Nghiên cứu này tiến hành thiết kế và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR sử dụng 6 cặp mồi khuếch đại các gen đích VrrA, pagA, capA và ypo2088, pla, caf1 chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis trên các chủng đã xác định có đầy đủ plasmid độc. Đây là cơ sở cho việc chế tạo kit multiplex PCR chẩn đoán đồng thời B. anthracis và Y. pestis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và môi trường.
TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SỐ - 9/2015 THIẾT KẾ VÀ TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX PCR CHẨN ĐOÁN ĐỒNG THỜI VI KHUẨN THAN VÀ VI KHUẨN DỊCH HẠCH Nguyễn Thái Sơn1, Nguyễn Văn An TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu tiến hành thiết kế tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi khuếch đại gen đích VrrA, pagA, capA ypo2088, pla, caf1 chẩn đoán đồng thời B anthracis Y pestis chủng xác định có đầy đủ plasmid độc Đây sở cho việc chế tạo kit multiplex PCR chẩn đoán đồng thời B anthracis Y pestis từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng môi trường Đối tượng phương pháp: Chủng vi khuẩn than dịch hạch lưu giữ Học viện Quân y xác định có đủ plasmid chứa gen độc hai vi khuẩn Các cặp mồi sử dụng để phát gen VrrA, capA, pagA B anthracis gen ypo 2088, pla, caf1 Y pestis thiết kế dựa trình tự gen cơng bố Genbank Chủng vi khuẩn sau bất hoạt nhiệt, tiến hành tách triết theo thường qui kit QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Đức) Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR để đảm bảo phát đồng thời gen đích quan tâm cách tối ưu hóa thành phần chu trình nhiệt phản ứng Kết kết luận: Thiết kế tối ưu hóa thành cơng phản ứng multiplex PCR chẩn đoán đồng thời vi khuẩn than dịch hạch sử dụng cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen đích vi khuẩn gen chromosome (VrrA, ypo2088) gen plasmid (capA, pagA, pla, caf1) * Từ khóa: Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR ESTABLISHING A NOVEL MULTIPLEX PCR TO DETECT SIMULTANEOUSLY BACILLUS ANTHRACIS AND YERSINIA PESTIS SUMMARY Objective: The study aimed to establish a novel multiplex PCR by using six new specific primer pairs targeting to the VrrA, pagA, capA and ypo2088, pla, caf1 genes of Học viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn An (ank59hvqy@gmail.com) Ngày nhận bài: 24/3/2015; Ngày phản biện đánh giá: 23/4/2015 (1) 48 TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SOÁ - 9/2015 B anthracis and Y pestis The assay then was used to develop a multiplex PCR kit for simultaneously detecting B anthracis and Y pestis which carried toxic plasmid genes from clinical and environment samples Method: B anthracis and Y pestis strains determined to carry plasmid toxic genes were used Six specific primer pairs were designed by using Prime3 software basing on reference sequences retrieved from GenBank After heat inactivation, DNA from bacteria was extracted by using QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) following the manufacturer’s instructions, subsequently stored at -80°C until use The PCR components and temperature cycle were optimized to ensure the simultaneous detection of target genes Findings and conclusion: We succeeded to establish a novel multiplex PCR simultaneously detecting B anthracis and Y pestis Six specific primer pairs were able to amplify target genes of two bacteria including two chromosome genes (VrrA, ypo2088) and four plasmid genes (capA, pagA, pla, caf1) *Key words: Bacillus anthracis, Yersinia pestis, multiplex PCR ĐẶT VẤN ĐỀ mầm bệnh phải tiến hành nhiều phản Khủng bố sinh học đặt mức ứng PCR Xuất phát từ vấn đề quan tâm hàng đầu an ninh giới, đặc tiến hành nghiên cứu nhằm biệt từ sau vụ khủng bố vi khuẩn than thiết kế tối ưu hóa phản ứng multiplex (Bacillus anthracis) Mỹ năm 2001, tiếp PCR chẩn đốn nhanh, xác đồng theo việc xác định vi khuẩn dịch thời hai vi khuẩn than dịch hạch hạch (Yersina pestis) hai người Mỹ ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP năm 2002 [5], [9] Trong vụ cơng NGHIÊN CỨU nghi ngờ có khủng bố sinh học, việc phát Chủng vi khuẩn nghiên cứu: Các nhanh tác nhân sinh học chủng vi khuẩn Bacillus anthracis yếu tố định đến an ninh quốc Yersina pestis lưu giữ Học viện gia Việc sàng lọc nhanh mẫu nghi Quân y xác định có đủ plasmid ngờ giúp kiểm soát lây lan đảm chứa gen độc chủng vi khuẩn đối bảo điều trị xác mầm bệnh Hiện chứng (Echerichia coli, Bacillus cereus) nay, phương pháp chẩn đốn B đặt mua cơng ty Microbiologics anthracis Y pestis PCR (polymerase (Mỹ) chain reaction) phương pháp có độ Các cặp mồi: Các cặp mồi sử dụng nhậy, độ đặc hiệu cao thời gian cho kết để phát gen VrrA, capA, pagA nhanh [6], [7] Các nghiên cứu trước B anthracis gen ypo 2088, pla, caf1 nước chủ yếu tập trung thiết Y pestis thiết kế dựa trình kế phản ứng PCR chẩn đoán loại vi tự gen công bố Genbank, khuẩn than vi khuẩn dịch hạch [1], cặp mồi có trình tự sau: [2], [3], điều đẫn đến nhiều thời gian tốn xác định 49 TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SỐ - 9/2015 Bảng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gen đích Vi trí gen Mồi Trình tự VrrA Chromosome vi khuẩn than F R 5’ CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 3’ 5’ CCTCGCGCACTTCTTTTTCT 3’ 222 pagA Plasmid pOX1 vi khuẩn than F R 5’ AAATGGAGCACGGCTTCTGA 3’ 5’ AGCCTGTATCCACCCTCACT 3’ 751 capA Plasmid pOX2 vi khuẩn than F R ypo2088 Chromosome vi khuẩn dịch hạch F R pla caf1 Plasmid pPCP1 vi khuẩn dịch hạch Plasmid pMT1 vi khuẩn dịch hạch 5’ TGACGATGACGATGGTTGGT 3’ 5’ GCTTCCTGTCTAGGACTCGG 3’ 5’ GGATGAGATAACGCGGGTGT 3’ 5’ AGAGAATCGTGATGCCGTCC 3’ 610 103 F R 5’ CGGGATGCTGAGTGGAAAGT 3’ 5’ ATTACCCGCACTCCTTTCGG 3’ 438 F R 5’ CGCTTACTCTTGGCGGCTAT 3’ 5’ GCTGCAAGTTTACCGCCTTT 3’ 271 Tách chiết DNA Vi khuẩn B anthracis Y pestis thu hoạch nước muối sinh lý, nồng độ vi khuẩn đạt 106 vk/ml Tiến hành bất hoạt vi khuẩn nhiệt ướt 1210C x 15 phút để đảm bảo tất thể dinh dưỡng bào tử (đối với B anthracis) bị tiêu diệt [8] Sau dung dịch canh khuẩn tiến hành tách chiết theo thường qui kít QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Đức) Tồn qui trình thực phịng an tồn sinh học cấp cấp Học viện Quân y Thiết kế tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR khuếch đại đồng thời gen đích B anthracis Y pestis Phản ứng multiplex PCR thiết kế dựa phản ứng PCR tiêu chuẩn (tổng thể tích 25µl, thành phần gồm: Buffer nồng độ 1X, 50 Sản phẩm (bp) dNTPs nồng độ 200µM/mỗi loại, MgCl nồng độ khoảng 1-4mM, primer nồng độ khoảng 0,04-0,6µM/mỗi loại, Taq polymerase nồng độ khoảng 1-2U/25µl, DNA template nồng độ 150ng/25µl) [4] Tuy nhiên, phản ứng multiplex PCR có bổ sung thêm cặp mồi để phát đồng thời gen khác nhau, việc bổ sung làm cho nồng độ thành phần thay đổi so với phản ứng PCR tiêu chuẩn, đồng thời xảy tượng cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn dẫn tới khơng phát các gen đích quan tâm Chính tiến hành tối ưu hóa thành phần chu trình nhiệt phản ứng multiplex PCR để đảm bảo phản ứng phát đồng thời gen đích quan tâm Các nội dung tối ưu hóa bao gồm: Tối ưu hóa nồng độ mồi lượng TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SOÁ - 9/2015 DNA mẫu cách tiến hành phản ứng PCR với nồng độ mồi lượng DNA mẫu khác vi khuẩn, sau vào kết điện di để lựa chọn nồng độ mồi lượng DNA thích hợp loại vi khuẩn Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cách chạy gradient nhiệt độ gắn mồi, nhiệt độ trung gian chia tự động máy iCyler từ 540C đến 580C Thời gian gắn mồi áp dụng 45 giây, số chu kì phản ứng áp dụng 32 Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cách cố định nồng độ dNTP chọn dải nồng độ MgCl2 từ - - - 5mM Tối ưu hóa nồng độ dNTP cách cố định nồng độ MgCl2 tối ưu chọn dải nồng độ dNTP từ 0,25 - 0,4 - 0,8mM Phản ứng PCR tiến hành máy GeneAmp PCR System 9700 iCyler Sản phẩm PCR điện di gel Agarose 2% dung dịch đệm TBE 0,5X (100V/50 phút), sau nhuộm Ethidium bromide 15 phút chụp ảnh gel KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tối ưu hàm lượng DNA nồng độ mồi B anthracis Y pestis Tối ưu hàm lượng DNA nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng cách tiến hành lặp lại lần, mỗi lần thực hiện 16 phản ứng multiplex PCR giống về các thành phần chỉ khác tỉ lệ hàm lượng DNA Y pestis/B anthracis nồng độ cặp mồi sử dụng Trong tỉ lệ hàm lượng DNA Y pestis/B anthracis thay đổi theo tỉ lệ 1/2, 1/4, 1/8, 1/10, với tỉ lệ tiến hành phản ứng với nồng cặp mồi sử dụng chẩn đoán Y pestis B anthracis (0,1; 0,6 µM), (0,2; 0,5 µM), (0,3; 0,4 µM), (0,4; 0,3 µM) 751bp 610bp 500bp 222bp 438bp 271bp 100bp 103bp M: Marker 100 bp 1: tỉ lệ DNA của Y pestis/B anthracis là 1/10 2: tỉ lệ DNA của Y pestis/B anthracis là 1/8 3: tỉ lệ DNA của Y pestis/B anthracis là 1/4 4: tỉ lệ DNA của Y pestis/B anthracis là 1/2 Hình Tối ưu lượng DNA nồng độ mồi của B anthracis Y pestis phản ứng multiplex PCR Kết quả thể hiện hình cho thấy đoán Y pestis 0,1 µM; B anthracis tỉ lệ hàm lượng DNA Y pestis/B 0,6 µM sản phẩm xuất băng anthracis phản ứng 1/10 đặc hiệu tương ứng với gen đích nồng độ cặp mồi sử dụng chẩn khơng có băng phụ 51 TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SOÁ - 9/2015 500bp 222bp 100bp 751bp 610bp 438bp 271bp 103bp M: Marker 100 bp 1: nhiệt độ gắn mồi 54°C 2: nhiệt độ gắn mồi 56°C 3: nhiệt độ gắn mồi 57°C 4: nhiệt đợ gắn mời 58°C Hình Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR Kết hình cho thấy nhiệt độ gắn mồi 560C sản phẩm xuất băng đặc hiệu tương ứng với gen đích khơng có băng phụ Tối ưu nồng độ MgCl2 Để tối ưu nồng độ MgCl2, tiến hành lặp lại lần, mỗi lần thực phản ứng multiplex PCR giống về các thành phần, chỉ khác về nồng độ MgCl2 (2mM, 3mM, 4mM, 5mM) 751bp 500bp 300bp 100bp 610bp 438bp M: Marker 100 bp 1: nồng độ MgCl2 2mM 2: nồng độ MgCl2 3mM 3: nồng độ MgCl2 4mM 4: nồng độ MgCl2 5mM 271bp 222bp 103bp Hình Tối ưu nồng độ MgCl2 cho phản ứng multiplex PCR Tối ưu nhiệt độ gắn mồi Để tối ưu nhiệt độ gắn mồi, tiến hành lặp lại lần, mỗi lần phản ứng multiplex PCR giống về các thành phần, chỉ khác về nhiệt độ gắn mồi (540C, 560C, 570C, 580C) Kết hình cho thấy nồng độ MgCl2 3mM sản phẩm xuất băng đặc hiệu tương ứng với gen đích khơng có băng phụ 52 TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SỐ - 9/2015 751bp 610bp 500bp M: Marker 100 bp 1: nồng độ dNTP 0,2 mM 2: nồng độ dNTP 0,4mM 3: nồng độ dNTP 0,8mM 438bp 271bp 222bp 103bp 100bp Hình Tối ưu nồng độ dNTP cho phản ứng multiplex PCR Kết hình cho thấy nồng độ dNTP 0,25mM sản phẩm xuất băng đặc hiệu tương ứng với gen đích khơng có băng phụ Phản ứng multiplex PCR với thành phần chu kỳ nhiệt tối ưu Tiến hành thực lặp lại lần phản ứng PCR với thành phần chu kỳ nhiệt tối ưu, kết thu hình sau M: Marker 100 bp 500bp 751bp 610bp 438bp 222bp 100bp 271bp 103bp Hình Phản ứng multiplex PCR sau tối ưu Tối ưu nồng độ dNTP Để tối ưu nồng độ dNTP, tiến hành lặp lại lần, mỗi lần thực phản ứng multiplex PCR giống về các thành phần, khác nồng độ dNTP Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR với thành phần và chu kỳ nhiệt đã tối ưu được thể hiện hình cho thấy: Xuất hiện cả băng đặc hiệu tương ứng với gen đích của B anthacis, Y pestis và không có băng phụ KẾT LUẬN Thiết kế tối ưu hóa thành cơng phản ứng multiplex PCR chẩn đốn đồng thời vi khuẩn than dịch hạch sử dụng cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen đích gen chromosome (VrrA, ypo2088) gen plasmid 53 TẠP CHÍ Y DƯC THỰC HÀNH 175 - SOÁ - 9/2015 (capA, pagA, pla, caf1) Chu trình nhiệt là: 940C: phút - (940C: phút, 560C: 45 giây, 720C: 50 giây) x 32 chu kỳ - 720C: 10 phút Các thành phần phản ứng gồm: Dream buffer nồng độ 1,2X, dNTP nồng độ 0,25mM, MgCl2 nồng độ 3mM, Dream Taq DNA polymerase nồng độ 2,5U, primer (VrrA, pagA, capA) nồng độ 0,6µM, primer (ypo2088, pla, caf1) nồng độ 0,1µM, tỉ lệ DNA template Y pestis/B anthacis 1/10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Thị Thu Hà Cs (2012) PCR chẩn đốn nhanh, xác vi khuẩn Bacillus anthracis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng mơi trường, Y học dự phịng, số 8, tr.155-163 Nguyễn Thái Sơn Cs (2011) Nghiên cứu số biện pháp ứng phó tình bị cơng tác nhân sinh học trực khuẩn than (Bacillus anthracis), Báo cáo tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án A037 Nguyễn Thái Sơn Cs (2011) Nghiên cứu số biện pháp ứng phó tình bị công tác nhân sinh học vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis), Báo cáo tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án A037 Henegariu O., Heerema N A., 54 Dlouhy S R et al (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol”, Biotechniques, 23(3), pp 50411 Leggiadro R J Bioterrorism: a clinical reality, Pediatr Ann 2007, 36(6), pp 352-8 Matero P., Pasanen T., Laukkanen R et al (2009) Real-time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis, APMIS, 117(1), pp 34-44 Safari Foroshani N., Karami A., Pourali F (2013) Simultaneous and Rapid Detection of Salmonella typhi, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis by Using Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR), Iran Red Crescent Med J., 15(11), pp e9208 Spotts Whitney E A., Beatty M E., Taylor T H., Jr et al (2003) Inactivation of Bacillus anthracis spores, Emerg Infect Dis, 9(6), pp 623-7 Stewart A., Satterfield B., Cohen M et al (2008) A quadruplex real-time PCR assay for the detection of Yersinia pestis and its plasmid, J Med Microbiol 57(Pt 3), pp 324-31 ... bố vi khuẩn than thiết kế tối ưu hóa phản ứng multiplex (Bacillus anthracis) Mỹ năm 2001, tiếp PCR chẩn đoán nhanh, xác đồng theo vi? ??c xác định vi khuẩn dịch thời hai vi khuẩn than dịch hạch hạch... pestis và không có băng phụ KẾT LUẬN Thiết kế tối ưu hóa thành cơng phản ứng multiplex PCR chẩn đoán đồng thời vi khuẩn than dịch hạch sử dụng cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen đích gen chromosome... tâm Chính tiến hành tối ưu hóa thành phần chu trình nhiệt phản ứng multiplex PCR để đảm bảo phản ứng phát đồng thời gen đích quan tâm Các nội dung tối ưu hóa bao gồm: Tối ưu hóa nồng độ mồi lượng