Tối ưu hóa phản ứng tổng hợp sulfasalazin

Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích tạo ra nguồn nguyên liệu sulfasalazin đáp ứng cho ngành dược phẩm Việt Nam trong việc điều trị bệnh viêm ruột.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG TỔNG HỢP SULFASALAZIN La Ngọc Vân*, Trương Văn Đạt*, Trần Thành Đạo* TÓMTẮT Mở đầu – mục tiêu: Bệnh viêm ruột, bệnh đường tiêu hóa, có xu hướng tăng Sulfasalazin (Salicylazosulfapyridin), ban đầu sử dụng thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp Sau sử dụng điều trị viêm ruột cách hiệu Nghiên cứu thực với mục đích tạo nguồn nguyên liệu sulfasalazin đáp ứng cho ngành dược phẩm Việt Nam việc điều trị bệnh viêm ruột Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Với trang thiết bị đơn giản nguyên liệu dễ kiếm gồm sulfapyridin, acid salicylic, natri nitrit… qua hai giai đoạn để tạo thành sulfasalazin Giai đoạn 1: tổng hợp muối sulfapyridin diazonium clorid từ sulfapyridin natri nitrit môi trường acid HCl Giai đoạn 2: tổng hợp sulfasalazin phản ứng ghép đôi muối sulfapyridin diazonium clorid acid salicylic môi trường base NaOH Nhiệt độ phản ứng trì từ oC đến oC Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tổng hợp Tối ưu hóa quy trình tổng hợp dựa vào phần mềm Modde 5.0 Tinh chế, kiểm tra cấu trúc độ tinh khiết sản phẩm Kết quả: Sulfasalazin tổng hợp qua bước Cấu trúc sản phẩm độ tinh khiết xác định phương pháp phổ nghiệm điểm chảy, IR, MS, UV-Vis, SKLM Kết tối ưu hố cho thấy có yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Phản ứng sau tối ưu hố có hiệu suất cao (82,75%), sản phẩm có độ tinh khiết cao (98,71%) Từ khóa: sulfasalazin, sylfapyridin, tối ưu hóa ABSTRACT OPTIMIZATION OF PARAMETERS FOR SYNTHESIS OF SULFASALAZINE La Ngoc Van, Truong Van Dat, Tran Thanh Dao * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 560 – 566 Background – Objectives: Inflammatory bowel disease, one of the digestive diseases, has increasing tendency Sulfasalazine (Salicylazosulfapyridine) was originally proposed as a treatment for rheumatoid arthritis It was subsequently discovered that sulfasalazine was also efficacious in treating inflammatory bowel disease The aim of this study is to synthesis sulfasalazine with simple and effect condition to supply materials for Vietnam's pharmaceutical industry Materials and Methods: With simple method and materials such as sulfapyridine, salicylic acid, sodium nitrite, ect and following two steps to synthesis of sulfasalazine First, synthesis sulfapyridine diazonium from sulfapyridine and sodium nitrite in HCl Second, synthesis of sulfasalazine by pairing reaction of sulfapyridine diazonium and salicylic acid in NaOH The temperature of both reactions is maintained from oC to oC Optimize parameters based on Modde 5.0 software to indentify the best conditions for reaction Results: Salfasalazine was synthesized from step reaction Structure of sulfasalazine was identified by these methods: melting point, IR, MS, UV-Vis, TLC There were factors affecting the reaction yield The * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 560 Email: daott@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học experimental result is high yield (82.75%) and high impurity (98.71%) Keywords: sulfasalazine, sulfapyridine, optimization giảm triệu chứng bệnh viêm kết ĐẶTVẤNĐỀ tràng bệnh Crohn Hai loại thuốc Bệnh viêm ruột phổ biến nước thường kê đơn thuốc kháng viêm phương Tây, đặc biệt tỷ lệ mắc bệnh tăng chất ức chế miễn dịch Trong phác mạnh vào khoảng đầu năm 1950 đồ điều trị bệnh thuốc kháng Ngun nhân xu hướng viêm thường bước điều trị nhiễm nguồn nước, an toàn vệ sinh gồm sulfamid sulfasalazin, thực phẩm thói quen sinh hoạt thiếu mesalazin, olsalazin balsalazin (1,3,9) Qua khoa học Ngoài ra, bệnh phổ biến tìm hiểu, chúng tơi nhận thấy ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng thuốc đầu tay điều trị viêm sống nhiều người thờ ơ, chưa ruột sulfasalazin hồn tồn sản điều trị kịp thời dứt điểm nên dễ gây xuất Việt Nam với nguyên liệu rẻ tiền biến chứng đáng tiếc Điều trị dễ kiếm thuốc phương pháp để làm ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nguyên liệu, hoá chất Bảng 1: Danh mục hóa chất sử dụng STT 10 11 12 13 Tên hóa chất Sulfapyridin Acid salicylic Natri nitrit HCl NaOH Methanol Cloroform Acid acetic băng Ethyl methyl ceton Aceton Natri acetat Methanol Acetonitril Hàm lượng (%) ≥ 99,0 ≥ 99,5 ≥ 99,0 36-38 ≥ 99,0 ≥ 99,5 ≥ 99,5 ≥ 99,5 ≥ 99,5 ≥ 99,5 ≥ 99,5 ≥ 99,9 ≥ 99,9 Thiết bị nghiên cứu Tiêu chuẩn Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Kiểm Nghiệm (HPLC) Kiểm Nghiệm (HPLC) Bercher, pipet, nhiệt kế, bình cầu Máy khuấy từ Stuart, cá từ dụng cụ khác Máy hút chân không, phễu Buchner Phương pháp nghiên cứu Cân phân tích Kern ABS-220-4 Xuất xứ Mỹ (Merck) Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Mỹ Mỹ - Dựa vào patent để chọn phương pháp Máy soi UV VL-215-LC tổng hợp sulfasalazin phù hợp với điều kiện Tủ sấy dụng cụ Heraeus Việt Nam Tủ lạnh Towashi Máy đo điểm chảy Stuart Sulfasalazin tổng hợp từ giai đoạn theo phương pháp(6,7): Máy làm đá EverMed Chuyên Đề Dược 561 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Sơ đồ 1: Các giai đoạn tổng hợp sulfasalazin + Giai đoạn 1: Tổng hợp muối sulfapyridin diazonium clorid từ sulfapyridin natri nitrit môi trường acid HCl, nhiệt độ phản ứng trì từ oC đến oC + Giai đoạn 2: Tổng hợp sulfasalazin phản ứng ghép đôi muối sulfapyridin diazonium clorid acid salicylic môi trường base NaOH, nhiệt độ phản ứng ln trì từ oC đến oC - Thực khảo sát sơ bộ: Tiến hành khảo + Cột phân tích: HiQ sil C18, size 4,6 mm x 250 mm (5µm) Ser.00B00494 + Pha động: Methanol – Acetonitril – Nước cất (30:30:40) + Nhiệt độ cột: 24 oC + Tốc độ dòng: ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl + Bước sóng phát hiện: 365 nm + Nồng độ pha mẫu 100 ppm sát yếu tố ảnh hưởng Ở lần khảo sát, KẾTQUẢ thay đổi thơng số cần tìm giữ Tổng hợp, tinh chế tính hiệu suất phản ứng nguyên giá trị khác - Tối ưu hoá phần mềm Modde 5.0: sau xác định, yếu tố ảnh hưởng đưa vào phần mềm Modde, bố trí yếu tố theo mơ hình Box-Behnken để phần mềm cho phản ứng cần thực hiện(8) - Xây dựng quy trình tổng hợp sulfasalazin hồn chỉnh: tổng hợp sulfasalazin theo quy trình lựa chọn; tinh chế sản phẩm thu được; kiểm tra sắc lý lớp mỏng; đo độ ẩm, định lượng, tính hiệu suất phản ứng; định tính; kiểm tra độ tinh khiết HPLC(2) - Xác định độ tinh khiết sản phẩm phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký(2): + Hệ thống HPLC: Alliance (Water 2695– Detector PDA 2996) 562 - Tiến hành phản ứng diazo hoá phản ứng ghép đơi theo sơ đồ 1, thực bình cầu: + Bình cầu 1: 0,3 g (0,0012 mol) sulfapyridin hòa tan 4ml HCl 3M + Bình cầu 2: 0,08 g (0,0012 mol) NaNO2 hòa tan 3ml nước + Ngâm bình cầu nước đá đến nhiệt độ đạt khoảng oC - oC + Thực phản ứng diazo hoá - Phản ứng ghép đơi: + Chuẩn bị bình cầu 3: cân 0,18 g (0,0013 mol) acid salicylic hòa tan 5ml NaOH 20% Ngâm bình cầu nước đá đến nhiệt độ đạt khoảng oC - oC Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học + Cho từ từ hỗn hợp muối sulfapyridin diazonium clorid vào bình cầu 3, kiểm tra nhiệt độ phải nằm khoảng oC - oC Sau cho hết, để phản ứng tiếp tục giờ, nhiệt độ ln trì khoảng oC - oC Khảo sát thời gian phản ứng - Giữ nguyên yếu tố tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin, tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin, thay đổi thời gian phản ứng 1,5 giờ; giờ; 2,5 giờ; giờ; 3,5 giờ; Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng + Sau giờ, để phản ứng trở nhiệt độ phòng Cho từ từ dung dịch HCl 3M vào dịch phản ứng, tủa bắt đầu xuất hiện, tiếp tục cho dung dịch HCl vào đến hỗn hợp đạt pH=5 Lọc lấy tủa, rửa tủa kỹ nước, sau rửa ether, sấy khơ - Hiệu suất tăng dần theo thời gian, nhận thấy thời điểm (180 phút) cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị hiệu suất bắt đầu giảm xuống Chọn giá trị ứng với thời gian phản ứng tối ưu để đưa vào mơ hình thiết kế phản ứng - Tinh chế sản phẩm becher chứa H2O dung dịch CH3COOH (tỷ lệ 1:2) Lọc lấy sản phẩm, sấy khô Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết sắc kí lớp mỏng Hiệu suất sau tinh chế 56,01% Khảo sát tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin - Để thực khảo sát tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin, yếu tố thời gian, tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin cố định, tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin thay đổi 1:1; 1,75:1; 2:1; 2,25:1; 2,5:1; 2,75:1 - Thực kiểm tra SKLM với hệ dung môi: + Hệ 1: Cloroform – ethyl methyl ceton – acid acetic (70:15:10) + Hệ 2: Cloroform – aceton – acd acetic (90:5:5) + Hệ 3: Cloroform – methanol - acid acetic (85:10:5) Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Môi trường acid cho phản ứng diazo hóa mơi trường base cho phản ứng ghép cặp Acid HCl base NaOH nguyên liệu có sẵn dễ kiếm nên chúng tơi thực theo tài liệu chọn Ngồi ra, trình điều chế phải thực nhiệt độ thấp từ oC đến oC HNO2 dễ bị phân hủy nhiệt độ cao muối diazonium hợp chất không bền dễ bị phân hủy chuyển phần thành dẫn xuất phenol nhiệt độ thường làm giảm hiệu suất phản ứng Vậy nên giữ phản ứng nhiệt độ cố định từ oC đến oC Do đó, chúng tơi thực tối ưu hố yếu tố lại sau: Chuyên Đề Dược - Cố định thông số thời gian (180 phút) lượng acid salicylic sử dụng 0,18g (0,0013 mol) Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng Tại tỉ lệ 2,25:1 cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị hiệu suất bắt đầu giảm xuống Chọn giá trị tỉ lệ 2,25 cho hiệu suất phản ứng tối ưu để đưa vào mơ hình thiết kế phản ứng Khảo sát tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin - Để thực khảo sát tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin, yếu tố thời gian, tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin cố định, tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin thay đổi 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1;3,5:1 - Cố định thông số thời gian (180 phút) lượng natri nitrit sử dụng 0,14g (0,002 mol) Tiến hành phản ứng, tinh chế, định lượng Tại tỉ lệ 2,5:1 cho hiệu suất cao nhất, qua ngưỡng giá trị hiệu suất bắt đầu giảm xuống Chọn giá trị tỉ lệ 2,5 cho hiệu suất phản ứng tối ưu để đưa vào mơ hình thiết kế phản ứng 563 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Kết bố trí thí nghiệm bậc theo mơ hình Box-Behnken Tiến hành - Chọn yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, ta có yếu tố sau: + Yếu tố 1: Tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin + Yếu tố 2: Tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin Bảng Mã hóa yếu tố khảo sát Yếu tố X1X2X3- Mức -1 2 150 Các mức Mức sở 2,25 2,5 180 Mức +1 2,5 210 Kết - Bố trí ma trận giá trị thực nghiệm thu được: + Yếu tố 3: Thời gian phản ứng (phút) Bảng Kết hiệu suất 15 phản ứng STT Mã thí nghiệm 10 11 12 13 14 15 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N14 N15 Tỷ lệ mol NaNO2 sulfapyridin 2,00 2,50 2,00 2,50 2,00 2,50 2,00 2,50 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25 Tỷ lệ mol acid salicylic sulfapyridin 2,0 2,0 3,0 3,0 2,5 2,5 2,5 2,5 2,0 3,0 2,0 3,0 2,5 2,5 2,5 Thời gian phản ứng 180 180 180 180 150 150 210 210 150 150 210 210 180 180 180 Hiệu suất (%) 53,54 64,25 61,19 75,82 67,71 82,14 66,74 76,82 58,58 70,34 56,85 67,82 77,25 76,62 76,77 - Tiến hành phân tích ANOVA, giá trị R2 = 0,998 đạt yêu cầu (yêu cầu > 0,9) với mức tin cậy 95% thể mối tương quan chặt chẽ hiệu suất yếu tố khảo sát Y (%) = 76,88 + 6,23125X1 + 5,24376X2 – 1,3175X3 – 1,6125X12 – 11,5675X22 – 1,91499X32 + 0,979988X1X2 – 1,0875X1X3 - Bên cạnh đó, giá trị Q = 0,967 đạt yêu cầu (yêu cầu > 0,5) cho thấy biến số phương trình hồi quy có tương quan chặt chẽ Dựa theo hệ số Q2 ta dự đốn hiệu suất phản ứng thay đổi yếu tố khảo sát vùng khảo sát X1: Tỷ lệ mol natri nitrit – sulfapyridin - Trong đó: X2: Tỷ lệ mol acid salicylic – sulfapyridin X3: Thời gian phản ứng - Giá trị p phân tích ANOVA 0,000 đạt yêu cầu (u cầu < 0,05) chứng tỏ mơ hình phù hợp với thực nghiệm - Phương trình bề mặt đáp ứng hiệu suất thiết lập sau: 564 Hình 2: Tác động yếu tố lên hiệu suất phản ứng Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 - Nhận xét: + Từ phương trình bề mặt đáp ứng hình ta nhận thấy yếu tố tỷ lệ mol NaNO2 tỷ lệ mol acid salicylic có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất phản ứng Hai tỷ lệ tăng lên dẫn đến tăng hiệu suất tổng hợp nhiên tỷ lệ tăng cao làm giảm hiệu suất phản ứng, thể qua yếu tố X X2 + Tương quan tỷ lệ mol NaNO2 tỷ lệ mol acid salicylic tương quan có ý nghĩa thể qua hệ số X1X2 Hệ số tương quan cho thấy tăng yếu tố hiệu suất phản ứng tăng + Tương quan tỷ lệ mol NaNO2 thời gian tương quan có ý nghĩa thể qua hệ số tương quan X1X3 Hệ số tương quan cho biết đồng thời tăng yếu tố hiệu suất giảm Hình 3: Đường cong biểu diễn phụ thuộc hiệu suất vào biến riêng lẻ - Tiến hành dự đoán giá trị tối ưu hiệu suất phản ứng phần mềm Kết tối ưu là: tỷ lệ mol NaNO2 sulfapyridin = 2,5; tỷ lệ mol salicylic sulfapyridin = 2,6332; thời gian phản ứng 161 phút Lặp lại thí nghiệm theo điều kiện dự đoán lần, ta thu hiệu suất sau: 83,15%; 82,34%; 82,76% Hiệu suất phản ứng thực tế trung bình 82,75%, khác biệt khơng có ý nghĩa với hiệu suất dự đoán 83,124% Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học Kết xác định tính chất kiểm tra độ tinh khiết Bảng 4: Bảng tóm tắt tiêu định tính kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm Chỉ tiêu SKLM Kết Kiểm tra với hệ dung mơi, kết khơng có vết phụ vết sản phẩm -1 IR Dao động ứng với νmax: 1678 cm (-CO), -1 1537 cm (-C=C-) ]+ MS [M+H 399,0653 [M-H] 397,0696 UV λmax = 366 nm λmax = 243 nm Điểm chảy Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm o o 240 C-245 C kèm phân hủy Độ tinh khiết 98,71% theo HPLC Kết phù hợp với nghiên cứu quốc tế công bố Như vậy, sản phẩm sulfasalazin(4,5) BÀNLUẬN Kết tối ưu hoá thể giá trị chọn khảo sát tốt đường có dạng parabol, giá trị cực đại nhìn thấy nằm miền giá trị khảo sát Cả yếu tố khảo sát có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, giá trị tăng hiệu suất phản ứng tăng Nhưng giá trị tăng đến giá trị ngưỡng hiệu suất bắt đầu giảm xuống Cả yếu tố tương quan qua lại Như vậy, mơ hình đáp ứng tốt, giá trị chọn để khảo sát tối ưu Vùng giá trị cực đại nhìn thấy đường đồng mức, giá trị hiệu suất thu sau tiến hành thực nghiệm dựa mơ hình có giá trị gần giá trị dự đoán, sau tiến hành tối ưu, hiệu suất tổng hợp đạt 82,75% KẾTLUẬN Nghiên cứu khảo sát xây dựng quy trình tổng hợp sulfasalazin từ nguyên liệu sulfapyridin, NaNO2 acid salicylic cách diazo hóa sulfapyridin ghép đơi muối diazonium với acid salicylic Đây phương pháp dễ thực hiện, trang thiết bị đơn giản nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm 565 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp sulfasalazin phần mềm Modde 5.0 đưa thơng số tối ưu cho quy trình tổng hợp kiểm tra thực nghiệm Kết tối ưu là: tỷ lệ mol NaNO2 sulfapyridin = 2,5; tỷ lệ mol salicylic sulfapyridin = 2,6332; thời gian phản ứng 161 phút Định tính, kiểm tra độ tinh khiết phương pháp: sắc kí lớp mỏng, MS, UV, IR, HPLC cho thấy sản phẩm tổng hợp hoàn toàn phù hợp với cấu trúc dự đoán, độ tinh khiết cao, hàm lượng đạt 98,71% Cross RK, Jung C, Wasan S, et al (2006), "Racial differences in disease phenotypes in patients with Crohn’s disease", Inflamm Bowel Dis, 12, pp 192-198 https://monographs.iarc.fr/wp-content/uploads/2018/06 /mono108-08.pdf (truy cập 06/2018) https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/sulfasalazine (truy cập 06/2018) Karl HA (1977), "4-(4-hydroxy-or acetoxy-3-carbomethoxy phenylazo)-benzenesulphonyl chloride", US Patent 4,405,429 Karl HA (1986), "2-hydroxy-5-(arylazo)-benzene alkanoic acids", US Patent 4,628,083 Nguyễn Thị Chung (2009), Ứng dụng tối ưu hóa thống kê lĩnh vực nghiên cứu dược phẩm, Bài giảng cao học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, tr 53 Watkinson G (1986), "Sulphasalazine: a review of 40 years' experience", Drugs, 32, pp 1-11 TÀILIỆUTHAMKHẢO Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 Buning C and Lochs H (2006), "Conventional therapy for Crohn's disease", World J Gastroenterol, 12(30), pp 4794-4806 Chen J (2007), "Determination of Sulfasalazine Tablets by HPLC", Food and Drug Control Institute of Nanning City, Nanning, China 566 Chuyên Đề Dược ... 99,5 ≥ 99,9 ≥ 99,9 Thiết bị nghiên cứu Tiêu chuẩn Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Tổng hợp Kiểm Nghiệm (HPLC) Kiểm Nghiệm (HPLC) Bercher,... * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp sulfasalazin phần mềm Modde 5.0 đưa thông số tối ưu cho quy trình tổng hợp kiểm tra thực nghiệm Kết tối ưu là: tỷ lệ mol NaNO2 sulfapyridin... tổng hợp sulfasalazin + Giai đoạn 1: Tổng hợp muối sulfapyridin diazonium clorid từ sulfapyridin natri nitrit môi trường acid HCl, nhiệt độ phản ứng trì từ oC đến oC + Giai đoạn 2: Tổng hợp sulfasalazin