Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước doc

Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt 1 Trường Đại học Indiana (Indianapolis, IN, USA) và 1 Trường Đại học Haeidelberg (Heidelberg, Đức) Tạp chí BioTechniques 23: 504-511 (tháng 9/1997) Người dịch: Lưu Quang Minh 1- Giới thiệu Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Từ các mô tả đầu tiên về nó năm 1988 [6], phương pháp này đã từng được áp dụng thành công trong rất nhiều lĩnh vực thí nghiệm ADN gồm có phân tích mất đoạn [2,8], đột biến [14], đa hình [11] hoặc trong các phương pháp định lượng [10] và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR) [7]. Vai trò của các thành phần hoá chất khác nhau trong phản ứng PCR đã từng được đề cập đến [3, 9, 12, 13], và quy trình phản ứng multiplex PCR cũng đã được miêu tả bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, rất ít công trình nghiên cứu [5, 15] đưa ra thảo luận rộng rãi về một số nhân tố (ví dụ: nồng độ mồi, chu trình nhiệt) có thể ảnh hưởng tới kết quả của việc phân tích phản ứng multiplex. Trong nghiên cứu này, hơn 50 locus đã được nhân lên trong nhiều phản ứng multiplex PCR khác nhau sử dụng một loại đệm PCR chứa KCl thông thường. Một nghiên cứu về các thông số ảnh hưởng tới việc khuếch đại trong phản ứng multiplex PCR đã được tiến hành nhằm giải quyết một số vần đề đặc biệt trong phản ứng multiplex PCR bao gồm cả việc các locus được nhân lên một cách thất thường hoặc không được nhân lên và những khó khăn trong việc đưa ra kết luận. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu này, một quy trình từng bước cho phản ứng multiplex PCR đã được thiết kế (hình 1) với các giải pháp thực tiễn cho nhiều vấn đề vướng mắc. Quy trình này sẽ rất có ích cho những công việc sử dụng công nghệ PCR trên cả hai lĩnh vực nghiên cứu và điều trị. 2- Nguyên liệu và phương pháp 2.1- Những dung dịch và hoá chất cần thiết cho phản ứng PCR Nucleotide (dNTP) (hãng Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] hoặc hãng Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) được bảo quản dưới dạng dung dịch gốc 100mM (25mM mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Đệm PCR 10x chuẩn của hãng Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA bao gồm: 200mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 8.3 (ở 24 0 C) và 15mM MgCl 2 . Taq ADN Polymerase được mua từ hãng Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) hoặc từ hãng Perkin-Elmer. Dimethyl sulfoxide (DMSO), albumin huyết thanh bò (BSA) và glycerol được mua từ hãng Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Mồi được lấy từ hãng Genosys [The Woodlands, TX, USA] hoặc Research Genetics [Huntsville, AL, USA] hoặc được tự tổng hợp và được sử dụng trong phản ứng với nồng độ cuối cùng từ 10 đến 25 pmol/uL mỗi mồi. Một nhóm các cặp mồi (sY) được sử dụng để chỉ ra sự mất đoạn trên nhiễm sắc thể giới tính Y [8, 16]. 15 cặp mồi khác được sử dụng đối với gen trên nhiễm sắc thể giới tính X của người gây nên bệnh teo cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy - DMD) [4]. Các cặp mồi khác chỉ ra sự đa hình của các locus (microsatellites) trên nhiễm sắc thể số 12 ở người (Research Genetics). Các cặp mồi trên được đưa vào trong các hỗn hợp phản ứng multiplex như đã miêu tả ở bảng 1 và các hình 2b, 3b, 5e. ADN hệ gen được tách chiết và tinh sạch theo quy trình sử dụng Sodium dodecyl sulfate (SDS)/proteinase K (hãng Boehringer Mannheim). 2.2- Quy trình PCR cơ bản Phản ứng PCR cơ bản (thể tích 25µL) bao gồm: nước khử ion hấp khử trùng; đệm PCR (1x); hỗn hợp dNTP (200µM mỗi loại); các mồi (0.04-0.6µM mỗi loại); DMSO, glycerol hoặc BSA (5%-nếu dùng); Taq ADN polymerase (1-2 U/25µL phản ứng) và ADN hệ gen (150ng/25µL phản ứng). Các thành phần phản ứng có thể cho vào theo các thứ tự khác nhau nhưng nên đưa nước vào trước tiên. Việc trộn mẫu phải được thực hiện trên đá lạnh, và các tube phản ứng phải được giữ trên đá trước khi đặt chúng vào khuôn kim loại đã được làm nóng hoặc nồi ử water-bath (94 0 C) của máy chu trình nhiệt (máy PCR). Đối với việc đánh dấu phóng xạ, 1µCi [ 32 P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ngay lập tức được đưa vào 100uL hỗn hợp chính trước khi bắt đầu phản ứng. Kết quả phản ứng PCR đối với các thể tích 100µL, 25µl hoặc 6.2µL là như nhau. Tuy nhiên với thể tích nhỏ, việc lấy, hút hoá chất rất khó khăn, đặc biệt là đối với dNTP. Nhiều chu trình nhiệt khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu này và tất cả đều vận hành tốt sau khi có các điều chỉnh nhỏ. 2.3- Phân tách gel các sản phẩm PCR Các sản phẩm PCR của các locus không có đa hình (nhiễm sắc thể X và Y) đã được phân tách bằng phương pháp điện di trên gel agarose 3% của hãng SeaKem LE hoặc hãng NuSieve (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) trong đệm TAE 1x [0.04M Tris-acetate; 0.001M EDTA (pH 8.0)] hoặc đệm TBE 1x [0.09M Tris-borate; 0.002M EDTA (pH 8.0)], sử dụng giải điện thế 7- 10V/cm ở nhiệt độ phòng. Thể tích sản phẩm PCR đưa vào mỗi giếng là như nhau đối với các loại gel phân tích trong nghiên cứu này. Quan sát kết quả sau khi nhuộm các bản gel trong dung dịch chứa 0.5-1µg/mL ethidium bromide. Gel giải trình tự (6% polyacrylamide [PAA]/7M urea) được sử dụng để phân tách các sản phẩm PCR trong trường hợp có sự đa hình trên các locus nghiên cứu hoặc yêu cầu độ phân giải cao hơn. Một lượng khoảng 0.2µL sản phẩm PCR có đánh dấu phóng xạ được đưa vào mỗi giếng của gel sau khi đã trộn với đệm chạy (loading buffer). Những gel này được chạy điện di trên đệm TBE 0.6x với hiệu điện thế 1800-2000V (60A) trong khoảng 2 giờ. Kết quả bản phóng xạ sẽ được ghi lại sau khi chạy phản ứng qua đêm. 3- Kết quả và thảo luận Qua rất nhiều thí nghiệm, một quy trình cho phản ứng multiplex PCR đã được thiết kế (hình 1) bao gồm một số giải pháp thực tiễn cho một vài vấn đề thường gặp nhất. Để thuận tiện và dễ dàng khi sử dụng, những từ in nghiêng kết hợp với sơ đồ cùng với nhiều điểm trọng tâm được trình bày trong phần Nguyên liệu và Phương pháp và trong các tiểu phần sau đây. 3.1- Những vấn đề căn bản trong phản ứng multiplex PCR ADN mồi (bước 1 và 2). Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 - 24bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35%-60%, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng 55-58 0 C hoặc cao hơn. Những mồi dài hơn (mồi DMD, 28-30bp) cho phép phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn. Để tính toán điểm nóng chảy và kiểm tra khả năng bắt cặp của 2 mồi (primer-primer), "mồi 1.2" (có thể tải xuống từ website: ftp.bio.indiana.edu) đã được sử dụng. Để kiểm tra các trình tự có khả năng lặp lại, các mồi sử dụng đã được đối chiếu với cơ sở dữ liệu trình tự tại Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center for Biotechnology Information - NCBI) sử dụng các công cụ tìm kiếm (Basic Local Alignment Search Tool - BLAST). PCR từng locus riêng biệt (bước 3). Một phản ứng PCR để nhân lên từng locus riêng biệt đã được thiết kế. Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm PCR 1x, 0.4µM mồi, 5% DMSO và 1U Taq ADN polymerase trong thể tích phản ứng 25µL. Khi phản ứng kết thúc, các kết quả được so sánh liên tục trên cùng chu trình nhiệt hoặc trong cùng điều kiện, trên các loại máy có cùng model và trên các máy khác model hoặc khác hãng sản xuất. Kết quả rất giống nhau nếu chạy trên cùng một máy hoặc các máy cùng model nhưng có sự khác biệt rõ rệt khi sử dụng các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau. Tuy nhiên, chỉ với các điều chỉnh trong chu trình nhiệt, kết quả đã trở nên tốt hơn đối với tất cả các loại máy sử dụng. Chúng tôi quan sát thấy rằng, đối với các locus được kiểm tra (dài 100-300bp), số lượng bản copy của một số sản phẩm PCR đã tăng lên đáng kể khi giảm nhiệt độ kéo dài trong chu trình nhiệt xuống. Đối với các locus được nhân lên riêng biệt, thời gian gắn mồi (30-120 giây) và thời gian kéo dài (30-150 giây) không ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả, nhưng tính đặc hiệu của sản phẩm PCR tăng lên hoặc giảm đi phụ thuộc rất nhiều vào sự thay đổi nhiệt độ gắn mồi. Quy trình phản ứng PCR A đã đưa ra kết quả tốt nhất (bảng 2) để nhân lên locus đặc hiệu số 22 trên NST giới tính Y (hình 2a). Phản ứng Multiplex PCR: Hỗn hợp mồi cùng nồng độ (bước 4). Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và nhân lên đồng thời nhiều locus (bảng 1 và hình 2b) đòi hỏi sự thay đổi/tối ưu các thông số của phản ứng. Lần đầu khi thực hiện phản ứng multiplex PCR, nên sử dụng các mồi với một đương lượng gram tương đương nhau (cùng nồng độ). Kết quả này sẽ cho ta thấy những nồng độ mồi nào hay các thông số nào cần phải thay đổi. Ví dụ về những thay đổi hữu hiệu đã được chứng minh và thảo luận ở phần sau; tuy nhiên, các ví dụ này không nhất thiết phải tuân theo một trật tự xác định đã được liệt kê trong quy trình này (hình 1) khi mà các thông số (ví du: nhiệt độ kéo dài) được thay đổi nhiều lần. 3.2- Tối ưu các điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng multiplex PCR Nhiệt độ kéo dài (bước 5, A-C). Hình 2c chỉ ra các kết quả thu được sau khi cả bốn hỗn hợp phản ứng khác nhau chứa một lượng mồi tương đương nhau khuếch đại các locus trên NST giới tính Y (0.4µM mỗi mồi) được đưa vào phản ứng multiplex PCR theo quy trình A và B (bảng 2); quy trình B có nhiệt độ kéo dài cao hơn (72 0 C) và có thời gian gắn mồi cũng như thời gian kéo dài cao hơn. Nhìn chung, sản phẩm PCR của hỗn hợp phản ứng Y-1, Y-3* và Y-4 ở quy trình A cao hơn rõ rệt. Thêm vào đó, ở quy trình B, một số sản phẩm chính không xuất hiện (đối với hỗn hợp Y-1 và Y-2) và xuất hiện các sản phẩm phụ (ở hỗn hợp Y-1 và Y-3*). Kết quả ở quy trình B hoàn toàn không tốt và đã cho thấy rằng nhiệt độ kéo dài cao hơn trong quy trình này đã làm giảm sự nhân lên của một vài locus, cho dù chúng tôi đã cố gắng bù đắp bằng việc sử dụng thời gian gắn mồi cao hơn và thời gian kéo dài cao hơn một chút so với quy trình A. Thời gian kéo dài (bước 5, A, B và D). Trong phản ứng multiplex PCR, khi mà nhiều locus được nhân lên đồng thời, phần đóng góp của enzyme và các nucleotide trở thành một nhân tố giới hạn và cần phải có nhiều thời gian cho sự trùng hợp các phân tử để hoàn thành quá trình tổng hợp của tất cả các sản phẩm. Hai thí nghiệm sau đây đã cho thấy vai trò của thời gian kéo dài. Trong thí nghiệm thứ nhất, cặp mồi của NST Y (Y6BaH34pr, 910bp) được đưa vào hỗn hợp mồi của NST X (X-3). Kết quả (hình 3b) đã cho thấy rằng việc tăng thời gian kéo dài trong phản ứng multiplex PCR (quy trình A và D) sẽ làm tăng số lượng các sản phẩm có kích thước lớn. Trong thí nghiệm thứ hai, bốn hỗn hợp phản ứng multiplex cho mồi của NST Y đã được nhân lên sử dụng quy trình PCR C và A (hình 3a và bảng 2). Và khi thời gian kéo dài được tăng lên, số lượng các sản phẩm PCR thu được ở tất cả hỗn hợp phản ứng trên đều tăng lên rõ rệt. Thời gian và nhiệt độ gắn mồi (bước 5, A-D; hình 1). Việc thay đổi thời gian gắn mồi từ 20 giây tới 2 phút không làm thay đổi hiệu quả khuyếch đại (không minh họa), nhưng nhiệt độ gắn mồi là một trong các thông số quan trọng nhất. Mặc dù rất nhiều locus riêng biệt có thể được nhân lên đặc hiệu ở 56-60 0 C, nhưng thí nghiệm của chúng tôi đã cho thấy rằng việc hạ thấp nhiệt độ gắn mồi từ 4-6 0 C là cần thiết đối với các locus được nhân lên đồng thời trong hỗn hợp phản ứng multiplex. Điều này đã được chứng minh trong hình 3, d-f. Hình này đã cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu trong phản ứng multiplex là 54 0 C đối với các mồi có nhiệt độ thích hợp là 60 0 C. ở 54 0 C, mặc dù có thể xuất hiện các sản phẩm khuyếch đại không đặc hiệu (ví dụ: hình 3c), nhưng điều này có thể được khắc phục bằng việc nhân lên đồng thời một số lượng tăng dần các locus đặc hiệu trong phản ứng multiplex và như vậy sẽ không quan sát thấy các sản phẩm không đặc hiệu này. Tương tự như vậy, khi rất nhiều locus đặc hiệu được nhân lên đồng thời thì các locus nhân lên hiệu quả hơn sẽ không ảnh hưởng tới sản lượng các sản phẩm của các locus có hiệu quả thấp. Điều này xuất phát từ thực tế rằng phản ứng PCR có một sự cung cấp hạn chế các nucleotide và enzyme, và tất cả các sản phẩm cạnh tranh nhau trong cùng một nguồn cung cấp này. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR. Hỗn hợp mồi Y-3* được sử dụng để nhân lên hai mẫu ADN hệ gen khác nhau, dừng phản ứng sau khi tăng số lượng các chu kỳ phản ứng (hình 4a). Một trong hai mẫu ADN này là khuôn tốt hơn, khả năng là do chất lượng cao hơn và/hoặc lượng ADN nhiều hơn. Tuy nhiên ở cả hai mẫu này đã chỉ ra sự gia tăng dần dần về sản lượng của tất cả các sản phẩm theo số lượng các chu kỳ phản ứng. Sự dao động rõ ràng nhất về số lượng của các sản phẩm vào khoảng 25 chu kỳ (đối với gel nhuộm ethidium bromide). Thông thường hai mươi tám đến ba mươi chu kỳ là đủ cho một phản ứng; và khi tăng số chu kỳ lên 60, sản phẩm thu được ít đi. 3.3- Tối ưu các thành phần trong phản ứng multiplex Lúc đầu, có một vài sự thay đổi trong các thí nghiệm để kiểm tra khi nào các quy trình PCR giống nhau được sử dụng (ví dụ: hình 2c và 3a). Để giải quyết các vấn đề có thể sinh ra này đòi hỏi phải có sự điều chỉnh các thành phần phản ứng PCR. Số lượng mồi (bước 5, B và C). Ban đầu, các nồng độ tương đương từ 0.2-0.4uM mỗi mồi được đưa vào trong phản ứng multiplex PCR (hình 3c), nhưng có sự khuếch đại không đều, với một vài sản phẩm khó có thể quan sát thấy thậm chí sau khi phản ứng được tối ưu các điều kiện về chu trình nhiệt. Để khắc phục vấn đề này đòi hỏi thay đổi tỉ lệ các loại mồi khác nhau trong phản ứng, với việc tăng lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm lượng mồi đối với các locus “mạnh”. Nồng độ cuối cùng của các mồi (0.04-0.6µM) thay đổi đáng kể giữa các locus và được tính toán tuỳ theo kinh nghiệm. Nồng độ dNTP và MgCl 2 (bước 5D) dNTP. Vai trò của nồng độ dNTP đã được kiểm tra trong phản ứng multiplex PCR với hỗn hợp mồi Y-4. Nồng độ Magnesium chloride (MgCl 2 ) được giữ nguyên (3mM), trong khi nồng độ dNTP được tăng lên từng bậc từ 50-1200µM mỗi loại (hình 4b). Các kết quả tốt nhất ở nồng độ 200 và 400µM mỗi dNTP, còn ở các nồng độ cao hơn việc khuếch đại tức thời bị ức chế. Nồng độ dNTP thấp hơn (50µM) cho phép khuếch đại phản ứng PCR nhưng với lượng sản phẩm ít hơn. Dung dịch dNTP gốc rất nhạy cảm với chu trình làm nóng/làm lạnh. Sau 3-5 chu trình như vậy, các phản ứng multiplex PCR thường không làm việc tốt; các sản phẩm trở nên hầu như hoàn toàn không quan sát thấy. Để tránh vấn đề này, một lượng nhỏ (2-4µl, 10-20 phản ứng) dNTP (25mM mỗi loại) có thể được chia ra và bảo quản ở –20 0 C và li tâm trước khi sử dụng. “Độ bền yếu” này của dNTP không quá rõ ràng trong trường hợp khuếch đại các locus đơn. MgCl 2 . Nồng độ Magnesium chloride yêu cầu cho một phản ứng PCR chuẩn là 1.5mM ở nồng độ dNTP vào khoảng 200µM mỗi loại. Để kiểm tra sự ảnh hưởng của magnesium chloride, một phản ứng multiplex PCR (hỗn hợp Y-3) được tiến hành, duy trì nồng độ dNTP ở 200µM và dần dần tăng nồng độ magnesium chloride từ 1.8 đến 10.8mM (hình 4c). Việc khuếch đại trở nên đặc hiệu hơn (các băng không đặc hiệu đã biến mất), và các sản phẩm thu được có độ tập trung cao (tại nồng độ 10.8mM). Trong phản ứng PCR với 20mM MgCl 2 , các sản phẩm trở nên khó có thể quan sát thấy, như thể phản ứng đã bị ức chế (không minh họa). Sự cân bằng dNTP/MgCl 2 . Để làm việc một cách có hiệu quả, Taq ADN polymerase đòi hỏi phải có magnesium tự do (ngoài magnesium bị kết hợp với dNTP và ADN) [9]. Đây có thể là lý do việc gia tăng nồng độ dNTP (hình 4b) có thể ức chế tức thời phản ứng PCR, ngược lại việc tăng nồng độ magnesium thường mang lại hiệu quả rõ rệt (hình 4c). Bằng việc kết hợp các lượng dNTP và MgCl 2 khác nhau cho thấy nồng độ 200µM mỗi loại dNTP phù hợp với nồng độ MgCl 2 từ 1.5- 2mM, và 800µM dNTP đòi hỏi tối thiểu 6-7mM MgCl 2 . Ngưỡng cho phản ứng ước chừng khoảng 1mM MgCl 2 khi 200µM dNTP được sử dụng, cùng với việc khuyếch đại PCR giảm xuống dưới nồng độ MgCl 2 này. Nồng độ đệm PCR (KCl). So sánh các loại đệm PCR (bước 5, B-D). Nồng độ KCl hoặc đệm PCR. Việc tăng nồng độ đệm tới 2x (hoặc nồng độ KCl tới 100mM) đã làm tăng hiệu quả phản ứng multiplex PCR (hình 4d và hình 3, d-f), hiệu quả này đang trở nên quan trọng hơn việc sử dụng bất kỳ các hoá chất phụ trợ đã được kiểm tra (DMSO, glycerol hoặc BSA). Thông thường, các cặp mồi khuếch đại những sản phẩm dài làm việc tốt hơn ở điều kiện nồng độ muối thấp, ngược lại những cặp mồi khuếch đại các sản phẩm ngắn làm việc tốt hơn ở nồng độ muối cao, nơi mà những sản phẩm dài thường gặp khó khăn hơn trong việc biến tính (so sánh 0.4x với 2.8x ở hình 4d). Ví dụ, cặp mồi sY94 (nhiệt độ nóng chảy 58 0 C) được cặp mồi sY88 (nhiệt độ nóng chảy 58 0 C) và cặp mồi sY151 (nhiệt độ nóng chảy 52 0 C) hỗ trợ ở đệm 0.8x nhưng ở các nồng độ muối cao hơn thì không được. Nồng độ đệm thích hợp có thể giúp đỡ khắc phục các nhân tố khác (kích thước sản phẩm, thành phần GC ) So sánh các loại đệm PCR. Chúng tôi đã tiến hành so sánh một loại đệm PCR đã được mô tả trước đây [6], được gọi là “DMD” cho mục đích của bài báo này, với độ phức tạp thấp nhất, đệm với lượng KCl cơ bản trong phản ứng multiplex. Đệm “DMD” 5x chứa 83mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 335mM Tris-HCl (pH 8.8), 33.5mM MgCl 2 , 50mM β-mercaptoethanol, 850ug/ml BSA và được sử dụng với nồng độ cuối cùng 1x cùng với 10% DMSO và 1.5mM mỗi loại dNTP [1, 2, 4]. Khi được kiểm tra với cặp mồi nhân lên đoạn gen DMD (hỗn hợp X-1) đệm PCR chứa KCl thông thường với nồng độ 1.6x làm việc tốt hơn đệm “DMD” (sản phẩm thu được nhiều hơn) (hình 4e). Các kết quả đã được lặp lại trên hàng tá mẫu ADN người bệnh được kiểm tra. Đệm chứa KCl cơ bản ít phức tạp và dễ dàng hơn trong việc điều chỉnh và tối ưu hoá. Ngoài ra, khi độ chính xác của Taq ADN polymerase cao hơn ở nồng độ dNTP thấp [9], việc sử dụng đệm chứa lượng KCl cơ bản (loại đệm đòi hỏi rất ít dNTP) có thể có ích trong trường hợp các sản phẩm PCR cần phải có các phân tích thêm về đột biến. Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase (bước 5, A và D). ở lượng ADN khuôn vào khoảng 30 và 500ng/25µl phản ứng, hỗn hợp Y-3* cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào (hình 4f); tuy nhiên, dưới 30ng, sản lượng của một vài sản phẩm PCR bị giảm xuống. Khi lượng ADN khuôn rất nhỏ (tính bằng pg), việc khuyếch đại đặc hiệu và có hiệu quả vẫn có thể thu được bằng cách hạ thấp hơn nữa nhiệt độ gắn mồi, đôi khi xuống từ 10-12 0 C (không minh họa) Các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau (Perkin-Elmer) được kiểm tra sử dụng hỗn hợp mồi Y-3 (hình 5a). Dường như nồng độ enzyme hiệu quả nhất vào khoảng 0.4ul hoặc 2U/25µl thể tích phản ứng. Quá nhiều enzyme, có lẽ bởi vì nồng độ glycerol cao trong dung dịch gốc đã dẫn tới việc khuyếch đại không cân bằng các locus khác nhau và sự gia tăng một chút các ảnh hưởng xung quanh. Năm loại Taq ADN polymerase tự nhiên, từ năm nguồn khác nhau, đã được tiến hành thử nghiệm như nhau trong hỗn hợp Y-4 với 1.6x đệm PCR, sử dụng 2U/25µl phản ứng (hình 5b). Sử dụng các hoá chất phụ trợ: DMSO, glycerol, BSA (bước 5E). Nhiều tác giả đã gợi ý sử dụng DMSO và glycerol để nâng cao hiệu quả khuyếch đại (sản phẩm thu được nhiều hơn) và cả tính đặc hiệu (không có sản phẩm không đặc hiệu) của phản ứng PCR, khi chúng được sử dụng với nồng độ thay đổi trong khoảng 5%-10% (thể tích/thể tích) [9]. Tuy nhiên, trong phản ứng multiplex PCR, những hoá chất phụ trợ này lại mang đến các kết quả trái ngược. Ví dụ, 5% DMSO nâng cao khả năng khuyếch đại của một vài sản phẩm và làm giảm đi số lượng các sản phẩm khác, trong khi ở một vài locus thì hoàn toàn không có tác dụng (hình 5c). Các kết quả tương tự như vậy cũng thu được khi dùng với glycerol 5% (không minh họa). Như vậy, sự ích lợi của các hoá chất phụ trợ này cần phải được kiểm tra trong từng trường hợp cụ thể. BSA, với nồng độ lên tới 0.8ug/ul (cao hơn so với mô tả trước đây) đã làm tăng hiệu quả của phản ứng PCR lên rất nhiều lần hơn cả DMSO lẫn glycerol. BSA không có tác động ức chế lên mọi locus được nhân lên (không minh họa). 3.4- Gel Agarose và Gel Polyacrylamide Agarose. Các sản phẩm multiplex PCR khác nhau từ 30-40bp có thể được phân tách dễ dàng trên gel agarose 3% thường sử dụng như SeaKem hoặc NuSieve (FMC BioProducts). Việc phân tách qua đêm các sản phẩm ở hiệu điện thế thấp làm giảm đáng kể độ sắc nét của các băng PCR riêng biệt, nhất là đối với các sản phẩm có kích thước nhỏ hơn 400-500bp. Gel Polyacrylamide (PAA). Để phân tách các sản phẩm PCR chỉ khác nhau vài bp (ví dụ các marker microsatellite), đòi hỏi có gel PAA 6%-10%. Trong khi các loại gel PAA không biến tính làm việc rất tốt đối với các locus không có đa hình, thì các băng lạ xuất hiện khi các microsatellite được phân tách trên các gel dạng này. Ví dụ, trong phân tích một vài locus đa hình đặc hiệu trên NST 12 từ hai khối tế bào lai, mỗi loại mang một bản sao chép từ NST 12 ở người, đối với mọi locus được kiểm tra thấy xuất hiện 2 băng trên gel PAA không biến tính (ví dụ: hình 5d). Trên gel giải trình tự 6% PAA/7M urea thông thường, các sản phẩm PCR được đánh dấu phóng xạ đã chỉ ra một alen trên mỗi locus (so sánh các sản phẩm ở hình 5, d và e). Như vậy, chúng tôi đã trình bày một chuỗi các ví dụ về việc kiểm tra các thông số khác nhau nhằm tối ưu phản ứng multiplex PCR. Việc kết hợp tối ưu hai trong các thông số gồm nhiệt độ gắn mồi và nồng độ KCl (muối) là cần thiết trong mọi phản ứng PCR để thu được các sản phẩm khuyếch đại có tính đặc hiệu cao. Nồng độ Magnesium chloride chỉ cần thiết để làm cân bằng với lượng dNTP, và các giá trị này có thể được giữ cố định cho mọi phản ứng. Mặc dù, việc tăng dần dần nồng độ magnesium chloride có thể tác động vào phản ứng, hai thông số còn lại đã được đề cập ở trên dường như quan trọng hơn nhiều trong việc nhân lên các sản phẩm PCR đặc hiệu. Trong phản ứng multiplex PCR, việc điều chỉnh nồng độ mồi phù hợp cho từng locus là rất cần thiết. Hình 1 đã chỉ ra một phương pháp hợp lý để phát triển các phản ứng multiplex PCR một cách có hiệu quả. Danh sách các nhân tố khác nhau ảnh hưởng tới phản ứng này đã được hoàn thành tương đối đầy đủ. Tuy nhiên, việc tối ưu các thông số được trình bày trong nghiên cứu này đã cung cấp một phương pháp cơ bản để tiếp cận, giải quyết một số vấn đề thông thường trong phản ứng multiplex PCR. Bảng 1. Danh sách các mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Y-1 Y-2 Y-3 Y-4 sY84 DYS273 326 sY 143 DYS231 311 sY86 DYS148 320 sY14 SRY 472 sY134 DYS224 301 sY157 DYS240 285 sY105 DYS201 301 sY95 DYS280 303 sY117 DS209 262 sY81 DYS271 209 sY82 DYS272 264 sY127 DYS218 274 sY102 DYS198 218 sY182 KALY 125 Y6HP35 DYS274 226 sY109 DYF43S1 233 sY151 KALY 183 sY147 DYS232 100 Y6PHc54 n.a. 166 sY149 DYS1 132 sY94 DYS279 150 sY153 DYS237 139 sY88 DYS276 123 sY97 DYS281 104 DMD exon Số Kích thước (bp) DMD exon Số Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) X-1 X-3 12-1 Số 45 547 PM 535 AFM263zd1 D12S332 317-341 PM 535 Số 3 410 AFM205ve5 D12S93 271-291 Số 19 459 Số 50 271 AFM205xg3 D12S310 243-253 Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Tên (locus) Kích thước (bp) Số 17 416 Số 6 202 AFM211wb6 D12S98 228-238 Số 51 388 Số 60 139 AFM206ze5 D12S94 183-201 Số 8 360 AFM299zd5 D12S349 165-181 Số 12 331 AFM135xe3 D12S87 142-168 Số 44 268 AFM122xf6 D12S85 105-125 n.a. = locus không chỉ định; PM = khu vực promoter Bảng 2. Các điều kiện chu trình nhiệt/Các quy trình PCR Quy trình A Quy trình B Quy trình C Tiền biến tính 94 0 C, 4 phút 94 0 C, 4 phút 94 0 C, 4 phút Biến tính 94 0 C, 30 giây 94 0 C, 30 giây 94 0 C, 30 giây Gắn mồi 54-56 0 C, 30 giây* 54 0 C, 1 phút 54 0 C, 45 giây Kéo dài 65 0 C, 1 phút 72 0 C, 1 phút, 20 giây 65 0 C, 2 phút 32 chu kỳ 32 chu kỳ 32 chu kỳ Hoàn chỉnh 65 0 C, 3 phút 72 0 C, 3 phút 65 0 C, 3 phút Quy trình D Quy trình E Quy trình F Tiền biến tính 94 0 C, 4 phút 94 0 C, 4 phút không Biến tính 94 0 C, 30 giây 94 0 C, 30 giây 94 0 C, 30-45 giây Gắn mồi 55 0 C, 30 giây 54 0 C, 45 giây 56-58 0 C, 45 giây Kéo dài 65 0 C, 4 phút 65 0 C, 2 phút 68 0 C, 2 phút, 30 giây 32 chu kỳ 45 chu kỳ 35 chu kỳ Hoàn chỉnh 65 0 C, 3 phút 65 0 C, 5 phút không Phần bôi đậm chỉ ra những thay đổi quan trọng nhất khi so sánh các quy trình * Quy trình A được sử dụng với 2 nhiệt độ gắn mồi khác nhau (xem phần Kết quả và Thảo luận) Hình 2. Phần bôi đậm chỉ ra những thay đổi quan trọng nhất khi so sánh các quy trình * Quy trình A được sử dụng với 2 nhiệt độ gắn mồi khác nhau (xem phần Kết quả và Thảo luận) a- Phản ứng PCR từng locus đơn. Khuếch đại các locus sY sử dụng 1x đệm PCR và quy trình A. Trên gel, các sản phẩm được sắp xếp theo thứ tự tăng dần các locus sY (1=sY14, 2=sY81, 3=sY82, 4=sY84, 5=sY86, 6=sY88, 7=sY94, 8=sY95, 9=sY97, 10=sY102, 11=sY105, 12=sY109, 13=sY117, 14=sY127, 15=sY134, 16=sY143, 17=sY147, 18=sY149, 19=sY151, 20=sY153, 21=sY157 và 22=sY182). Tất cả các sản phẩm đều có kích thước hoàn hảo, và không có sản phẩm không đặc hiệu. Trên tất cả các gel, các băng không được đánh dấu là các marker chuẩn (1-kb; Life Technologies). b- Tối ưu hoá các phản ứng multiplex. Phản ứng multiplex PCR với các hỗn hợp mồi Y-1 (sY84, sY134, sY117, sY102, sY151, sY94 và sY88), Y-2 (sY143, sY157, sY81, sY182 và sY147), Y-3 (sY86, sY105, sY82, Y6HP35, Y6Phc54, sY153 và sY97), Y-4 (sY14, sY95, sY127, sY109, và sY149) trong đệm PCR 1.6x (quy trình E). Y-3* là hỗn hợp Y-3 không chứa mồi Y6HP35 và Y6Phc54. Các mũi tên chỉ các sản phẩm khuyếch đại hoàn hảo. c- Nhiệt độ kéo dài. Phản ứng multiplex PCR với các hỗn hợp Y-1 tới Y-4 và quy trình A và B (bảng 2). Tất cả các sản phẩm khuyếch đại đều nhìn thấy ở 4 băng đầu tiên (nhiệt độ kéo dài 65 0 C). ở 4 băng cuối (nhiệt độ kéo dài 72 0 C), xuất hiện nhiều băng lỗi ở Y-1, Y-2 và các sản phẩm không đặc hiệu ở Y-1 và Y-3*. Tất cả các marker sử dụng trong ảnh là thang chuẩn 1-kb. Trong tất cả các ảnh, quá trình điện di theo hướng từ trên xuống dưới. Hình 3 a. Thời gian kéo dài. Các hỗn hợp phản ứng multiplex PCR Y-1 tới Y-4, so sánh ở 2 quy trình C (thời gian kéo dài 2 phút) và A (thời gian kéo dài 1 phút, nhiệt độ gắn mồi 54 0 C). Khi so sánh các băng ta thấy rằng các sản phẩm thu được tốt hơn ở thời gian kéo dài 2 phút. Một số băng không đặc hiệu xuất hiện yếu, có khả năng là do nồng độ đệm thấp (1x). b. Thời gian kéo dài. Phản ứng multiplex PCR với hỗn hợp mồi X-3 (mồi khuyếch đại các exon gen DMD số PM, 3, 50, 6, 60) và cặp mồi Y6BaH34 (sản phẩm 910bp, mũi tên phía trên). Những mồi khuyếch đại các sản phẩm ngắn được nhân lên ở thời gian kéo dài ngắn (1 phút, quy trình A). c. Hỗn hợp mồi có nồng độ tương đương. Phản ứng PCR với các cặp mồi riêng trong hỗn hợp 12-1 (phân chia và trộn lẫn), sử dụng quy trình F. Sản phẩm được sắp xếp trên gel theo kích thước giảm dần của chúng. Các sản phẩm riêng biệt có độ nét và dễ dàng phân biệt được. Khi một lượng cân bằng các mồi được trộn trong cùng một phản ứng multiplex PCR (băng đầu tiên), một số sản phẩm không đuợc nhân lên hiệu quả nhưng các sản phẩm không đặc hiệu đã biến mất. d. (d, e, f) Nhiệt độ gắn mồi, nồng độ đệm và số lượng các mồi. Khuyếch đại hỗn hợp Y-3* (3 băng đầu tiên trên mỗi gel), cặp mồi sY153 (băng 4-6) và hỗn hợp Y-3 (băng 7-12 trong đệm PCR 1x hoặc 2x) trên 3 ADN khuôn khác nhau sử dụng 3 quy trình PCR khác nhau về nhiệt độ gắn mồi (48 0 C, 54 0 C hoặc 59 0 C). Băng 1-9 trên mỗi gel là các phản ứng trong đệm PCR 1x. Băng 10-12 trên mỗi gel là các phản ứng trong đệm PCR 2x. Băng 7-12 trên mỗi gel (cả đệm PCR 1x và 2x) là bộ mồi Y-3. Băng tận cùng trong hình 3, d và f là marker (thang chuẩn 1kb). Các mũi tên nằm ngang nhỏ chỉ những sản phẩm hoàn hảo của hỗn hợp Y-3* (năm sản phẩm) bao gồm sản phẩm đặc hiệu dài nhất trên gel. Mũi tên chéo (hình 3e) cho thấy một sản phẩm không đặc hiệu. Các đầu mũi tên đen đặc chỉ ra thêm 2 sản phẩm được mong đợi trong hỗn hợp Y-3 (tổng số 7 sản phẩm) so với Y-3*. Các đầu mũi tên rỗng chỉ ra vị trí của một số sản phẩm lỗi (ví dụ, hình 3e, băng đầu tiên). Với phản ứng multiplex ở 48 0 C, rất nhiều băng không đặc hiệu xuất hiện. Trong đệm PCR 1x, sản phẩm sY153 được khuyếch đại trong hỗn hợp Y-3* (5 cặp mồi) mạnh hơn trong hỗn hợp Y-3 (7 cặp mồi), điều này chỉ ra rằng ít ra trong một số sản phẩm, việc tăng số lượng các locus được nhân lên đồng thời có thể ảnh hưởng tới sản lượng của một vài locus đặc hiệu. Việc tăng nồng độ đệm PCR từ 1x tới 2x cho phép khuyếch đại cân bằng hơn nhiều sản phẩm đặc hiệu và giúp làm giảm độ tập trung cho rất nhiều sản phẩm không đặc hiệu có kích thước dài (so sánh các băng 7-9 và 10-12). Trong đệm 2x, băng không đặc hiệu có kích thước khoảng 470-480bp (mũi tên đen đặc) đã được loại bỏ bằng cách thay đổi tỷ lệ các nồng độ mồi khác nhau trong phản ứng (so sánh với Y-3, hình 2b). ở 59 0 C, sản phẩm sY153 chỉ có thể quan sát thấy khi sử dụng đệm 2x hoặc khi locus này được khuyếch đại một mình. Hình 4. a- Số chu kỳ. Việc khuyếch đại với 2 khuôn ADN khác nhau sử dụng hỗn hợp mồi Y-3* trong đệm PCR 1.4x cùng với việc tăng dần số chu kỳ lên từng đơn vị là 3 chu kỳ. b- Nồng độ dNTP. Phản ứng PCR sử dụng hỗn hợp Y-4 trong đệm PCR 2x (3mM MgCl 2 ) và tăng dần nồng độ dNTP (50, 100, 200, 400, 600 và 1200uM). Việc khuyếch đại hiệu quả nhất là ở nồng độ dNTP từ 200-400uM. Khi nồng độ MgCl 2 được giữ nguyên không đổi, việc tăng thêm nồng độ dNTP sẽ ức chế phản ứng. c- Nồng độ MgCl 2 . Phản ứng multiplex PCR được thực hiện với hỗn hợp mồi Y-3 trong đệm PCR 1.4x, sử dụng quy trình E và tăng dần dần nồng độ MgCl 2 . d- Nồng độ đệm PCR. Các sản phẩm khuyếch đại của hỗn hợp X-1 (các exon gen DMD số 45, PM, 19, 17, 51, 8, 12, 44 và 4) sử dụng các nồng độ đệm PCR tăng dần và quy trình E. Khi tính chặt chẽ trong hỗn hợp giảm đi, các sản phẩm ngắn đựơc khuyếch đại đặc hiệu hơn, ngược lại, độ tập trung của các sản phẩm dài dần dần giảm xuống. Đối với hỗn hợp mồi riêng, nồng độ đệm tối ưu là 1.2x-1.6x. e- So sánh các đệm PCR. So sánh phản ứng multiplex PCR của hỗn hợp X-1 trong đệm DMD và đệm PCR 1.6x chứa KCl, tỷ lệ các thành phần sử dụng như nhau (ADN, Taq ADN polymerase, nồng độ mồi) và quy trình E. Đối với mọi mẫu ADN được kiểm tra, lượng sản phẩm tăng lên khi sử dụng đệm PCR 1.6x. Chỉ có 4 băng được trình bày, mặc dầu có nhiều mẫu được đưa vào gel và các kết quả tương tự cũng đã được quan sát thấy. f- Lượng ADN khuôn. Các lượng ADN khuôn khác nhau được khuyếch đại với mồi sY153 và hỗn hợp Y-3* trong đệm PCR 2x với quy trình E. Thể tích phản ứng là 25ul. Không có sự khác biệt đáng kể nào khi sử dụng 500 hoặc 30ng ADN; tuy nhiên, một số băng trở nên yếu hơn nếu lượng ADN khuôn tiếp tục giảm xuống tới 0.5ng/25ul phản ứng. Hình 5. a. Lượng enzyme. Các sản phẩm khuyếch đại của hỗn hợp Y-3* được trình bày sau khi sử dụng 0.5, 1, 2, 4 và 8U/25ul phản ứng. Các mũi tên chỉ ra các vị trí của các sản phẩm khuyếch đại hoàn hảo. Nồng độ enzyme phù hợp nhất vào khoảng 1-2U/25ul phản ứng. b. Nguồn enzyme. Phản ứng multiplex PCR của hỗn hợp Y-4 trong đệm PCR 1.6x sử dụng Taq polymerase từ 5 nguồn. Băng 4* chỉ ra các sản phẩm thu được khi enzyme ở băng 4 được sử dụng trong đệm cung cấp bởi người bán. Một sản phẩm không đặc hiệu xuất hiện. c. Sử dụng các hoá chất phụ trợ. Phản ứng multiplex PCR so sánh sử dụng các hỗn hợp mồi đặc hiệu của NST Y với 5% DMSO (kí hiệu D) và không có DMSO, trong đệm 1x. Các locus sY151 và sY88 từ hỗn hợp Y-1 D (các mũi tên chéo) mạnh hơn khi không sử dụng DMSO. Tuy nhiên DMSO hỗ trợ việc khuyếch đại locus sY81 trong hỗn hợp Y-2 (các mũi tên đứng) và locus sY95 trong hỗn hợp Y-4. d. Phân tách trên gel PAA không biến tính. Phản ứng PCR khuyếch đại đồng thời các locus D12S93 và D12S349 được tién hành trên ADN hệ gen từ hai dòng tế bào chuột-người. GM 10868 (A) và GM 12072 (B), mỗi loại chứa một bản sao chép khác nhau của NST 12 ở người, và dạng kết hợp của chúng (A+B). Mặc dầu trong băng A và B, mỗi locus nên chỉ đưa ra một dạng allen (ví dụ: 1 băng), trên gel polyacrylamide không biến tính, mỗi sản phẩm trong 2 sản phẩm mong đợi (các mũi tên) được chạy cùng với sản phẩm khác cái mà chạy chậm hơn trên bản gel này (các băng chéo). Một dạng tương tự vẫn còn tồn tại ở băng A+B. Các băng đánh số 1 và 2 chỉ ra sự phân chia các sản phẩm khuyếch đại của hỗn hợp 12-1 (bao gồm 8 locus đa hình D12S, số lượng các locus này được chỉ ra ở mặt bên trái của Pan-el e) trên hai khuôn ADN khác nhau. e. Các gel PAA biến tính. Phân tách gel giải trình tự của các sản phẩm khuyếch đại tương tự như trong hình 4e, sau phản ứng PCR “nóng”. Băng A và B chỉ ra sự khuyếch đại các allen đơn của các locus đa hình tương ứng (D12S93 và D12S349). Băng A+B chỉ ra sự khuyếch đại đồng thời của cả hai allen tại mỗi locus. Băng 1 và 2 chỉ ra các kết quả sử dụng hỗn hợp mồi 12-1 trên hai ADN hệ gen người khác nhau, với sự đa hình được phát hiện ở một vài locus. Băng 3 chỉ ra các kết quả sau khi phản ứng multiplex PCR với hỗn hợp mồi 12-1 tiến hành trên ADN từ dòng tế bào lai GM 10868 thu được sự [...]...khuyếch đại đồng hợp trên tất cả các locus được kiểm tra Các số ở bên trái hình này chỉ các locus D12S được kiểm tra./ Tài liệu tham khảo 1 Abbs, S and M Bobrow 1992 Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin... Ranier and C.T Caskey 1990 Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, p 272-281 InM.A Innis, D.H Gelfand, J.J Sninsky and T.J White (Eds.), PCR Protocols A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego 6 Chamberlain, J.S., R.A Gibbs, J.E Ranier, P.N Nguyen and C.T Caskey 1988 Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification... detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies Am J Med Genet 48:200-208 11 Mutirangura, A., F Greenberg, M.G Butler, S Malcolm, R.D Nicholls, A Chakravarti and D.H Ledbetter 1993 Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the PraderWilli/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy Hum Mol Genet 2:143-151 12 Saiki, R.K 1989 Optimization... Stern and B.L Handelin 1993 Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis Hum Mol Genet 2:153-158 15 Vandenvelde, C., M Verstraete and D Van Beers 1990 Fast multiplex polymerase chain reaction on boiled clinical samples for rapid viral diagnosis J Virol Methods 30:215-227 16 Vogt, P.H., A Edelmann, S Kirsch, O Henegariu, P Hirschmann, P Kiesewetter, F.M Kửhn, . Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quy t định và quy trình từng bước O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt 1 Trường Đại học Indiana (Indianapolis, IN, USA) và. của hỗn hợp phản ứng Y-1, Y-3* và Y-4 ở quy trình A cao hơn rõ rệt. Thêm vào đó, ở quy trình B, một số sản phẩm chính không xuất hiện (đối với hỗn hợp Y-1 và Y-2) và xuất hiện các sản phẩm. AFM122xf6 D12S85 105-125 n.a. = locus không chỉ định; PM = khu vực promoter Bảng 2. Các điều kiện chu trình nhiệt /Các quy trình PCR Quy trình A Quy trình B Quy trình C Tiền biến tính 94 0 C, 4 phút