Mục tiêu của nghiên cứu nhằm tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng, mô hình box-behnken, với sự hỗ trợ của phần JMP (phiên bản 4.0). Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH TỔNG HỢP NIFEDIPIN Nguyễn Thị Nguyệt Anh*, Lê Minh Trí*, Trần Thành Đạo*, Nguyễn Thị Thu Hà * TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nifedipin thuộc nhóm chẹn kênh calci chọn lọc, sử dụng rộng rãi điều trị bệnh tim mạch Hiện nay, nhu cầu nifedipin Việt Nam lớn phải nhập khẩu, việc nghiên cứu quy trình tổng hợp nguyên liệu dùng cho việc sản xuất thuốc cần thiết Mục tiêu nghiên cứu: Tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng, mơ hình Box-Behnken, với hỗ trợ phần JMP (phiên 4.0) Phương pháp nghiên cứu: Nifedipin điều chế dựa phản ứng tổng hợp dihydropyridin Hantzsch Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behken tối ưu hóa phương pháp thống kê, với hỗ trợ phần JMP (phiên 4.0) Hiệu suất phản ứng tính dựa kết định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết nghiên cứu: Xác định ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng, tương tác yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng Xác định điều kiện tối ưu hiệu suất dự kiến phản ứng Thẩm định lại kết cách tiến hành phản ứng tổng hợp nifedipin điều kiện dự kiến, với lượng chất ban đầu tham gia phản ứng lớn 10 lần Tinh chế nifedipin thu từ phản ứng trên, kiểm định nifedipin tổng hợp theo tiêu chuẩn BP 2007 Kết luận: Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nifedipin theo mơ hình Box-Behnken nhờ phần mềm JMP áp dụng điều kiện Việt nam Từ khóa: mơ hình Box-Behnken, phần mềm thống kê JMP, quy trình tổng hợp nifedipin ABSTRACT OPTIMIZATION OF PARAMETERS FOR PROCEDURE OF SYNTHESIS OF NIFEDIPINE Nguyen Thi Nguyet Anh, Le Minh Tri, Tran Thanh Dao, Nguyen Thi Thu Ha * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 481 - 486 Background: Nifedipine, a dihydropyridine calcium channel blocker is commonly used for treatment of cardiovascular diseases such as antianginal and antihypertensive Nifedipine is imported costly with a large scale for formulations Therefore, setting up an optimal process for synthesis of nifedipine is critical need towards local pharmaceutical factories Methods: Nifedipine was synthesized via the Hantzsch reaction, in which the conditions were established following the Box-Behnken design The optimal conditions were treated by statistics software JMP version 4.0 Results: The procedure for making nifedipine with high yield in laboratory conditions was established successfully Conclusion: This optimal and possible procedure of synthesis of nifedipine could be developed to apply in bigger scale Keywords: Box-Behnken design, JMP software, procedure for synthesis of nifedipine * Khoa Dược; Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thị Thu Hà ĐT: 38392387 Email: nthithuha2002@yahoo.com Chuyên Đề Dược Khoa 481 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Nifedipin thuộc nhóm chẹn kênh calci chọn lọc , sử dụng rộng rãi điều trị tăng huyết áp đau thắt ngực mãn tính kiểu ổn định Hiện nay, nhu cầu nifedipin Việt Nam lớn phần lớn nguyên liệu dùng cho việc sản xuất thuốc nhập khẩu, việc nghiên cứu quy trình tổng hợp cần thiết, lý đề tài “Tối ưu hố quy trình tổng hợp nifedipin điều kiện Việt Nam” chọn để khảo sát (6) Nghiên cứu tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm thiết kế bề mặt đáp ứng, mơ hình Box-Behnken, với hỗ trợ phần JMP (phiên 4.0)(2) Ngồi ra, chúng tơi tính hiệu suất phản ứng dựa kết định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High performance chromatography liquid - HPLC) kết thu xác tin cậy so với phương pháp cân PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phản ứng tổng hợp Nifedipin điều chế dựa phản ứng tổng hợp dihydropyridin Hantzsch(3,4) Sơ đồ Phản ứng Hantzsch tổng hợp nifedipin Bố trí thí nghiệm Phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo thiết kế bề mặt đáp ứng, mơ hình Box-Behnken Mơ hình cấu trúc đối xứng thí nghiệm tạo yếu tố, yếu tố khảo sát mã hóa hệ tọa độ khơng thứ ngun có mức: tọa độ phương án 0, yếu tố mã hóa nhận giá trị -1 +1 tương ứng với mức mức Tiến hành tổng hợp Nifedipin tổng hợp điều kiện khác (dựa vào nghiên cứu tiền tối ưu) với thay đổi yếu tố: - Nhiệt độ phản ứng: thay đổi theo mức 55, 60, 65 oC - Tỷ lệ mol methyl acetoacetat: thay đổi theo mức 2,25; 2,45; 2,65 - Tỷ lệ ammoniac đậm đặc: thay đổi theo mức 1,6; 1,8 Bố trí thực nghiệm dựa theo điều kiện nêu thông qua phần mềm JMP, điều 482 kiện tiến hành phản ứng, tổng cộng có 30 phản ứng 15 điều kiện tương ứng Dùng giá trị hiệu suất phản ứng tổng hợp thu theo điều kiện để đánh giá hiệu trình tổng hợp Áp dụng qui trình định lượng nifedipin mơ tả Dược điển BP 2007 phương pháp HPLC để xác định lượng nifedipin tạo thành hỗn hợp phản ứng Để đảm bảo quy trình đạt yêu cầu định lượng: tính chọn lọc, độ lặp lại, độ đúng, khoảng tuyến tính (0,06 mg/ml đến 0,24 mg/ml) cần phải thẩm định lại qui trình Các điều kiện sắc ký sau: - Cột: C18, kích thước cột 25 cm x 4,6 mm, kích thước pha tĩnh µm - Pha động: methanol-acetonitril-nước với tỷ lệ thể tích 25:25:50 - Tốc độ dòng: ml/phút, - Thể tích bơm mẫu: 25 µl Chun Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Phân tích kết Kết thu từ 30 thí nghiệm xử lý phần mềm thống kê JMP (phiên 4.0), từ xác định mối tương quan yếu tố nhiệt độ, tỉ lệ mol, thời gian hiệu suất phản ứng; đồng thời xây dựng phương trình bề mặt đáp ứng dự đoán điều kiện phản ứng cho hiệu suất tối ưu Thẩm định lại quy trình tối ưu hóa Từ thông số lựa chọn cho phản ứng điều chế, tiến hành phản ứng tổng hợp lại nifedipin điều kiện dự kiến, với lượng chất ban đầu tham gia phản ứng lớn 10 lần Tinh chế lượng nifedipin thu từ phản ứng kết tinh ethanol Kiểm định nifedipin theo tiêu chuẩn BP 2007 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hiệu suất phản ứng điều chế nifedipin tóm tắt Bảng Nghiên cứu Y học Bảng Hiệu suất phản ứng điều chế nifedipin điều kiện khác STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Tỷ lệ mol methyl Mã thí acetoacetat/2 -nitro nghiệm benzaldehyd (X1) 0+2,45 -+0 2,25 000 2,45 000 2,45 +02,65 +0+ 2,65 ++0 2,65 -0+ 2,25 000 2,45 000 2,45 0++ 2,45 0-+ 2,45 000 2,45 0-+ 2,45 -02,25 0++ 2,45 0-2,45 -0+ 2,25 +0+ 2,65 -+0 2,25 +-0 26,5 2,25 +02,65 ++0 2,65 +-0 26,5 2,25 0-2,45 0+2,45 000 2,45 -02,25 Hiệu Nhiệt Tỷ lệ mol ammoniac suất (%) độ /2(Y) phản nitrobenzứng aldehyd X2 (X3) 61,4 65 1,6 84,8 65 1,8 93,2 60 1,8 93,2 60 1,8 64,4 60 1,6 55,6 60 2,0 89,0 65 1,8 62,9 60 2,0 86,7 60 1,8 92,6 60 1,8 60,6 65 2,0 54,1 55 2,0 92,8 60 1,8 55,0 55 2,0 60,3 60 1,6 62,4 65 2,0 59,1 55 1,6 62,9 60 2,0 47,5 60 2,0 88,7 65 1,8 52,9 55 1,8 59,8 55 1,8 67,9 60 1,6 81,5 65 1,8 54,8 55 1,8 63,9 55 1,8 60,8 55 1,6 57,9 65 1,6 92,9 60 1,8 53,9 60 1,6 Phương trình đường cong mơ hình bề mặt đáp ứng Từ kết trên, phần mềm JMP xác định phương trình đường cong mơ hình bề mặt đáp ứng sau: Y = 91,9 + 7,867875 X − 5,1X X − 9,73125 X 12 − 10,24375 X 22 − 22,74375 X 32 Trong Y hiệu suất phản ứng tổng hợp (%), X1, X2 X3 biến thay đổi xác định Bảng Đường cong cho thấy mối quan hệ yếu tố với hiệu suất đáng tin cậy với độ tin cậy 95 % hệ số tương quan R2 = 0,89 Ngồi ra, Hình (xử lý với JMP) cho thấy yếu tố nhiệt độ (X2) yếu tố ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất tổng hợp Chuyên Đề Dược Khoa 483 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 X1: tỷ lệ mol methyl acetoacetat/2-nitrobenzaldehyd; X2: nhiệt độ; X3: tỷ lệ mol dung dịch amoniac Hình Mơ tả mối quan hệ yếu tố với hiệu suất tổng hợp nifedipin Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng xuất tạp phân hủy khác nifedipin Trong yếu tố, có nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng ý nghĩa lên hiệu suất phản ứng với độ tin cậy 95 %: nhiệt độ tăng hiệu suất tăng nhiệt độ lớn 65 oC, hiệu suất khơng tăng thêm giảm nhẹ thủy phân liên kết ester phân tử Tăng tỷ lệ mol methyl acetoacetat dung dịch ammoniac làm hiệu suất phản ứng tăng Nhưng hiệu suất tăng khoảng tỷ lệ mol định, tiếp tục tăng tỷ lệ mol yếu tố hiệu suất khơng tăng lên lúc 2-nitro benzaldehyd hết, lượng dư amoniac làm sản phẩm khó kết tủa Hình Mơ hình bề mặt đáp ứng thể yếu tố Tương tác yếu tố khảo sát lên hiệu suất phản ứng Tương tác tỷ lệ mol methyl acetoacetat 2-nitro benzaldehyd Thực nghiệm xác định có yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng sau: Ở tỷ lệ mol methyl acetoacetat so với 2nitro benzaldehyd 2,25 2,65: hiệu suất phản ứng tăng tỷ lệ mol nằm khoảng 1,60 đến 1,85 Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol hiệu suất giảm - Tương tác tỷ lệ mol methyl acetoacetat 2-nitro benzaldehyd - Tương tác nhiệt độ tỷ lệ mol methyl acetoacetat - Tương tác nhiệt độ tỷ lệ mol amoniac 484 Tương tác nhiệt độ tỷ lệ mol methyl acetoacetat Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Ở nhiệt độ 55 oC 65 oC: hiệu suất phản ứng tăng tỷ lệ mol methyl acetoacetat so với 2-nitro benzaldehyd từ 2,25 đến 2,50 Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol hiệu suất giảm nhiệt độ 55 oC biến đổi Nghiên cứu Y học Ở nhiệt độ 55 oC 65 oC: hiệu suất phản ứng tăng tỷ lệ mol amoniac nằm khoảng 1,60 đến 1,85 nhiệt độ 55 oC hiệu suất thấp 65 oC Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ mol hiệu suất giảm (xem Hình 3) Tương tác nhiệt độ tỷ lệ mol amoniac Hình Tương tác yếu tố lên phản ứng Xác định điều kiện tối ưu hiệu suất dự kiến Dựa vào đồ thị biểu diễn Hình xác định thơng số thích hợp để điều chế nifedipin với hiệu suất cao Hình Điều kiện tối ưu hiệu suất dự kiến phần mềm JMP Điều kiện tối ưu phản ứng: - Tỷ lệ mol methyl acetoacetat 2,44 - Nhiệt độ 61,9 oC (62 oC) - Tỷ lệ mol amoniac 1,79 (1,8) - Hiệu suất dự kiến 93,39 % Chuyên Đề Dược Khoa 485 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Thẩm định lại thông số phản ứng Tiến hành phản ứng tổng hợp nifedipin điều kiện dự kiến, với lượng chất ban đầu tham gia phản ứng lớn 10 lần, kết thu tóm tắt Bảng Bảng Hiệu suất phản ứng tổng hợp thực nghiệm Hiệu suất Hiệu suất phản ứng (%) Hiệu suất trung bình (%) Lần 93,1 Lần 92,0 Lần 92,4 Tinh chế nifedipin thu từ phản ứng kết tinh lại ethanol, hiệu suất tinh chế 89,2 % Kiểm định nifedipin tổng hợp theo tiêu chuẩn BP 2007(1) Kết cho thấy sản phẩm thu đạt tiêu qui định BP 2007, ngoại trừ tạp chất liên quan khơng có mẫu tạp chuẩn đối chiếu (xem Bảng 4) 92,5 ± 0,556 % (dự đoán 93,4%) Bảng Kết kiểm nghiệm số tiêu nifedipin theo BP 2007 STT CHỈ TIÊU Tính chất YÊU CẦU Màu vàng, tinh thể nhỏ, thực tế không tan nước, tan hồn tồn aceton, tan ethanol Nhiệt độ nóng chảy khoảng 171-175 oC KẾT QUẢ Đúng Định tính Phổ hồng ngoại Sắc ký lớp mỏng Định lượng Phổ hồng ngoại chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại nifedipin chuẩn Vết chế phẩm nifedipin chuẩn phải giống hình dạng vết trị số Rf Chế phẩm phải chứa từ 98,0 đến 102,0 % nifedipin tính theo chế phẩm khơ Đúng Đúng Đạt (101 %) Nifedipin tổng hợp đạt tiêu chuẩn định tính hàm lượng theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2007 Phương pháp điều chế với nguyên liệu, điều kiện tiến hành đơn giản áp dụng nước để sản xuất nifedipin KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nifedipin tổng hợp với quy trình tối ưu hóa theo mơ hình Box-Behnken nhờ phần mềm JMP, điều kiện tối ưu sau: - Nhiệt độ phản ứng 61,9 oC - Tỷ lệ mol methyl acetoacetat 2,44 - Tỷ lệ mol amoniac 1,79 Sản phẩm đạt tiêu định tính định lượng Dược điển Anh 2007 486 Bristish Pharmacopoiea (2007), CD-ROM JMP DOE Guide (2005), Release 6, SAS institute Inc, p 103115 Mathias Berwe et al.; Process for preparing nifedipine US Patent 6294673 B1 Pal Benko et al.,(1993); 1,4-dihydro-pyridine intermediates, US Patent 5216157 The United States Pharmacopeia 29 (2006), p.1528-1531 Trần Thị Thu Hằng (2005), Dược lực học, NXB Phương Đông TP HCM, p 525-544 Chuyên Đề Dược Khoa ... nghiên cứu quy trình tổng hợp cần thiết, lý đề tài Tối ưu hố quy trình tổng hợp nifedipin điều kiện Việt Nam” chọn để khảo sát (6) Nghiên cứu tiến hành tối ưu hoá theo phương pháp quy hoạch thực... phương trình bề mặt đáp ứng dự đoán điều kiện phản ứng cho hiệu suất tối ưu Thẩm định lại quy trình tối ưu hóa Từ thơng số lựa chọn cho phản ứng điều chế, tiến hành phản ứng tổng hợp lại nifedipin. .. sản xuất nifedipin KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nifedipin tổng hợp với quy trình tối ưu hóa theo mơ hình Box-Behnken nhờ phần mềm JMP, điều kiện tối ưu sau: - Nhiệt độ phản ứng 61,9 oC - Tỷ lệ mol