Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong Đại hoàng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong Đại hoàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 5 hoạt chất được định lượng gồm 4 hoạt chất là dẫn xuất anthraquinon: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside và sennoside A và 1 hoạt chất nhóm stilben là rhaponticin được định lượng trong nghiên cứu này.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT ANTHRAQUINON VÀ STILBEN TRONG ĐẠI HỒNG BẰNG SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương* TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành định lƣợng đƣợc số hoạt chất anthraquinon stilben Đại hoàng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) hoạt chất đƣợc định lƣợng gồm: hoạt chất dẫn xuất anthraquinon: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside sennoside A hoạt chất nhóm stilben rhaponticin đƣợc định lƣợng nghiên cứu Tiến hành phân tách cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung mơi A (dung dịch 0,05 M axít phosphoric nƣớc) dung mơi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút Chƣơng trình rửa giải gồm: - phút (20% B); 18 phút (28% B); 25 phút (42% B); 30 phút (100% B) cho kết tách tốt Thẩm định phƣơng pháp cho kết độ tuyến tính cao (r > 0,9995) độ thu hồi khoảng 98,0 - 102,6% Giới hạn định lƣợng khoảng 0,05 - 0,28 μg/ml Phƣơng pháp đƣợc áp dụng để phân tích 31 mẫu Đại hồng gồm nhiều lồi khác Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều mẫu, hàm lƣợng sennoside, rhaponticin, emodin- glucoside, emodin chrysophanol tƣơng ứng là: 2,53 ± 4,26; 16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 3,72 ± 2,97 mg/g * Từ khóa: Đại hồng; Sắc ký lỏng hiệu cao STUDY ON THE QUANTITATION OF SOME ANTHRAQUINONE AND STILBENE COMPOUNDS IN RHEI RHIZOMA BY HPLC summary We quantitated some anthraquinone and stilben active compounds in Rhei Rhizoma using high performance liquid chromatography Five bioactive compounds were quantitated including anthraquinone: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside and sennoside A and stilbene compound: rhaponticin The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow rate was set at ml/min, gradient condition as followed: - (20% B); 18 (28% B); 25 (42% B); 30 (100% B) gave the satisfied separation The methodological validation gave acceptable linearities (r > 0.9995) and recoveries (ranging from 98.0 - 102.6%) The limits of detection (LOD) of these compounds ranged from 0.05 to 0.28 μg/ml The developed method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples, the contents of sennoside, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin and chrysophanol: 2.53 ± 4.26, 16.40 ± 29.50; 0.58 ± 0.48, 0.93 ± 0.83 and 3.72 ± 2.79 mg/g, respectively * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/03/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/04/2014 Ngày báo đăng: 15/04/2014 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ Đại hoàng (Rhei Rhizoma) nhóm lồi chi, Rheum thuộc họ rau Răm (Polygonaceae) Có lồi chi Rheum đƣợc thức công nhận Dƣợc điển Việt Nam, Hàn Quốc Trung Quốc R tanguticum, R palmatum R officinale [1, 2, 3] Theo Dƣợc điển Nhật Bản, lồi trên, ngƣời ta cơng nhận thêm Rheum coreanum loài lai loài dƣợc liệu Đại hồng [4] Ngồi ra, lồi khơng thức nhƣ Rheum undulatum, Rheum rhaponticum, Rumex crispus, Rumex aquatica Reynoutria elliptica thƣờng bị sử dụng nhầm nhƣ Đại hoàng Trong số trƣờng hợp, việc xác định lồi dựa phân tích mơ học loài mẫu Đại hoàng thị trƣờng khó khăn Các nhà nghiên cứu thầy thuốc đơng y thƣờng bị nhầm lẫn không rõ ràng nhiều loài sử dụng dƣợc liệu Đại hoàng Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa thành phần hoạt chất đóng vai trò quan trọng kiểm sốt chất lƣợng dƣợc liệu Đại hồng Dƣợc liệu Đại hồng có nhiều hoạt chất có tác dụng nhuận tràng, lợi mật, bảo vệ gan, kháng virut, kháng viêm, chống ung thƣ [5, 6, 7] Đó anthraquinone nhƣ: chrysophanol, emodin [8], dianthrone nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ rhaponticin [10] Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp HPLC đƣợc phát triển thẩm định để phân tích hoạt chất chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin sennoside A (hình 1), làm sở để định lƣợng hoạt chất sinh học 31 mẫu Đại hồng từ nhiều nguồn gốc khác Hình 1: Cấu trúc hóa học hoạt chất Đại hoàng: Sennoside A, Rhaponticin, Emodin-glucoside, Emodin, Chrysophanol TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất thiết bị - Hóa chất nguyên liệu: + Hóa chất: chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin sennoside A đƣợc GS Bae Ki Hwan, Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chung Nam, Hàn Quốc cung cấp Xác định độ tinh khiết HPLC khẳng định lại sắc ký lỏng khối phổ; chuẩn nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho HPLC, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích + Mẫu Đại hồng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác Trung Quốc Hàn Quốc (bảng 1), mẫu đƣợc GS Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Dong Guk thẩm định lƣu trữ Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc - Thiết bị: máy HPLC Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Japan) Thực phân tích cột C18 (4,6 x 250 mm, µm, Optimapak, RStech Corp, Korea) Bảng 1: Danh mục mẫu sử dụng nghiên cứu TÊN KÝ HIỆU TÊN KHOA HỌC MẪU KHOA HỌC 09B1001 R tanguticum 09B1012 R officinale 09B1026 R tanguticum 09B1002 R palmatum 09B1013 R palmatum 09B1027 R tanguticum 09B1003 R palmatum 09B1014 R undulatum 09B1028 R palmatum 09B1004 R palmatum 09B1015 R undulatum 09B1029 R officinale 09B1005 R palmatum 09B1016 R undulatum 09B1030 R undulatum 09B1006 R tanguticum 09B1017 R undulatum 09B2038 R undulatum 09B1007 R tanguticum 09B1021 R palmatum 09B2039 R undulatum 09B1008 R tanguticum 09B1022 R tanguticum 09B2041 R undulatum 09B1009 R officinale 09B1023 R tanguticum 09B2042 R undulatum 09B1010 R officinale 09B1024 R tanguticum 09B1011 R officinale 09B1025 R tanguticum KÝ HIỆU MẪU KÝ HIỆU MẪU TÊN KHOA HỌC Phƣơng pháp nghiên cứu - Điều kiện sắc ký: Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak C18 (250 mm x 4,6 mm; µm) Cơng ty RS Tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát 280 nm; pha động: dung môi A: dung dịch axít phosphoric 0,05 M nƣớc; dung mơi B: acetonitrile; tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm 10 μl TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Với chƣơng trình rửa giải: THỜI GIAN (phút) %A %B 05 80 20 18 80  72 20  28 18  25 72  58 28  42 25  30 58  42  100 30  35  80 100  20 35  40 80 20 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử: + Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol nồng độ 1.000 µg/ml methanol + Mẫu chuẩn: dãy dung dịch chuẩn nồng độ xác chrysophanol (từ - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml), emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml), rhaponticin (2 - 200 µg/ml) sennoside A (0,5 - 50 µg/ml) dung dịch chuẩn nội eugenol (200 µg/ml) methanol + Mẫu thử: cân xác 100 mg bột dƣợc liệu Đại hồng, cho vào bình định mức 10 ml Thêm khoảng ml ethanol 70% 200 μl dung dịch chuẩn nội, bổ sung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu âm 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng ethanol 70%, ly tâm, gạn lấy lớp trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Với điều kiện sắc ký phƣơng pháp xử lý mẫu lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho píc tách rõ ràng, nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu thử Đại hoàng hỗn hợp chuẩn Trên sắc ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu píc sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol sắc ký đồ mẫu chuẩn lần lƣợt 12,25; 13,35; 17,56; 34,42; 36,06 phút (hình 2) Tại thời gian lƣu píc sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol sắc đồ mẫu thử mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc píc, kết quả: phổ mẫu thử mẫu chuẩn trùng khít lên với hệ số phù hợp lần lƣợt 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 0,9994 Chứng tỏ: píc thu đƣợc sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết thành phần khác có mẫu thử khơng ảnh hƣởng đến q trình phân tích chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside,emodin, chrysophanol Kết cho phép tiến hành định tính, định lƣợng - Tính thích hợp hệ thống sắc ký: để đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký, pha mẫu chuẩn theo dẫn Tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện chọn 10 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Bảng 2: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống RSD CỦA THỜI GIAN LƢU RSD CỦA DIỆN TÍCH PÍC SỐ ĐĨA LÝ THUYẾT TRUNG BÌNH HỆ SỐ BẤT ĐỐI TRUNG BÌNH (T) Sennoside A 0,12 0,11 12340 1,10 Rhaponticin 0,14 0,15 13260 1,07 Emodin-glucoside 0,16 0,17 14580 1,11 Emodin 0,18 0,20 14620 1,08 Chrysophanol 0,19 0,22 15146 1,06 HOẠT CHẤT Các điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống HPLC sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol Hình 2: Sắc ký đồ so sánh phổ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b, c): (1): sennoside A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol - Khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lƣợng: 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Tiêm dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác (từ 0,5 - 200 μg/ml), tiến hành sắc ký nhƣ điều kiện mô tả Bảng 3: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng NỒNG ĐỘ (g/ml) PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY r LOD (g/ml) LOQ (g/ml) Sennoside A 0,9 - 50 Y = 0,0023 X - 0,0066 1,0000 0,28 0,94 Rhaponticin 2,0 - 200 Y = 0,0066 X - 0,0039 0,9998 0,15 0,50 Emodin-glucoside 0,5 - 50 Y = 0,0211 X - 0,0045 0,9997 0,05 0,15 Emodin 1,0 - 100 Y = 0,0155 X - 0,0069 0,9997 0,06 0,20 Chrysophanol 2,0 - 200 Y = 0,0061 X - 0,0055 0,9996 0,16 0,50 CHẤT CHUẨN Với khoảng nồng độ sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml, rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodin-glucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 - 200 μg/ml, có tƣơng quan tuyến tính nồng độ tỷ lệ diện tích píc chuẩn/chuẩn nội tƣơng ứng Từ phƣơng trình tuyến tính sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol, cho phép xác định giới hạn phát chất lần lƣợt 0,28; 0,15; 0,05, 0,06 0,16 µg/ml, giới hạn định lƣợng chất tƣơng ứng với chất lần lƣợt 0,94; 0,50; 0,15; 0,20 0,50 µg/ml - Kết phân tích định lƣợng hoạt chất mẫu dƣợc liệu Đại hoàng: Kết khảo sát hàm lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol có 31 mẫu Đại hồng (hình 3) cho thấy: hàm lƣợng cao sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol 16,31; 94,41; 1,81; 3,11 12,64 mg/g dƣợc liệu khô Sennoside A phát đƣợc mẫu Đại hoàng thật gồm loài R tanguticum, R palamtum R officinale; rhaponticin phát đƣợc mẫu R undulatum Hàm lƣợng hoạt chất mẫu Đại hồng biến động nhiều tất mẫu 12 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 4-2014 Hình 3: Kết phân tích hàm lƣợng hoạt chất mẫu Đại hoàng KẾT LUẬN Phƣơng pháp HPLC đơn giản, hiệu đƣợc phát triển thẩm định cho việc định lƣợng đồng thời hoạt chất dƣợc liệu Đại hoàng Kết cho thấy hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều mẫu, hàm lƣợng sennoside, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin chrysophanol tƣơng ứng 2,53 ± 4,26; 16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 3,72 ± 2,79 mg/g TÀI LIỆU THAM KHẢO Dƣợc điển Việt Nam IV 2010 from Ventilago leiocarpa The American Journal of Chinese Medicine 1996, 24, pp.139-142 Kang SC, Lee CM, Choung ES, Bak JP, Bae JJ, Yoo HS, Kwak JH, Zee OP Antiproliferative effects of estrogen receptor modulating compounds isolated from Rheum palmatum Archives Pharmaceutical Researches 2008, 31, pp.722-726 Kashiwada Y, Nonaka GI, Nishioka I Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma) XV Simultaneous determination of phenolic constituents by high-performance liquid chromatography Chemical & Pharmaceutical Bulletin 1989, 37, pp.999-1004 The Japanese Pharmacopoeia 2001 Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K, Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR Comparative study of chemical constituents of rhubarb from different origins Chemical & Pharmaceutical Bulletin 2006, 54, pp.1491-1499 Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J Identification of natural compounds with anti-hepatitis B virus activity from Rheum palmatum L ethanol extract Chemotherapy 2007, 53, pp.320-326 10 Hu C, Ye S, Zhao L, Wang J Effects of five stilbene compounds on NO mediated vasodilation and their structure-activity relationship Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi 2006, 26, pp.826-829 Pharmacopoeia of the People's Republic of China 2005 Korean Pharmacopoeia 2007 Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T, Hattori M Anti-inflammatory effects of emodin 13 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 14 ... lƣợng hoạt chất mẫu Đại hoàng KẾT LUẬN Phƣơng pháp HPLC đơn giản, hiệu đƣợc phát triển thẩm định cho việc định lƣợng đồng thời hoạt chất dƣợc liệu Đại hoàng Kết cho thấy hàm lƣợng hoạt chất biến... Đại hoàng Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa thành phần hoạt chất đóng vai trò quan trọng kiểm sốt chất lƣợng dƣợc liệu Đại hồng Dƣợc liệu Đại hồng có nhiều hoạt chất có tác dụng nhuận tràng,... QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Với điều kiện sắc ký phƣơng pháp xử lý mẫu lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho píc tách rõ ràng, nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu thử Đại hoàng hỗn hợp chuẩn Trên sắc