Nghiên cứu được thực hiện để khảo sát sự hiện diện và số lượng streptococci và streptoccocus mutans trong nước bọt và tìm hiểu mối liên quan giữa số lượng vi khuẩn và tình trạng sâu răng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 TÌNH TRẠNG SÂU RĂNG VÀ STREPTOCCOCUS MUTANS TRONG NƯỚC BỌT HỌC SINH Trần Thu Thủy*, Haruo Nakagaki** TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu thực để khảo sát diện số lượng streptococci Streptoccocus mutans nước bọt tìm hiểu mối liên quan số lượng vi khuẩn tình trạng sâu Phương pháp: Mẫu nước bọt kích thích thu thập từ học sinh lớp trường tiểu học Huỳnh Kiến Hoa quận 5, thành phố Hồ Chí Minh Đánh giá tình trạng sâu số smt-r (WHO, 1997) DNA vi khuẩn nước bọt phân ly chiết lọc DNA QIAam DNA Mini Kit (Qiagen) DNA toàn vi khuẩn, streptococci Streptoccocus mutans định lượng Taqman TaqMan real-time PCR (7900HT, Applied Biosystems) chuyển đổi sang số lượng vi khuẩn/ml nước bọt Kết quả: Kết cho thấy số lượng vi khuẩn cá thể giao động biên độ rộng Khơng có khác biệt có ý nghĩa số lượng toàn vi khuẩn, số lượng liên cầu khuẩn tỷ lệ liên cầu khuẩn nhóm khơng sâu (n=28, smt-t=0) với nhóm có bị sâu (n=66, smt-t≥1) Có mẫu nước bọt khơng phát diện S.mutans với giới hạn định lượng 20 tế bào vi khuẩn hỗn hợp phản ứng PCR Số lượng trung bình S.mutans (tế bào/ml nước bọt) nhóm khơng sâu 8,5x105 (SD 13,2x105) nhóm sâu 1,28x107 (SD 2,61x107) Có khác biệt có ý nghĩa hai nhóm số lượng S.mutans tỷ lệ S.mutans tổng số vi khuẩn tổng số liên cầu khuẩn (Mann-Whitney test, p=0,00) Kết cho thấy có mối liên quan thuận số smt-t với số lượng S.mutans (r=0,517) tỷ lệ S.mutans tổng số vi khuẩn (r=0,550) tổng số streptococci (r=0,589) (Spearman’ rank test, p=0,00) Kết luận: Các kết gợi ý kết hợp vi khuẩn S.mutans tình trạng sâu dân số nghiên cứu Từ khóa: Streptoccocus mutans, sâu răng, nước bọt ABSTRACT CARIES EXPERIENCE AND STREPTOCOCCUS MUTANS IN SALIVA OF VIETNAMESE SCHOOLCHILDREN Tran Thu Thuy, H Nakagaki* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 318 - 322 Objective: The aim of this study was to quantify oral streptococci and Streptococcus mutans in saliva and to evaluate the association of the amounts of bacteria with caries experience Methods: 94 6-year-old schoolchildren in Ho Chi Minh City, Vietnam, were examined for caries status (dmf-t, WHO 1997) and stimulated saliva samples were collected Genomic bacterial DNA was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) The DNA level of total bacteria, oral streptococci and S.mutans were quantified using TaqMan real-time PCR (7900HT, Applied Biosystems) with absolute standard curve method and converted to bacterial cells/ml saliva Results: The results showed that the levels of bacteria varied widely among subjects There was no * Khoa Răng hàm Mặt ĐH Y Dược Tp.HCM, ** Trường Nha, ĐH Aichi-Gakuin, Nagoya, Nhật Bản Tác giả liên hệ: Trần Thu Thủy, ĐT: 0913115959, Email: tranthuthuyrhm@yahoo.com 318 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học significant difference in the number of total bacteria, oral streptococci and the proportion of oral streptococci between caries free (n=28, dmf-t=0) and caries group (n=66, dmf-t≥1) S.mutans was not detected in saliva of subjects with a detection limit of approximately 20 bacterial cells in the PCR reaction mixture The mean amount of S.mutans (cells/ml saliva) in caries free and caries group was 8.5x105 (SD 13.2x105) and 1.28x107 (SD 2.61x107), respectively Significant difference was found between caries free and caries subjects in both the number and the proportion of S.mutans to total bacteria and to oral streptococci (Mann-Whitney test, p=0.00) There was a positive correlation of dmf-t with both the number of S.mutans (r=0.517) and the proportion of S.mutans to total bacteria (r=0.550) and to oral streptococci (r=0.589) (Spearman’ rank test, p=0.00) Conclusion: The results suggested that S.mutans seems to be associated with caries experience in the studied population Key words: Dental caries, Streptoccocus mutans, saliva chuyên biệt, tương đối nhanh với độ nhạy cao để ĐẶT VẤN ĐỀ nhận diện định lượng xác vi khuẩn so Tỷ lệ sâu mức độ trầm trọng với phương pháp cấy khuẩn kinh điển(3) sâu giảm đáng kể thập kỷ Ứng dụng tiện ích Real-time PCR, để gần đây, đặc biệt nước cơng nghiệp hóa hiểu rõ quần thể vi khuẩn miệng Bất chấp tiến nha khoa phòng ngừa chúng tơi thực nghiên cứu nhằm khảo áp dụng dựa tảng sâu sát diện số lượng streptococci bệnh đa yếu tố, sâu Streptoccocus mutans nước bọt tìm hiểu bệnh phổ biến với tồn mối liên quan số lượng vi khuẩn với tình nhóm sâu cao trạng sâu Streptococcus mutans cho vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU chủ yếu gây bệnh sâu khả sinh acid chịu đựng môi trường acid Mẫu nghiên cứu Nhưng có nhiều loại vi khuẩn khác Mẫu nước bọt nghiên cứu thu thập từ miệng tạo acid chịu đựng học sinh lớp trường tiểu học Huỳnh Kiến Hoa, acid Kết nghiên cứu vi khuẩn học quận 5, thành phố Hồ Chí Minh, học gần cho thấy Streptococci non-mutans sinh phụ huynh đồng ý cho tham gia đóng vai trò quan trọng bệnh sâu chương trình nha học đường Học sinh răng(2) Một số nghiên cứu cho thấy kết hợp khám ghi nhận tình trạng sâu theo số lượng mật độ Streptococci mutans hướng dẫn WHO (1997) Để thu thập mẫu với tình trạng sâu Một số khác lại báo nước bọt, học sinh hướng dẫn nhai viên cáo sâu xảy mà khơng cần có paraffin đùn nước bọt ly thu thập diện S mutans cá thể có mức độ S vòng phút Với mẫu, 1ml nước bọt mutans cao khơng thiết bị sâu răng(1) Vì hút chuyển sang eppendorf polypropylene thông tin chi tiết số lượng thành tube 2ml (loại chuyên biệt cho PCR), bảo quản phần vi khuẩn miệng có liên quan đến đá chuyển sang tủ đơng -20°C bệnh sâu đóng góp thêm thơng tin Các mẫu nước bọt sau đơng khơ vai trò vi khuẩn bệnh sâu răng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm phía Nam để bảo nhận diện nhóm nguy cao đóng quản sử dụng cho phân tích góp việc lượng giá nguy sâu Ly trích DNA cá thể Đầu tiên, mẫu nước bọt đông khô rửa Với phát triển lãnh vực sinh học với 1000 µl dung dịch PBS trải qua quy trình phân tử, Real-time PCR cung cấp công cụ Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 319 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 xử lý chuyên biệt dành cho vi khuẩn Gram (+) để đảm bảo ly trích DNA hiệu Cụ thể, thêm vào tuýp chứa mẫu 180 µl dung dịch enzyme (20mM tris-HCl, 2mM EDTA, 1% triton X-100, pH 8; 20mg/ml Lysozyme) µl Mutanolysin (2000U/ml) Hỗn hợp ủ 37°C Sau genome vi khuẩn mẫu tách chiết tinh lọc chiết lọc DNA làm sẵn (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen) theo hướng dẫn nhà sản xuất DNA sau tách đánh giá độ tinh khiết nồng độ spectrophotometer (NanoDrop ND1000, USA) bảo quản -85ºC phân tích Bảng 1: PCR primer TaqMan probe Real time PCR định lượng vi khuẩn Kết định lượng DNA mẫu chuyển đổi sang số lượng tế bào vi khuẩn/ml nước bọt theo cách tính tốn Kuboniwa(4), dựa số liệu kích thước genome mutans streptococci tương đương 2,6 fg DNA, tương tự S.mitis 2,31fg DNA DNA toàn loại vi khuẩn (Uni) mẫu nước bọt, streptococci (Strep) S.mutans (Smu) định lượng TaqMan Real-time PCR (7900HT Fast Real-time PCR, Applied Biosystems) với phương pháp tính tốn trực tiếp từ nồng độ chuẩn Với PCR định lượng Vi khuẩn chung (Uni) Streptococci (Strep) S mutans (Smu) Primer Probe 5’-CGC TAG TAA TCG TGG ATC AGA ATG-3’ 5’-TGT GAC GGG CGG TGT GTA-3’ 5’- FAM-CAC GGT GAA TAC GTT CCC GGG C-TAMRA -3’ 5’- AGA TGG ACC TGC GTT GTA TTA GCT -3’ 5’- TAC TGC TGC CTC CCG TAG GA -3’ 5’- FAM-CAC ACT GGG ACT GAG ACA CGG CCC-TAMRA -3’ 5’-GCC TAC AGC TCA GAG ATG CTA TTC T-3’ 5’-GCC ATA CAC CAC TCA TGA ATT GA-3’ 5’-FAM-TGG AAA TGA CGG TCG CCG TTA TGA A-TAMRA -3’ Xử lý thống kê ATCC 25175 Nồng độ DNA chuẩn cho định Sử dụng kiểm định Mann-Whitney để so sánh số lượng tỷ lệ vi khuẩn nhóm, kiểm định Spearman’ rank để khảo sát mối liên quan tình trạng sâu lượng vi khuẩn lượng toàn vi khuẩn 3,5 - 0,14ng, tỷ lệ pha KẾT QUẢ loãng 1/5 Nồng độ DNA chuẩn cho định lượng Tổng cộng phân tích vi khuẩn 94 mẫu nước bọt, có 28 mẫu từ học sinh không bị sâu 66 mẫu học sinh có sâu Số trung bình smt-r nhóm sâu 5,3 ± 3,3 (trung bình ± độ lệch chuẩn), với biên độ - 13 sâu/cá thể toàn vi khuẩn streptococci, DNA ly trích từ S.mitis GTC 1101 dùng để làm chuẩn Với định lượng S.mutans chuẩn DNA S.mutans streptococci 12,8-12,8x10-4ng, cho S.mutans 4,5-4,5x10-5ng với tỷ lệ pha loãng 1/10 Các cặp primer TaqMan Probe sử dụng nghiên cứu mô tả nghiên cứu trước(6) (Bảng 1) đặt hàng Applied Biosystems sản xuất Mỗi phản ứng PCR thực với tổng thể tích 25 µl gồm 12,5 µl Master Mix, 500 nM cho primer, 200 nM probe, µl DNA ly trích từ mẫu/DNA chuẩn Định lượng PCR thực lặp lần cho tất DNA chuẩn mẫu Phản ứng PCR thực theo quy trình: 50ºC phút, 95ºC 10 phút 60 chu kỳ 95ºC 15 giây 58ºC phút 320 Mật độ vi khuẩn nước bọt thay đổi lớn cá thể nghiên cứu Bảng trình bày số lượng vi khuẩn mẫu nghiên cứu Khơng có khác biệt có ý nghĩa số lượng tồn vi khuẩn, số lượng streptococci tỷ lệ streptococci nhóm khơng sâu với nhóm có bị sâu Có mẫu nước bọt không phát diện S.mutans Tỷ lệ diện S.mutans nhóm khơng sâu Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 85,7% (24/28), nhóm sâu 94,1% (65/66) Bảng trình bày tỷ lệ streptococci S.mutans nước bọt Có khác biệt có ý nghĩa hai nhóm số lượng S.mutans tỷ lệ S.mutans tổng số vi khuẩn tổng số streptococci (Mann-Whitney test, p=0,00) Bảng 2: Số trung bình vi khuẩn nước bọt Vi khuẩn (tế bào/ml) Uni Strep Smu* Không sâu (TB ± ðLC) 8 4,87x10 ±3,78x10 8 1,69x10 ±1,44x10 5 8,50x10 ±13,2 x10 Sâu (TB ± ðLC) 8 5,04x10 ±3,46x10 8 1,89x10 ±1,66x10 7 1,28x10 ±2,61x10 *: Kiểm định Mann-Whitney p=0,00 Bảng 3: Tỷ lệ streptococci S.mutans Vi khuẩn (%) Strep/Uni Smu/Uni* Smu/Strep* Không sâu (TB ± ðLC) 35,21 ± 14,00 0,24 ± 0,42 0,62 ± 1,00 Sâu (TB ± ðLC) 33,50 ± 15,91 2,18 ± 3,96 5,78 ± 8,57 *: Kiểm định Mann-Whitney p=0,00 Có mối liên quan thuận số smt-r với số lượng S.mutans (r = 0,517) tỷ lệ S.mutans tổng số vi khuẩn (r = 0,550) tổng số streptococci (r = 0,589) (Spearman’ rank test, p = 0,00) BÀN LUẬN Sâu bệnh đa yếu tố, hệ mối tương tác vi khuẩn miệng, chế độ ăn, hàm môi trường miệng(5) Về mặt vi khuẩn, S.mutans vi khuẩn nhóm có kết hợp với sâu thường phân lập Vì S.mutans coi dấu hiệu gợi ý có giá trị bệnh sâu răng, không thiết yếu tố bệnh căn(1) Số liệu nghiên cứu đưa nhận xét tương tự với việc nhận diện S.mutans 85% cá thể nhóm khơng sâu gần 95% cá thể nhóm sâu răng, tương tự với kết tác giả khác Hơn kết nghiên cứu cho thấy có khác biệt số lượng S.mutans tỷ lệ vi khuẩn tổng số vi khuẩn miệng tổng số streptococci miệng Kết cho thấy vai trò quan trọng mật độ/số lượng vi khuẩn môi trường miệng, Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học gợi ý chiến lược dự phòng sâu nhắm vào việc giảm số lượng vi khuẩn mơi trường miệng Nhóm lứa tuổi học sinh tiểu học, - 12 tuổi, nhóm tuổi đặc trưng tăng trưởng phát triển Đây giai đoạn hàm hỗn hợp, có nhiều thay đổi tác động đến tình trạng sâu rụng sữa mọc vĩnh viễn, thay đổi chế độ ăn Về tự nhiên, giai đoạn mọc từ lúc bắt đầu nhú vào xoang miệng đạt đến vị trí chức giai đoạn thử thách lớn, nguy sâu cao Tình trạng sâu qua sữa (thể qua số smt-r), theo báo cáo trước, dấu hiệu gợi ý có giá trị việc đánh giá nguy cơ, tiên lượng sâu tương lai Nghiên cứu thực học sinh lớp 1, lớp giai đọan tiểu học, bắt đầu chăm sóc miệng thơng qua chương trình nha học đường nên số liệu thu giúp ích thiết thực cho việc hoạch định kế hoạch, nhận diện nhóm nguy cao, hướng tới chương trình phòng ngừa đạt hiệu cao giảm thiểu chi phí Sự kết hợp tình trạng sâu (chỉ số smt-r) với số lượng tỷ lệ vi khuẩn S.mutans tổng số vi khuẩn nước bọt kết nghiên cứu phù hợp báo cáo số tác giả, tái khẳng định ảnh hưởng trình trạng sâu qua tới nguy sâu khả sâu tới Sâu răng, biết, kết tương tác đa yếu tố Khía cạnh vi khuẩn với yếu tố khác góp phần xây dựng chương trình sàng lọc chăm sóc phòng ngừa sâu răng, gia tăng sức khỏe miệng Kết nghiên cứu gợi ý việc kiểm soát vi khuẩn miệng đặc biệt S.mutans góp phần phòng ngừa sâu đáng kể Tuy nhiên cần có nhiều nghiên cứu lãnh vực KẾT LUẬN Các kết gợi ý kết hợp vi khuẩn S.mutans tình trạng sâu dân số nghiên cứu Các chiến lược phòng ngừa sâu 321 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 dựa việc tác động vào vi khuẩn miệng hướng nhiều hứa hẹn TÀI LIỆU THAM KHẢO 322 Beighton D (2005) The complex oral microflora of high-risk individuals and groups and its role in the caries process Community Dent Oral Epidemiol, 33(4): 248-255 Takahashi N, Nyvad B (2008) Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process Caries Res, 42(6): 409-418 Heid CA, StevensJ, Livak KJ, Williams PM (1996) Real-time quantitative PCR Genome Res, 6: 968-994 Kuboniwa M, Amano A, Kirura KR, Sekine S (2004) Quantitative detection of periodontal pathogens using realtime polymerase chain reaction with Taqman probes Oral Microbio Immun, 19: 168-176 Marsh PD (1999) Microbiologic aspects of dental plaque and dental caries Dent Clin North Am, 43(4): 599-614 Yoshida A, Suzuki N, Nakano Y, Kawada M (2003) Development of a 5’Nuclease-Based Real-time PCR Assay for quantitative detection of cariogenic dental pathogens Journal of Clin Microbio, 41: 4438-4441 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt ... (1997) Để thu thập mẫu với tình trạng sâu Một số khác lại báo nước bọt, học sinh hướng dẫn nhai viên cáo sâu xảy mà khơng cần có paraffin đùn nước bọt ly thu thập diện S mutans cá thể có mức độ... dựa tảng sâu sát diện số lượng streptococci bệnh đa yếu tố, sâu Streptoccocus mutans nước bọt tìm hiểu bệnh phổ biến với tồn mối liên quan số lượng vi khuẩn với tình nhóm sâu cao trạng sâu Streptococcus... khơng sâu với nhóm có bị sâu Có mẫu nước bọt khơng phát diện S .mutans Tỷ lệ diện S .mutans nhóm khơng sâu Chun Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 85,7% (24/28), nhóm sâu