyết bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA (Gibco, Mỹ); L-glutamin, penicilin-streptomycin, albumin huyết bò Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 (BSA), đệm phosphat, trypan blue, ethanol, MTT, dầu đỏ O, Brilliant G250, L-lactic dehydrogenase, acid oleic, acid palmitic, quercetin, isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ), kit LDH (Roche, Đức), diphenylamin, methanol (Merck, Đức) Tất hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết cấp độ Mẫu thử Isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ): ký hiệu IQ, độ tinh khiết ≥ 98% Cao cồn 70% (CC) cao ethyl acetat (EC) từ Chùm ngây (Tri Tôn, An Giang) cung cấp Trung t}m S}m & Dƣợc liệu Tp HCM, đạt tiêu chuẩn sở Từ thí nghiệm sơ bộ, chọn nồng độ ứng với h|m lƣợng isoquercitrin 2,5; v| 10 µg/ml không g}y độc tế b|o để khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 (Bảng 1) Bảng 1: Nồng độ khảo sát mẫu thử Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Hàm lượng isoquercitrin 14,09 2,41 (% kl/kl) cao Độ ẩm cao (%) 16,18 19,50 Nồng độ cuối môi trường nuôi cấy (µg/ml) Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% Ký hiệu (IQ) (EC) (CC) NĐ1 2,5 (IQ1) 21,2 (EC1) 128,9 (CC1) NĐ2 5,0 (IQ2) 42,3 (EC2) 257,7 (CC2) NĐ3 10,0 (IQ3) 84,7 (EC3) 515,5 (CC3) Phƣơng pháp nghiên cứu Nuôi cấy xử lý tế bào Tế bào HepG2 nuôi cấy môi trƣờng EMEM, bổ sung 10% FCS, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin ủ 37oC, 5% CO2 đến độ phủ 70-80% Thu v| đếm tế bào sống với trypan blue, chia v|o đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 2,5 × 104 tế bào/cm2 Ủ 24 37oC, 5% CO2, xử lý tế bào với IQ, EC, CC tƣơng ứng với isoquercetin 2,5; 5; 10 µg/ml (ký hiệu: NĐ1, NĐ2, NĐ3) quercetin 10 µM có khơng bổ sung ethanol 100 mM 24 Nồng độ DMSO cuối môi trƣờng 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến tế bào(7) Mẫu chứng bổ sung DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Đánh giá tỉ lệ tế bào sống test MTT Tỷ lệ tế bào sống x{c định qua hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) ty thể có tế bào sống SDH chuyển MTT [3-(4,5dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan isopropanol tạo dung dịch tím, OD đo 570 nm phản ánh số lƣợng tế bào sống Đánh giá tình trạng tích lũy lipid phương pháp nhuộm dầu đỏ O Dầu đỏ O thuốc nhuộm lipid, di chuyển từ dung môi vào hạt mỡ tế bào gan làm chúng có m|u đỏ quan s{t đƣợc dƣới kính hiển vi quang học Các hạt mỡ nhuộm dầu đỏ O đƣợc hòa tan isopropanol tạo dung dịch m|u đỏ OD đo 500 nm phản {nh lƣợng lipid tế bào giếng Định lượng glutathion (GSH) nội bào Sự tăng sinh gốc oxy hóa làm giảm GSH nội bào Bổ sung acid tricloroacetic vào dịch ly giải tế bào, ly tâm lấy dịch trong, thêm EDTAphosphat, ủ phút với thuốc thử Ellman [5,5dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)] Đo OD 412 nm Lƣợng GSH (µM/mg protein) đƣợc tính dựa theo đƣờng cong chuẩn độ GSH chuẩn (0 200 µM) Protein tồn phần đƣợc x{c định phƣơng ph{p Bradford với thuốc nhuộm Coomassie mẫu chuẩn albumin huyết cừu (0 - mg/ml) Đánh giá tình trạng hoại tử tế bào gan Tình trạng hoại tử đ{nh gi{ qua hoạt tính lactat dehydrogenase (LDH) phóng thích vào mơi trƣờng ni cấy kit “Cytotoxicity Detection LDH” LDH xúc t{c phản ứng kép chuyển pyruvat thành lactat, tetrazolium màu v|ng th|nh formazan m|u đỏ, đo OD 492 nm X{c định hoạt tính LDH dựa v|o đƣờng cong chuẩn độ (0-1000 mU/ml) LDH chuẩn Đánh giá trình apoptosis Quan sát tế b|o apoptosis dƣới kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm acridin orange/ethidium bromid ADN phân mảnh 361 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 đƣợc định lƣợng diphenylamin tạo dung dịch có m|u đo OD 600 nm v| điện di gel agarose 2% Hiệu phòng ngừa tổn thương tế bào gan Hiệu bảo vệ tế bào gan HepG2 mẫu thử phòng ngừa tổn thƣơng ethanol 100 mM đƣợc tính theo công thức: HQ (%) = [(kết quảethanol - kết quảethanol bổ sung mẫu )/(kết quảethanol - kết quảsinh lý)] x 100 thử Phân tích kết xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại lần Kết trình b|y dƣới dạng trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM) mẫu cho điều kiện nuôi cấy thí nghiệm đại diện Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 với phép kiểm Kruskal-Wallis Mann-Whitney phần mềm SPSS 20.0 KẾT QUẢ Tác dụng phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào Tác dụng phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào rƣợu gây cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ng}y đ{nh gi{ thử nghiệm MTT đƣợc trình bày Bảng Bảng 2: Tác dụng phòng ngừa ức chế tăng trưởng tế b|o gan HepG2 rượu gây sau 24 cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ Chùm ngây isoquercitrin OD570 trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu Isoquercitrin Cao ethyl Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% (Nồng độ IQ) (IQ) acetat (EC) (CC) (IQ) (EC) (CC) ## ## ## NĐ1 (2,5 µg/ml) 0,356 ± 0,018* 0,390 ± 0,010** 0,342 ± 0,021* 0,370 ± 0,016 ** 0,411 ± 0,023 ** 0,326 ± 0,020 # ## ## NĐ2 (5 µg/ml) 0,373 ± 0,017** 0,371 ± 0,018** 0,386 ± 0,010** 0,304 ± 0,022 0,355 ± 0,013 ** 0,273 ± 0,010 * ## ## NĐ3 (10 µg/ml) 0,375 ± 0,021** 0,387 ± 0,009** 0,362 ± 0,017* 0,343 ± 0,021 ** 0,382 ± 0,013 ** 0,253 ± 0,019 Chứng 0,297 ± 0,005 0,221 ± 0,019** # Quercetin 0,311 ± 0,007 0,261 ± 0,007 NĐ1 196,1 249,6 137,7 % phòng NĐ2 109,0 176,5 68,9 ngừa so với mẫu NĐ3 160,1 211,4 41,9 chứng Quercetin 53,1 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Các mẫu thử riêng lẻ không độc tế bào, nồng độ NĐ1, NĐ2, NĐ3 mẫu thử không thay đổi tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng sinh lý (p > 0,05) Ethanol 100 mM ức chế tăng trƣởng tế bào HepG2, làm giảm tế bào sống 25,6% so với mẫu chứng (p < 0,05) Sự ức chế tăng trƣởng đƣợc phòng ngừa bổ sung v|o mơi trƣờng ni cấy quercetin 10 µM (p < 0,05) Bổ sung isoquercitrin, cao ethyl acetat cao cồn 70% v|o môi trƣờng nồng độ ứng với h|m lƣợng isoquercitrin 2,5; 10 µg/ml làm tăng tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng bệnh xử lý với ethanol 100 mM 24 (p < 0,05) 362 Tác dụng phòng ngừa tích lũy lipid Kết tác dụng bảo vệ tế bào gan phòng ngừa tích lũy lipid rƣợu gây cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ Chùm ngây isoquercitrin đƣợc trình bày Bảng Đa số nồng độ khảo sát mẫu thử riêng lẻ l|m tăng tích lũy lipid nội bào khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), NĐ1 cao ethyl acetat, NĐ2 isoquercitrin tăng lần lƣợt 10% 25% so với mẫu sinh lý, NĐ3 cao cồn giảm 16,3% lƣợng lipid (p < 0,05) Ở mẫu ethanol 100 mM, sau 24 giờ, tế bào HepG2 tăng tích lũy lipid 39,4% so với chứng sinh lý (p < 0,05) Quercetin 10 µM giảm tích lũy lipid nội b|o gan rƣợu (p < 0,05) Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Bảng 3: Tác dụng cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây phòng ngừa tích lũy lipid tế b|o gan HepG2 rượu gây sau 24 Ký hiệu Isoquercitrin (Nồng độ IQ) (IQ) NĐ1 (2,5 µg/ml) 0,147 ± 0,013 NĐ2 (5 µg/ml) 0,149 ± 0,006* NĐ3 (10 µg/ml) 0,149 ± 0,014 Chứng Quercetin % NĐ1 phòng NĐ2 ngừa so NĐ3 với mẫu chứng Quercetin OD500 trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Cao ethyl acetat Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% (EC) (CC) (IQ) (EC) (CC) 0,169 ± 0,010** 0,143 ± 0,007 0,194 ± 0,009** 0,160 ± 0,009* 0,249 ± 0,025** # 0,143 ± 0,009 0,159 ± 0,012 0,183 ± 0,006** 0,159 ± 0,006 ** 0,203 ± 0,012** # 0,135 ± 0,005 0,113 ± 0,004** 0,155 ± 0,006 * 0,160 ± 0,006* 0,165 ± 0,009** 0,135 ± 0,003 0,188 ± 0,010** ## 0,129 ± 0,004 0,144 ± 0,004 -11,9 53,1 -115,4 8,8 53,5 -28,9 62,3 52,2 43,4 82,4 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Khi bổ sung cao cồn 70%, cao ethyl acetat, isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y v|o mơi trƣờng chứa ethanol 100 mM, có isoquercitrin 10 µg/ml cao ethyl acetat 42,3 µg/ml bảo vệ tế bào gan làm giảm tình trạng tích lũy lipid so với mẫu tế bào đƣợc xử lý với ethanol 100 mM (p < 0,05) Tuy nhiên, lƣợng lipid tế bào gan đƣợc xử lý đồng thời với ethanol 100 mM mẫu thử chƣa trở mức bình thƣờng mẫu sinh lý Tác dụng cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây thấp quercetin 10 µM Tác dụng giảm tích lũy lipid nội bào khác biệt khơng có ý nghĩa nồng độ mẫu thử mẫu hàm lƣợng isoquercitrin (p > 0,05) Tác dụng phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự Trong tế bào gan, glutathion tự diện dạng khử có nhóm -SH (ký hiệu GSH) chất đóng vai trò chống oxy hóa Các tác nhân gây tổn thƣơng tế bào gan nhƣ rƣợu l|m tăng sinh gốc tự dẫn đến làm giảm lƣợng GSH nội b|o H|m lƣợng GSH tế bào gan cao chứng tỏ khả bảo vệ tế bào mẫu thử phòng ngừa tác hại tác nhân gây oxy hóa cao Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây giúp phòng ngừa tình trạng tăng Chuyên Đề Dƣợc sinh gốc oxy tự gây rƣợu đƣợc trình bày Bảng Cả nồng độ isoquercitrin v| NĐ1 cao cồn 70% giảm lƣợng GSH nội b|o có ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý (p < 0,05) NĐ2, NĐ3 cao cồn 70% v| NĐ3 cao ethyl acetat từ Chùm ng}y tăng lƣợng GSH nội bào so với chứng sinh lý (p < 0,05) Xử lý tế bào với ethanol 100 mM 24 làm giảm 31,3% lƣợng GSH nội bào so với sinh lý (p < 0,01) Quercetin 10 µM giúp lƣợng GSH tăng so với ethanol 100 mM (p < 0,01) v| cao mẫu sinh lý (p < 0,01) So với ethanol 100 mM, nồng độ NĐ2, NĐ3 isoquercitrin v| cao ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa, l|m tăng lƣợng GSH nội bào (p < 0,05) mức tƣơng đƣơng mẫu chứng sinh lý (p > 0,05) Tác dụng phòng ngừa tình trạng stress oxy hóa, tăng lƣợng GSH thấp quercetin 10 µM (p < 0,05) Cả nồng độ khảo sát cao cồn từ Chùm ng}y l|m tăng lƣợng GSH nhƣng khơng có ý nghĩa thống kê so với mẫu ethanol 100 mM (p > 0,05) Nhìn chung, isoquercitrin cao ethyl acetat thể tác dụng phòng ngừa tình trạng oxy hóa rƣợu g}y ra, tăng lƣợng GSH nội bào, tác dụng tốt mẫu có h|m lƣợng isoquercitrin 10 µg/ml; khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê mẫu thử có hàm lƣợng isoquercitrin (p > 0,05) 363 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Bảng 4: Tác dụng cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây chống oxy hóa, giảm tăng sinh gốc tự tế b|o gan HepG2 rượu gây Ký hiệu (Nồng độ IQ) NĐ1 (2,5µg/ml) NĐ2 (5 µg/ml) NĐ3 (10µg/ml) Chứng Quercetin NĐ1 % phòng ngừa NĐ2 so với mẫu NĐ3 chứng bệnh Quercetin Hàm lượng GSH (µM/mg protein) trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% (IQ) (EC) (CC) (IQ) (EC) (CC) 30,6 ± 2,6** 64,8 ± 5,8 38,8 ± 3,6** 45,1 ± 1,1** 54,9 ± 3,7* 50,3 ± 2,5** ## ## 36,8 ± 1,9** 67,5 ± 6,3 75,7 ± 4,0* 67,6 ± 2,1 63,7 ± 6,1 49,9 ± 1,7** # ## 51,2 ± 2,8** 122,5 ± 1,8** 149,1 ± 15,1** 63,8 ± 5,8 77,8 ± 2,6 ** 57,5 ± 4,6 63,3 ± 1,0 43,5 ± 2,1** ## 70,9 ± 3,0 145,6 ± 14,6** 8,4 57,5 34,7 122,0 102,3 32,7 102,9 173,4 70,8 515,6 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoại tử Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoại tử rƣợu g}y đƣợc trình bày Bảng Bảng 5: Tác dụng cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoại tử tế b|o gan HepG2 rượu gây sau 24 Hoạt tính LDH (mU/ml) trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Isoquercitrin Cao ethyl acetat Isoquercitrin Cao ethyl acetat Ký hiệu (Nồng độ IQ) Cao cồn (CC) Cao cồn (CC) (IQ) (EC) (IQ) (EC) # ## NĐ1 (2,5µg/ml) 99,5 ± 3,4** 99,0 ± 3,7** 109,8 ± 3,7 121,1 ± 5,3 123,8 ± 2,7 100,5 ± 4,7* ## # # NĐ2 (5 µg/ml) 96,3 ± 2,9** 101,0 ± 2,8** 102,0 ± 2,4** 112,0 ± 3,2 125,6 ± 5,5 110,5 ± 7,4 # ## NĐ3 (10µg/ml) 94,7 ± 1,2** 125,8 ± 3,3 134,9 ± 8,9 128,4 ± 5,6 121,3 ± 3,6 104,7 ± 2,4** Chứng 119,5 ± 1,5 145,8 ± 8,4* Quercetin 129,2 ± 6,4 127,0 ± 6,5 NĐ1 94,0 83,8 172,4 % phòng ngừa so NĐ2 128,6 76,9 134,2 với mẫu chứng bệnh (ethanol 100 NĐ3 66,4 93,1 156,4 mM) Quercetin 71,5 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) So với mẫu sinh lý, isoquercitrin, cao ethyl acetat, cao cồn 70% từ Chùm ngây làm giảm hoạt tính LDH ngoại bào nồng độ khảo sát, trừ nồng độ NĐ3 cao ethyl acetat cao cồn 70% (p < 0,05) Sau 24 giờ, rƣợu 100 mM gây hoại tử tế b|o gan, tăng hoạt tính LDH ngoại bào 30% so với mẫu sinh lý (p < 0,05) Quercetin 10 µM làm giảm LDH ngoại b|o khơng có ý nghĩa thống kê so với ethanol 100 mM (p > 0,05) Ethanol 100 mM bổ sung mẫu thử isoquercitrin, cao ethyl acetat, cao cồn 70% từ Chùm ngây có hoạt tính LDH ngoại bào giảm so 364 với ethanol 100 mM (p < 0,05) mức tƣơng đƣơng với mẫu sinh lý (p > 0,05), giảm nhiều nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoạt hóa q trình apoptosis Nhuộm huỳnh quang AO/EB cho thấy ethanol 100 mM gây hoạt hóa apoptosis tế bào gan HepG2 sau 24 (Hình 1) Xử lý tế bào đồng thời với ethanol 100 mM cao cồn, cao ethyl acetat Chùm ng}y, isoquercitrin l|m tăng mật độ tế bào, giảm tƣợng bóng màng Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 (bledding) v| cô đặc nhiễm sắc thể so với chứng bệnh ethanol 100 mM (Hình 1) Nghiên cứu Y học Tác dụng phòng ngừa tình trạng phân mảnh ADN gây rƣợu cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ l{ Chùm ng}y v| isoquercitrin đƣợc trình bày Bảng BM NST Chứng sinh lý Ethanol 100 mM Ethanol + isoquercitrin 10 µg/ml Hình 1: Tác dụng Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoạt hóa q trình apoptosis tế bào gan HepG2 rượu gây (BM: bóng màng, NST: nhiễm sắc thể cô đặc) Bảng 6: Tác dụng cao cồn, cao ethyl acetat isoquercitrin từ Chùm ngây phòng ngừa tình trạng phân mảnh ADN tế b|o gan HepG2 rượu gây sau 24 %ADN phân mảnh trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu Isoquercitrin Cao ethyl Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl Cao cồn 70% (Nồng độ IQ) (IQ) acetat (EC) (CC) (IQ) acetat (EC) (CC) ## NĐ1 (2,5 µg/ml) 31,7 ± 0,3** 29,1 ± 3,6 35,6 ± 0,2** 32,5 ± 0,9** 41,9 ± 3,0** 38,7 ±1,0** ## NĐ2 (5 µg/ml) 27,5 ± 0,9 32,1 ± 0,8** 30,0 ± 1,3 29,6 ± 0,3* 44,8 ± 1,4** 40,8 ± 1,2** ## ## ## NĐ3 (10 µg/ml) 30,4 ± 3,8 31,4 ± 0,1** 30,7 ± 2,0 27,3 ± 0,4 33,0 ± 1,1** 28,6 ± 1,5 Chứng 27,6 ± 0,8 45,4 ± 3,2** Quercetin 43,3 ± 0,3 43,5 ± 1,6** NĐ1 72,2 19,6 37,8 % phòng ngừa so NĐ2 88,5 3,5 26,0 với mẫu chứng bệnh (ethanol 100 NĐ3 101,5 69,6 93,9 mM) Quercetin 10,6 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với chứng sinh lý, ##: p < 0,01: so với chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Hình 2: Kết điện di ADN phân mảnh thu dịch tế bào A: mẫu thử riêng lẻ; B: cao thử + ethanol; IQ1, IQ2, IQ3; EC1, EC2, EC3; CC1, CC2, CC3: isoquercitrin, cao ethyl acetat cao cồn 70% từ Chùm ng}y h|m lượng isoquercitrin 2,5 µg/ml; µg/ml; 10 µg/ml; Q: quercetin 10 µM Xử lý tế bào với cao cồn, cao ethyl acetat từ Chùm ngây, isoquercitrin riêng lẻ 24 Chuyên Đề Dƣợc l|m tăng % ADN ph}n mảnh không đ{ng kể so với mẫu sinh lý (p > 0,05) 365 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Sau 24 giờ, ethanol 100 mM l|m tăng mạnh tỷ lệ ADN phân mảnh (45,6% so với 27,6% mẫu sinh lý, p < 0,01) Quercetin 10 µM kết hợp với ethanol 100 mM khơng l|m thay đổi tình trạng apoptosis so với mẫu quercetin ethanol (p > 0,05) Isoquercitrin 2,5; v| 10 µg/ml làm giảm phân mảnh ADN tế bào HepG gây ethanol 100 mM (p < 0,01), khác biệt nồng độ khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Đối với cao cồn 70% cao ethyl acetat, có nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml làm giảm tỷ lệ ADN phân mảnh so với ethanol 100 mM (p < 0,01) Ở nồng độ, isoquercitrin ngăn ngừa tình trạng phân mảnh ADN tốt cao cồn cao ethyl acetat Kết định lƣợng ADN phân mảnh thuốc thử diphenylamin hoàn toàn phù hợp với quan sát ADN phân mảnh gel agarose 2% kỹ thuật điện di (Hình 2) Kết tổng hợp tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 cao cồn 70%, cao ethyl acetat isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y đƣợc trình bày Bảng Bảng 7: Mức độ bảo vệ tế bào gan cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ Chùm ngây isoquercitrin qua % phòng ngừa ức chế tăng trưởng (TT), tích lũy lipid nội b|o (LP), tăng sinh gốc oxy hóa (OX), hoại tử (HT) hoạt hóa apoptosis (AP) ethanol 100 mM Nồng độ NĐ1 NĐ2 NĐ3 Quercetin TT 196 109 160 53 Isoquercitrin (IQ) LP OX HT -12 94 122 129 62 103 66 82 516 71 AP 72 89 102 11 TT 250 177 211 Cao ethyl acetat (EC) LP OX HT 53 58 84 54 102 77 52 173 93 AP 20 70 TT 138 69 42 Cao cồn 70% (CC) LP OX HT -115 35 172 -29 33 134 43 71 156 AP 38 26 94 NĐ1, NĐ2, NĐ3: nồng độ mẫu thử tương ứng với isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml BÀN LUẬN Sau 24 giờ, ethanol 100 mM gây tổn thƣơng tế bào gan HepG2: giảm 25,6% tỷ lệ tế bào sống, 31,3% lƣợng GSH nội bào; tăng 39,3% lƣợng lipid nội bào; 22% hoạt tính LDH ngoại bào gây hoạt hóa apoptosis tăng 64,5% ADN ph}n mảnh Tình trạng tổn thƣơng tế bào gan ethanol 100 mM giảm nhờ quercetin 10 µM, chất đƣợc chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào gan(1,5,6,17,19), trừ trình apoptosis quercetin đƣợc Zhang (2012) báo cáo gây apoptosis(20) Kết tác dụng bảo vệ tế bào gan cao cồn 70%, cao ethyl acetat nồng độ ứng với isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml cho thấy Chùm ngây có khả phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào, giảm tích lũy lipid nội bào, chống oxy hóa, giảm hoại tử apoptosis tế bào gan HepG2 ethanol 100 mM gây phù hợp với b{o c{o trƣớc đ}y tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan Chùm ngây(8-10,2,13,15,16,18) Một số đề tài báo cáo thành phần flavonoid, phenol định hoạt tính chống oxy hóa Chùm ngây(15,18) H|m lƣợng flavonoid cao, t{c động dọn dẹp, trung hòa gốc tự 366 rõ, giúp tế bào gan giảm nhạy cảm với yếu tố g}y độc, giảm kích hoạt q trình apoptosis Theo Sreelatha (2011), Vellosa (2011), dịch chiết l{ Chùm ng}y tăng hoạt động enzym chống oxy hóa superoxid dismutase catalase, giảm lƣợng gốc tự do, ức chế peroxyd hóa lipid giảm ADN phân mảnh(4) Isoquercitrin quercetin l{ Chùm ng}y điều hòa biểu gen tham gia sinh tổng hợp GSH(11) Ngoài ra, isoquercitrin flavonoid có liên kết đơi C2=C3 vòng C, nhóm 4-oxo, nhóm OH vị trí A5, A7 v| B4’quyết định tác dụng ức chế TNF-α, giảm hoại tử gây rƣợu(18) Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 giảm dần theo thứ tự: cao ethyl acetat > isoquercitrin > cao cồn 70% thể rõ nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml mẫu thử Theo Salihah (2012), tỷ lệ phenolic cao ethyl acetat lớn cao cồn 96% (22,2% vs 8,6%) isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa cao, phân lập từ ph}n đoạn ethyl acetat với hàm lƣợng lớn(14) Điều gợi ý isoquercitrin Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 chất định tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan Chùm ngây KẾT LUẬN 10 Cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ Chùm ngây isoquercitrin có tác dụng phòng ngừa ức chế tăng trƣởng, hoại tử hoạt hóa apoptosis ethanol 100 mM gây sau 24 làm tăng lƣợng GSH nội b|o nhƣng chƣa thể rõ tác dụng làm giảm tích lũy lipid Nhƣ vậy, l{ Chùm ng}y, đặc biệt cao ethyl acetat có tác dụng bảo vệ tế bào gan tốt giúp phòng ngừa tổn thƣơng rƣợu, tác dụng rõ nồng độ 84,7 µg/ml ứng với isoquercitrin 10 µg/ml TÀI LIỆU THAM KHẢO Alia M, Mateos R, Ramos S, Lecumberri E, Bravo L, Goya L (2006) Influence of quercetin and rutin on growth and antioxidant defense system of a human hepatoma cell line (HepG2) Eur J Nutr, 45(1): 19-28 Das N, Sikder K, Ghosh S, Fromenty B, Dey S (2012) Moringa oleifera Lam leaf extract prevents early liver injury and restores antioxidant status in mice fed with high-fat diet Indian Journal of Experimental Biology, 50(6): 404-412 Đỗ Thị Hồng Tƣơi, Huỳnh Quang Mỹ Khánh, Huỳnh Thị Kim Loan Xây dựng mơ hình in vitro mơ tình trạng tổn thƣơng tế b|o gan rƣợu dòng tế bào HepG2 Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(1): 332-339 (2014) Henryk D (2010) Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Clinical Hepatology Principles and Practice of Hepatobiliary Disease Volume 2, Henryk Dancygierb, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, German, pp.1153 – 1179 Kim GN, Jang HD (2009) Protective mechanism of quercetin and rutin using glutathione metabolism on HO-induced oxidative stress in HepG2 cells Ann NY Acad Sci, 1171: 530-537 Kim GN, Kwon YI, Jang HD (2011) Protective mechanism of quercetin and rutin on 2,2'-azobis(2amidinopropane)dihydrochloride or Cu2+-induced oxidative stress in HepG2 cells Toxicol In Vitro, 25(1): 138-144 Kim KT et al (2008) Inhibitory effects of naringenin, kaempherol, and apigenin on cholesterol biosynthesis in HepG2 and MCF-7 cells Food Science and Biotechnology, 17(6), 1361-1364 Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010) Hepatoprotective Activity of Leaves and Roots Extracts of Moringa oleifera Lam Int J Med Res.; 1(2): 90-93 Chuyên Đề Dƣợc 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nghiên cứu Y học Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010) Medicinal uses and pharmacological properties of Moringa oleifera International Journal of Phytomedicine, 2: 210 – 216 Magalingam KB, Radhakrishnan A, Haleagrahara N (2014) Protective effects of flavonol isoquercitrin, against 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) - induced toxicity in PC12 cells, BMC Research Notes, 7(49): 125-131 Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Trần Quang Vinh, Lâm Quốc Trung (2011) Thành phần hóa học từ Chùm ngây Moringa oleifera Lam, Tạp chí hóa học: 49(6A): 96-101 Nguyễn Bảo Trân (2010), Khảo s{t t{c động chống oxy hóa chùm ngây Moringa oleifera Lam Moringaceae, Luận văn thạc sĩ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr.3-7 Ruckmani K, Kavimani S, Anandan R, Jaykar B (1998) Effect of Moringa oliefera Lam on Paracetamol – induced hepatotoxicity Indian J Pharm Sci, 60(1): 33-35 Salihah, Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận (2012) Ph}n lập c{c th|nh phần có t{c dụng chống oxi hóa l{ Chùm ng}y (Moringa oleifera Lam.) Tạp chí Y học TP.HCM: 16(1): 163-168 Siddhuraju P, Becker K (2003) Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agro-climatic origin of drumstick tree Moringa oleifera Lam, J Agric Food Chem, 51(8): 2144-2155 Sreelatha S, Padma PR (2011) Modulatory effects of Moringa oleifera extracts against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity and oxidative damage Human and Experimental Toxicology, 30(9): 1359-1368 Ueda H, Yamazaki C, Yamazaki M (2004) A hydroxyl group of flavonoids affects oral anti-inflammatory activity and inhibition of systemic tumor necrosis factor- R production”, Biosci Biotech-nol Biochem, 68(1): 119-125 Vongsak B, Sithisarn P, Mangmoolb S, Thongpraditchote S, Wongkrajaangc Y, Gritsanapana W (2013) Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method Industrial Crops and Products, 44: 566-571 Weng CJ, Chen MJ, Yeh CT, Yen GC (2011) Hepatoprotection of quercetin against oxidative stress by induction of metallothionein expression through activating MAPK and PI3K pathways and enhancing Nrf2 DNA-binding activity N Biotechnol, 28(6): 767-777 Younossi ZM, Gramlich T, Bacon BR, Matteoni CA, Boparai N, O'Neill R, McCullough AJ (1999) Hepatic iron and nonalcoholic fatty liver disease Hepatology, 30(4): 847 - 850 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 367 ... thƣơng tế ban độ tuổi 20-30 tuổi Ƣớc tính khoảng 5% số dân gan rƣợu( 3) Đề tài tiến h|nh Khảo sát tác nƣớc ta bị xơ gan, 65% trƣờng hợp xơ dụng bảo vệ tế bào gan Chùm ngây gan rƣợu (Moringa oleifera. .. (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thƣơng Các nhóm thuốc hóa tổng hợp rƣợu gây dòng tế b|o HepG2 với interferon để kiểm soát bệnh gan cho kết mục tiêu sàng lọc tác dụng bảo vệ tế bào gan không ổn... Các tác nhân gây tổn thƣơng tế bào gan nhƣ rƣợu l|m tăng sinh gốc tự dẫn đến làm giảm lƣợng GSH nội b|o H|m lƣợng GSH tế bào gan cao chứng tỏ khả bảo vệ tế bào mẫu thử phòng ngừa tác hại tác