Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này để giải trình tự và xác định đột biến trên gen mecA, mecI của một số chủng MRSA phân lập trên bệnh nhân tại bệnh viện đa khoa Sóc Trăng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN MECA VÀ MECI Ở MỘT SỐ CHỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐỀ KHÁNG METHICILLIN Bùi Minh Giao Long*, Mạnh Trường Lâm**, Vũ Thanh Thảo***, Trần Cát Đơng*** TĨM TẮT Mở đầu: Khơng phải tất chủng Staphylococcus aureus mang gen mecA có kiểu hình đề kháng methicillin Sự diện gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA tìm thấy số chủng Các đột biến hai gen ảnh hưởng kiểu hình đề kháng, cần phải xác định để giải thích rõ chế đề kháng vi khuẩn Mục tiêu: Giải trình tự xác định đột biến gen mecA, mecI số chủng MRSA phân lập bệnh nhân bệnh viện đa khoa Sóc Trăng Phương pháp: Phân lập định danh chủng S.aureus phương pháp thường quy bệnh viện Thử nghiệm kháng sinh đồ với oxacillin để xác định kiểu hình đề kháng Chiết tách ADN, thực PCR với cặp mồi mecA mecI Giải trình tự sản phẩm PCR Dùng phần mềm ClusterX 2.0.1 để phát đột biến cách so sánh với trình tự chủng chuẩn Kết quả: Phân lập 33 chủng S aureus có 10 chủng có kiểu hình đề kháng PCR dương tính với mecA, 23 chủng lại nhạy cảm với oxacillin PCR âm tính với mecA Trong số 10 chủng mang gen mecA, xác định chủng mang gen mecI Xác định đột biến gen mecA chủng (7, 16, 28 30) Chỉ xác định đột biến gen mecI chủng (28) Các dạng đột biến đột biến điểm chưa thấy công bố trước ngoại trừ dạng đột biến gen mecI Kết luận: Tất chủng MRSA có kiểu hình đề kháng mang gen mecA Các đột biến xác định gen mecA mecI không làm thay đổi kiểu hình Từ khóa: MRSA, mecA, mecI, đột biến, đề kháng kháng sinh ABSTRACT MUTATIONS IN mecA AND mecI GENES OF SOME MRSA STRAINS (METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS) Bui Minh Giao Long, Manh Truong Lam, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 170 - 174 Background: Not all mecA-positive Staphylococcus aureus strains have phenotypic resistance to methicillin The presence of mecI coding for mecA repressor was found in some strains Mutations in both genes may affect phenotypes, therefore to understand more thoroughly about the resistance mechanism these mutations need to be identified Objectives: Sequencing and identifying mutations in mecA and mecI genes of some MRSA strains isolated from patients in Hospital of Soctrang Province Methods: S aureus strains were isolated and identified by using the routine methods of hospital Oxacillin disk agar diffusion was used to screen for strains having the resistance phenotype DNA of theses strains was extracted and used as templates for PCR The PCR products were sequenced The ClusterX 2.0.1.1 software was used to detect genetic mutation by aligning the sequences of examined genes with those of the control strain Bộ môn Dược Lâm Sàng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Khoa Dược, Bệnh viện Đa khoa Sóc Trăng *** Phòng thí nghiệm Vi Sinh Cơng Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Cát Đông ĐT: 08 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com * ** 170 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Results: 33 strains of S aureus were isolated and identified, among them, there were 10 strains having both phenotypic and genotypic resistance The 23 others were sensitive to oxacillin and mecA negative as well Mutations in mecA were found in strains (7, 16, 28 and 30) only one mecI mutation was identified in one strain (28) These mutations are point mutations and have not been reported in previously except the mecI mutation Conclusion: In this study, all MRSA phenotypic strains possessed mecA gene Mutations in mecA and mecI genes detected did not change the phenotype Keywords: MRSA, mecA , mecI, mutation, antibiotic resistant Taq polymerase (BioLabs), kit tinh chế sản phẩm ĐẶT VẤN ĐỀ PCR (Wizard SV gel & PCR clean-up system) Hiện nay, Staphylococcus aureus đề kháng (Promega) methicillin (MRSA) nguyên nhân phổ biến Trang thiết bị: máy UV-vis Genquant 1300, nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng tỉ lệ tủ ấm Shellab, máy li tâm Sigma – 18, máy luân tử vong chúng đề kháng với hầu hết kháng nhiệt Techne TC - 3000 G, điện di ngang Biosinh họ β-lactam(11) Cơ chế đề kháng kháng rad Mini-sub cell GT sinh nhóm β-lactam gồm khả sản xuất βPhân lập định danh lactamase vi khuẩn diện Các chủng Staphylococcus aureus phân gen mecA chế đề kháng gen lập từ mẫu bệnh phẩm thời gian từ tháng xem quan trọng nghiên 06/2010 đến tháng 08/2010 Bệnh viện Sóc cứu số tác giả(7,10) Gen mecA mã hóa Trăng định danh phương pháp thường protein gắn kết penicillin 2a (PPB2a) có lực (4,8,9) quy theo quy trình bệnh viện cấy lên giảm với kháng sinh nhóm β-lactam Gen môi trường phân biệt chọn lọc BA nằm nhiễm sắc thể (Blood Agar), MSA (Mannitol Salt Agar) thực điều hòa gen plasmid thuộc phản ứng coagulase transposon Tn-4291 nên gen truyền dễ dàng từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác Điều giải thích lan truyền nhanh chóng chủng MRSA(10) Phương pháp xác định MRSA dựa diện gen mecA xem xác phương pháp xác định kiểu hình khác(3) Tuy nhiên, số nghiên cứu gần cho thấy số chủng mang gen mecA khơng có kiểu hình đề kháng methicillin Sự diện gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA tìm thấy số chủng(5,6,10,12) Các đột biến hai gen làm thay đổi khơng thay đổi kiểu hình đề kháng cần phải xác định để giải thích rõ chế đề kháng vi khuẩn VẬTLIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Hóa chất: đĩa kháng sinh (Nam Khoa), TSA, MHA, MSA, BA, agarose, ethidium bromide (Merck), PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Chuyên Đề Dược Khoa Kháng sinh đồ: Thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp Kirby – Bauer(9), với đĩa giấy kháng sinh Công ty Nam Khoa Hiện nay, methicillin sử dụng độc tính cao nên kháng sinh nhóm oxacillin thay để điều trị dùng cho kháng sinh đồ(1) Hai chủng dùng làm chứng gồm S aureus ATCC 29213 (nhạy methicillin) S aureus ATCC 4330 (MRSA) Đo đường kính vùng ức chế thước kẹp Bất tăng trưởng quan sát bên vùng ức chế chứng tỏ vi khuẩn kháng kháng sinh Kết biện giải theo M100-S18 CLSI (1) Chiết tách ADN thực PCR Chiết tách ADN theo qui trình chiết tách chung cho vi khuẩn Gram dương Cutting S cs(2) Sau đó, thực PCR khuếch đại đoạn gen với mồi đặc hiệu trình bày Bảng 171 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Bảng Các cặp mồi phản ứng PCR gồm mồi xuôi (F) mồi ngược (R) Tên mồi MecA-F2 MecA-R2 mecI-F mecI-R Trình tự mồi tự thiết kế ( 5’ đến 3’) AGT TGT AGT TGT GGG GTT TGG CGT ATT TTT TAT TAC CGT TTCTC AAT GGC GAA AAA GCA CAA CA GAC TTG ATT GTT TCC TCT GTT Kích thước sản phẩm khuếch đại 2000 bp 481 bp mecI với gen tương ứng chủng S.aureus N315 phần mềm ClustalX 2.0.11 Phản ứng PCR thể tích 25 µl có thành phần gồm 0,5 µl ADN trộn với 2,5 µl đệm PCR 10 X, 0,25 µl dNTP 25 mM, 0,25 µl mồi xi mồi ngược với nồng độ 100 µM 0,2 µl Taq ADN polymerase U/ µl nước khử khống vừa đủ Thực chương trình PCR gồm 95°C phút, 45°C 45 giây, 72 °C 2,5 phút, lập lại 35 chu kì Sản phẩm khuếch đại chạy điện di gel agarose 1% điện 100V 15 phút, đọc kết phương pháp nhuộm ethidium bromide xem ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Sau đó, tinh chế sản phẩm PCR cột Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System theo hướng dẫn nhà sản xuất KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Có 10 chủng số 33 chủng S aureus có mang gen đề kháng mecA gồm chủng 7, 9, 10, 16, 19, 20, 25, 28, 30 32 Các chủng tiếp tục thực PCR để xác định gen mecI Kết cho thấy có 4/10 chủng mang gen mecI Nghiên cứu Timothy M.A Weller cho thấy tỉ lệ mang gen mecI cao với 48% (12) Chủng đối chứng S aureus ATCC 43300 (MRSA) cho kết dương tính với gen mecA âm tính với gen mecI Kết trình bày Bảng Bảng2 Kết xác định gen mecA mecI Chủng 10 16 19 20 25 28 30 32 MRSA 43300 Giải trình tự phân tích kết Sản phẩm PCR gen mecA, mecI diện chủng S aureus khảo sát giải trình tự dịch vụ cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) với mồi tương ứng (xem Bảng 1) Các kết gửi lắp ráp thành đoạn gen hồn chỉnh chương trình SeqMan phần mềm Lasergene v 7.1 Đột biến xác định thực cách so sánh đoạn gen mecA mecA + + + + + + + + + + + Mẫu T 10 16 19 20 mecI + + + + - Mẫu 25 28 30 T 32 C 10 16 19 20 25 28 30 32 481bp 2kb b a Hình Kết PCR gen mecA (a) gen mecI (b) chủng S aureus khảo sát T: thang 1kb, C: chứng MRSA 172 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Giải trình tự phân tích kết Nghiên cứu Y học cách sử dụng phần mềm ClustalX 2.0.11 Kết trình bày Bảng Các trình tự hồn chỉnh so sánh với trình tự gen mecI, mecA chủng S aureus N315 Bảng Kết xác định đột biến chủng S aureus khảo sát Chủng 28 7, 16, 28 30 30 Gen mecI mecA mecA Loại đột biến Đột biến thay C Ỉ T nucleotid 202 Đột biến thay C Ỉ A nucleotid 75 Đột biến thay T Ỉ G nucleotid 150 Đột biến thay A Ỉ G nucleotid 242 Hậu Tạo ba kết thúc TAA Làm TCC Ỉ TCA mã hóa cho serin Làm ATA Ỉ AGA chuyển isoleucin thành asparagin CAG Æ CGG chuyển glycin thành asparagin A Đột biến thay C Ỉ T nucleotid 202 gen mecI chủng 28 B Đột biến thay C Ỉ A nucleotid 75 gen mecA chủng 7, 16, 28 30 C Đột biến thay T Æ G nucleotid 150, A Æ G nucleotid 242 mecA chủng 30 Hình Kết xác định đột biến chủng S aureus khảo sát phần mềm ClustalX 2.0.11 Trong chủng mang gen mecI có Theo kết trên, chủng 7, 16 28 chủng (28) có đột biến xác định Trên lý có đột biến điểm dạng không làm thuyết chủng mang gen mecI khơng có thay đổi acid amin dịch mã Chủng 30 có kiểu hình đề kháng mecI mã hóa cho chất chế đến đột biến điểm gồm dạng giống chủng ức chế hoạt động mecA nên không biểu dạng khác làm thay đổi acid amin thành PBP2a Tuy nhiên, chủng dịch mã Như vậy, chủng có đột biến mecA theo thử nghiệm kháng sinh đồ thể dù làm thay đổi hay không làm thay đổi acid amin dịch mã biểu thành kiểu hình đề kháng Ở chủng 28, đột biến mecI dẫn đến việc tạo ba kết thúc làm cho kiểu hình đề kháng Nói cách khác, đột biến mecI khơng khả tác động ức chế hoạt không ảnh hưởng đến đề kháng động mecA Do đó, chủng biểu chủng Một số nghiên cứu Nobumichi kiểu hình đề kháng Đột biến cs.(5) đột biến mecA không xác định nghiên cứu trước tìm thấy dạng tương tự dạng xác Nobumichi cs.(5) định nghiên cứu Chuyên Đề Dược Khoa 173 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Tuy nhiên, chủng mang gen mecI lại chủng số 7, 30 32 lại không xác định đột biến mecI Trong đó, chủng 30 xác định mang đột biến gen mecA làm thay đổi acid amin, chủng mang đột biến không làm thay đổi acid amin chủng 32 khơng có đột biến (xem Bảng 3) Có nhiều giả thuyết kết này, chủng 30, đột biến gen mecA giúp cho gen tránh ức chế mecI Đối với chủng chủng 32, giả thuyết khác dùng để lý giải hoạt động gen điều hòa khác gen mecR1 với vai trò cảm ứng hoạt động gen mecA, trái ngược với mecI Hầu chủng MRSA mang gen mecA có mang gen mecR1 (95%)(12) Trong trường hợp này, gen mecR1 làm gia tăng hoạt động cảm ứng gen mecA để bù lại ức chế gen mecI Cần nghiên cứu thêm đột biến gen để có kết luận xác KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, tất chủng có kiểu hình đề kháng mang gen mecA, cho thấy có liên hệ kiểu gen kiểu hình đề kháng rõ ràng Những đột biến xác định gen mecA mecI không làm thay đổi kiểu hình Cần tiếp tục nghiên cứu số lượng mẫu lớn để xác định liên quan kiểu hình kiểu gen đề kháng đột biến gen mecA , mecI mecR1 để hiểu rõ chế đề kháng methicillin vi khuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO 174 10 11 12 Cutting S M and Horn P B V (1990) Genetic Analysis Molecular Biological Methods for Bacillus C R Harwood and S M Cutting Chichester, England, John Wiley & Sons Ltd: 27-74 Dominguez MA, Linares J, Martin R (1997) Molecular mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus Microbiologia; 13: 301-8 Gerberding JL, Miick C, Liu HH, Chambers HF (1991) Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother; 35: 2574-79 Kobayashi N., Taniguchi K., and Urasawa S (1998), Analysis of diversity of mutations in the mecI gene and mecA promoter/operator region of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, Antimicrobial Agents And Chemotherapy, p 717–720, Vol 42, No.3 Lewis RA and Dyke KGH, MecI represses synthesis from the β-lactamase operon of Staphylococcus aureus J Antimicrob Chemother (2000) 45(2): 139-144 McCallum N et al (2010) Regulation of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus International Journal of Medical Microbiology 300: 118–129 121 Murakami, K., Minadime W., Wanda K., Nakamura E., Teraoka H., and Watanabee S (1991) Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction J Clin Microbiol 29:2240-2244 Patrick R Murray, Michael A Pfaller, Ellen Jo Baron, et al (1999), "Manual of clinical microbiology", American Society Microbiology Publisher:pp.172, 292-293 Sharma VK, Hackbarth CJ, Dickinson TM, Archer GL., (1998 ) Interaction of native and mutant MecI repressors with sequences that regulate mecA, the gene encoding penicillin binding protein 2a in methicillin-resistant staphylococci J Bacteriol Apr;180(8):2160-6 Voss A., Doebbeling N.B (1995) The worldwide prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus International Journal of Antimicrobial Agents 5:101-106 Weller M.A.T (1999) The distribution of mecA, mecR1 and mecI and sequence analysis of mecI and the mec promoter region in staphylococci expressing resistance to methicillin Journal of Antimicrobial Chemotherapy 43: 15–22 CLSI (2008) Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; 18th Informational Supplement M100S18 28 (1): 46-53 Chuyên Đề Dược Khoa ... hình đề kháng Nói cách khác, đột biến mecI khơng khả tác động ức chế hoạt không ảnh hưởng đến đề kháng động mecA Do đó, chủng biểu chủng Một số nghiên cứu Nobumichi kiểu hình đề kháng Đột biến. .. Kết xác định đột biến chủng S aureus khảo sát phần mềm ClustalX 2.0.11 Trong chủng mang gen mecI có Theo kết trên, chủng 7, 16 28 chủng (28) có đột biến xác định Trên lý có đột biến điểm dạng... nhiên, số nghiên cứu gần cho thấy số chủng mang gen mecA khơng có kiểu hình đề kháng methicillin Sự diện gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA tìm thấy số chủng( 5,6,10,12) Các đột biến