Tối ưu hóa quy trình tổng hợp carboxymethyl beta cyclodextrin

Đề tài Tối ưu hóa quy trình tổng hợp carboxymethyl beta cyclodextrin đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ưu về hiệu suất ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nước dẫn chất carboxymethyl từ β-cyclodextrin.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL BETA-CYCLODEXTRIN Nguyễn Thị Minh Phương*, Nguyễn Thị Kiều Hảo*, Nguyễn Đức Tuấn*, Trần Quốc Thanh* TÓM TẮT Mở đầu-Mục tiêu: Beta-cyclodextrin (-CD) dẫn chất sử dụng phổ biến c{c phương ph{p sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), điện di mao quản (CE), l|m t{c nh}n đối quang phân tách c{c dược chất l| đồng phân quang học So với số lượng lớn c{c dược chất quang hoạt đa dạng cấu trúc tính chất có mặt thị trường số lượng tác nhân quang hoạt thương mại hóa ít, giá thành cao Tiếp nối cơng trình trước đ}y tổng hợp dẫn chất methyl, methoxycarbonyl dẫn chất n|y đƣợc ứng dụng l|m t{c nh}n đối quang tách thành công số dƣợc chất quang hoạt CE Với mong muốn tiếp tục phát triển góp phần l|m đa dạng hóa tác nh}n đối quang để phân tách c{c đồng phân quang học CE, đề t|i: “TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL BETA CYCLODEXTRIN” thực với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ưu hiệu suất quy mơ phòng thí nghiệm phù hợp với điều kiện nước dẫn chất carboxymethyl từ β-cyclodextrin Đối tượng nghiên cứu: carboxymethyl- β-CD Phương pháp nghiên cứu: Thực phản ứng β-CD với tác nhân acid 2-cloroacetic để thu dẫn chất carboxymethyl- β-CD Phân lập tinh chế sản phẩm phương ph{p thay đổi dung môi v| phương pháp kết tinh lại Dẫn chất tổng hợp x{c định độ tinh khiết qua việc x{c định điểm chảy v| góc quay cực riêng Cấu trúc x{c định qua liệu thu từ phổ IR, NMR, MS C{c điều kiện phản ứng khảo s{t để quy hoạch tối ưu hóa phần mềm Modde 5.0 với mơ hình Box-Behnken Kết quả: Đã tổng hợp carboxymethyl- β-CD với hiệu suất 78,01%, DS = Kết luận: Thành công đề tài tạo tiền đề cho hướng tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản phẩm làm tác nhân đối quang, ph}n t{ch đồng phân quang học nguyên liệu thành phẩm dược chất quang hoạt phương ph{p điện di mao quản Từ khóa: carboxymethyl- β-cyclodextrin, tổng hợp, dẫn chất β-cyclodextrin ABSTRACT OPTIMIZATION OF THE SYNTHESIS OF CARBOXYMETHYL-Β-CYCLODEXTRIN Nguyen Thi Minh Phuong, Nguyen Thi Kieu Hao, Nguyen Duc Tuan, Tran Quoc Thanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:216 - 220 Background-Objectives: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives are commonly used as the chiral selectors for analysis of enantiomer drugs by HPLC and capillary electrophoresis (CE) Recently, the requirement for quality control of chiral drugs is increasingly while the number of commercial chiral selectors is limited and sold with high price Some beta-cyclodextrin derivatives as methyl--CD and methoxycarbonyl--CD were successfully synthesized by our group Which were successfully applied for separation of some enantiomer drugs by CE, too With the desire to develop the selective chiral selectors, this study was carried out to optimize the synthesis of carboxymethy-β-cyclodextrin from β-cyclodextrin *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thị Minh Phƣơng ĐT: 0909810668 216 Email: minhphuongvn80@yahoo.com Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Subjects and Methods: The subjects of this study was carboxymethyl derivatives of -cyclodextrin, which was synthesized from β-CD with 2-cloroacetic acid agents Purity of the synthesized product was checked by melting point and specific rotation measurements, and its structures was elucidated by IR, MS, and NMR spectra Influences of reaction temperature, reaction duration and reactant ratio on the substitution degree and the yield of MC-β-CD were discussed The synthetic process was optimized by Modde 5.0 software using BoxBehnken model to achieve the highest yield Results: Carboxymethyl-β-CD was synthesized with the yield of 78.01%, and DS (degree of substitution) values was Conclusion: The successful synthesis of carboxymethyl-β-CD derivative was provides a theoretical and experimental basis for further scale-up research In the future, we are going to developing the application of this selector for separation of enantiomer drugs by capillary electrophoresis Keywords: carboxymethyl-β-betacyclodextrin, synthesis, β-betacyclodextrin derivative phát triển góp phần l|m đ dạng hóa tác MỞ ĐẦU nh}n đối qu ng để ph}n t{ch c{c đồng phân Beta-cyclodextrin (-CD) dẫn chất quang học CE, đề t|i: “TỐI ƢU HÓA QUY chúng đƣợc sử dụng phổ biến c{c phƣơng TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu cao BETA CYCLODEXTRIN” đƣợc thực HPLC , điện di mao quản (CE), làm tác nhân với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ƣu đối qu ng t{ch đồng phân quang học(2,5-8,10), đặc hiệu suất quy mơ phòng thí nghiệm phù biệt đƣợc ứng dụng kiểm nghiệm hợp với điều kiện nƣớc dẫn chất thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt Để carboxymethyl từ β-cyclodextrin ph}n t{ch c{c dƣợc chất quang hoạt cần tác nhân NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP đối quang phù hợp với tính chất củ dƣợc chất, NGHIÊN CỨU đ i để ph}n t{ch đƣợc dạng đồng phân chất cần phải phối hợp nhiều tác Nguyên liệu nhân quang hoạt với Các thuốc có hoạt Beta cyclodextrin acid 2-cloroacetic chất dạng đồng phân riêng lẻ xuất ngày (Himedia) nhiều thị trƣờng dƣợc phẩm Trang thiết bị ngo|i nƣớc có hoạt tính mạnh tác dụng M{y đo phổ IR Shimazdu (Nhật , m{y đo phụ dạng racemic củ chúng nhƣ: Sphổ NMR ruker 500 MHz Đức), máy LC-MS amlodipin, levofloxacin, levocetirizin, Sruker 500 MHz Đức , m{y đo góc qu y cực omeprazol, So với số lƣợng lớn c{c dƣợc HORIBA-SEO+PA 300 (Nhật) chất quang hoạt đ dạng cấu trúc tính chất đ ng có mặt thị trƣờng số lƣợng tác nhân quang hoạt đƣợc thƣơng mại hóa ít, giá thành cao Chính vậy, xu hƣớng nhà nghiên cứu c{c nƣớc tổng hợp nhiều t{c nh}n t{ch đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao có giá trị kinh tế(1,4,9) Tiếp nối c{c c ng trình trƣớc đ}y tổng hợp đƣợc dẫn chất methyl, methoxycarbonyl dẫn chất n|y đƣợc ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công số dƣợc chất quang hoạt CE Với mong muốn tiếp tục Chuyên Đề Dƣợc Phản ứng tổng hợp carboxymethyl--CD(1,3) OCH2COO  OH O O O + Cl HO OH O NaOH, t OH O OOCH2CO O  O -Cyclodextrin o OCH2COO  Carboxymethyl--Cyclodextrin Sử dụng phƣơng ph{p th y đổi dung môi phƣơng ph{p kết tinh lại để phân lập tinh chế sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng 217 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Các dẫn chất tổng hợp đƣợc x{c định độ tinh khiết qua việc x{c định điểm chảy, góc quay cực riêng sắc ký lớp mỏng (TLC) Cấu trúc đƣợc x{c định qua liệu thu đƣợc từ phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) khối phổ (MS) Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố đến hiệu suất phản ứng nhƣ: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol MCA β-CD, khảo sát khoảng giới hạn ảnh hƣởng tiến hành tối ƣu hó phần mềm Modde 5.0 với mơ hình Box-Behnken chảy sản phẩm đo đƣợc 256-266 oC, suất quay cực: [ ]D  110 20 Sản phẩm thu đƣợc qua phản ứng đem đo IR, NMR v| MS để xác định cấu trúc Dữ liệu phổ IR sản phẩm -1 Số sóng (cm ) 3317 2925 1593 1014 Dữ liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500MHz) sản phẩm Độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) 5,15-5,39 3,53-4,39 KẾT QUẢ Tổng hợp carboxymethyl--CD Cho vào bình cầu g β-CD (0,88 mmol), thêm g n tri hydroxyd đƣợc hòa tan ml nƣớc, đun hồi lƣu 80 oC 30 phút Thêm g acid monocloroacetic (MCA) (31,75 mmol) (đã hò t n ml nƣớc vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục đun 120 oC, tiến h|nh chấm sắc ký lớp mỏng theo dõi tạo th|nh củ sản phẩm theo thời gian Điều chỉnh pH hỗn hợp sau phản ứng đến pH = Thêm 150 ml methanol vào dung dịch sau phản ứng, lọc thu lấy tủa Tủ đƣợc hòa lại ml nƣớc cất, tủa lại 80 ml methanol Rửa sản phẩm methanol lần, lần ml Sản phẩm đƣợc sấy chân không 60 oC Từ lƣợng sản phẩm thu đƣợc tính hiệu suất 46,2% Tính chất sản phẩm Chất bột trắng, dễ hút ẩm, tan nƣớc, không tan methanol, ethanol, aceton, ether Thực sắc ký lớp mỏng vết nguyên liệu sản phẩm với hệ dung môi làm ph động IPA-EtOAc-nƣớc (5 : : 1) butanol- ethanol - nƣớc (3 : : 3,5), kết cho thấy sản phẩm sau tinh chế cho vết sắc ký, khơng có vết trùng với vết nguyên liệu, chứng tỏ phản ứng tạo thành chất mới, nhiên vết sản phẩm kéo vệt dài nên cho sản phẩm tạo thành gồm dẫn chất có độ khác Nhiệt độ nóng 218 Cường độ, hình dạng Nhóm chức Mạnh, tù O-H (alcol) Trung bình, nhọn C-H (alkan) Mạnh, nhọn C=O (acid) Mạnh, nhọn C-O-C (ether) Số proton Số đỉnh Vị trí proton 7H 58H m m H1 H2-H6, Hb Dữ liệu phổ MS sản phẩm ST T m/z z Mảnh 764,1940 735,1880 706,1862 677,1830 [MNa2] + [MNa2] + [MNa2] + [MNa2] + Khối lượng phân tử 1482.388 1424.376 1366.372 1308.366 Công thức phân tử tương ứng (C6H10O5)7(CH2COOH)6 (C6H10O5)7(CH2COOH)5 (C6H10O5)7(CH2COOH)4 (C6H10O5)7(CH2COOH)3 Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp để đạt hiệu suất cao Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng Hiệu suất phản ứng tăng dần từ đến giờ, dich phản ứng lúc chuyển từ màu nâu sang vàng Khi tiếp tục phản ứng từ đến hiệu suất phản ứng hầu nhƣ kh ng th y đổi Hình 1: Ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất phản ứng Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng Tiến hành khảo sát nhiệt độ 50 - 90 C, tăng nhiệt độ từ 50 C đến 60 C, hiệu suất tăng, nhiệt độ tăng từ 60 C đến 90 C, hiệu suất phản ứng giảm mạnh Nghiên cứu Y học hợp thời gian giờ, nhiệt độ 59 C tỷ lệ (mol/mol) MCA β-CD 26,7 với hiệu suất dự đo{n l| 79,50 % Tiến hành thực nghiệm phản ứng tổng hợp carboxymethyl-βCD điều kiện ba lần thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất trung bình 78,01 % BÀN LUẬN Hình 2: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hiệu suất phản ứng Ảnh hưởng tỷ lệ MCA β-CD đến hiệu suất phản ứng Khi tỷ lệ (mol/mol) MCA β-CD tăng từ 15 đến 25, hiệu suất tăng, tỷ lệ tăng từ 25 đến 35, hiệu suất phản ứng giảm β-CD dạng polymer có nhiều trung tâm bất đối phân tử, nên khó khống chế điều kiện phản ứng để tạo thành sản phẩm sau phản ứng Sản phẩm thu đƣợc thƣờng liên hợp dẫn chất có độ khác Thực tế, phần lớn sản phẩm dẫn chất β-CD thƣơng mại không công bố độ tinh khiết mà cơng bố độ trung bình, phân tử lƣợng trung bình Theo liệu phổ 1H-NMR sản phẩm thu đƣợc, proton nhóm c rboxymethyl đƣợc ký hiệu Hb Proton nhóm R-O-CH3 có độ dịch chuyển 3.2– 3.8 ppm, nên Hb nhóm carboxymethyl gắn với oxy RO−CH2−COOH có độ dịch chuyển phí trƣờng thấp khoảng ppm, nên chồng lên tín hiệu H2-H6 phổ Tính DS sản phẩm theo liệu Phổ H-NMR: số proton Hb phân tử carboxymethyl-β-CD 58 – 42 = 16 Vì nhóm −CH2COOH có proton, nên số nhóm −CH2COOH có phân tử carboxymethyl-β-CD (hay DS) 16/2 = Hình 3: Ảnh hưởng tỷ lệ (mol/mol) MCA β-CD lên hiệu suất phản ứng Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Dùng phần mềm Modde 5.0 với mơ hình Box-Behnken bố trí thí nghiệm với thông số: thời gian phản ứng (4-8 giờ), nhiệt độ phản ứng (50-70 C) tỷ lệ (mol/mol) MCA β-CD (20-30), ma trận quy hoạch thực nghiệm gồm 15 thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm xử lý kết phần mềm Modde 5.0 tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng tổng Chuyên Đề Dƣợc Theo liệu phổ MS sản phẩm thu đƣợc, cơng thức carboxymethyl-β-CD viết thành: (C6H10O5)7(CH2COOH)n Trong đó, n l| số nhóm carboxymethyl phân tử carboxymethyl-β-CD Dễ dàng suy khối lƣợng phân tử carboxymethyl-β-CD với nhóm khác nhau: Mn = Mβ-CD + n*MCH2COOH = 1134 + n*58 (Mn phân tử lƣợng sản phẩm có n nhóm thế) Nhƣ từ liệu thu đƣợc từ IR, MNR v| MS có đủ sở để kết luận sản phẩm thu đƣợc dẫn chất carboxymethyl-β-CD 219 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 KẾT LUẬN Đề t|i x}y dựng đƣợc quy trình tối ƣu để tổng hợp carboxymethyl-β-CD với điều kiện phản ứng: thời gian giờ, nhiệt độ 59 C tỷ lệ (mol/mol) MCA β-CD l| 26,7; thu đƣợc sản phẩm có DS = hiệu suất 78,01% TÀI LIỆU THAM KHẢO Brandt L (1987) Ethers of beta-cyclodextrin and a process for their preparation US Patent, US 463805 Gyula O, Tibor C, Mária S (2014) Cyclodetrins in chromatography Eur Chem Bull., (1): 2-12 Jacques R, Trinadha R, Joseph P (1994) Distribution of substituents in carboxymethyl ethers of cyclomaltoheptanose Carbohydrat Research, 258: 281-285 Jindrich JP, Bengt L, Pia S, Kazuaki H (1995) Regioselectivity of alkylation of cyclomaltoheptaose (β-cyclodextrin) and synthesis of its mono-2-O- methyl,-ethyl,-allyl, and-propyl derivatives Carbohydrate Research, 266: 75-80 József S (2004) Past, present, and future of cyclodextrin research Pure and Applied Chemistry, 76: 1829-1830 220 10 Julianna S, Katalin G (1994) Use of cyclodextrins and cyclodextrin derivatives in high- performance liquid chromatography and capillary electrophoresis Journal of Chromatography A, 668: 509-517 Manoj MN, Dinesh MS, Parag VJ (2012) The Cyclodextrins: A Review Journal of Current Pharmaceutical Research: 1-6 Salvatore F (1996) Identification of chiral drug isomers by capillary Electrophoresis Journal of chromatography A., 735: 77121 Takeo K (1976) Synthesis of Heptakis (2-O-methyl-βcyclodextrin Die Starke, 28 (7): 226-227 Verleysen K, Sabah S, Scriba G, Sandra P (1999) Enantioseparation of Aspartyl Dipeptides by CE: Comparison between 18-Crown-6-Tetracarboxylic Acid and Carboxymethyl13-Cyclodextrin as Chiral Selector Chromatographia, 49: 215-218 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... dẫn chất quang học CE, đề t|i: “TỐI ƢU HÓA QUY chúng đƣợc sử dụng phổ biến c{c phƣơng TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu cao BETA CYCLODEXTRIN đƣợc thực HPLC ,... electrophoresis Keywords: carboxymethyl- β-betacyclodextrin, synthesis, β-betacyclodextrin derivative phát triển góp phần l|m đ dạng hóa tác MỞ ĐẦU nh}n đối qu ng để ph}n t{ch c{c đồng phân Beta- cyclodextrin. .. nhân với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ƣu đối qu ng t{ch đồng phân quang học(2,5-8,10), đặc hiệu suất quy mô phòng thí nghiệm phù biệt đƣợc ứng dụng kiểm nghiệm hợp với điều kiện nƣớc