Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

Bài viết Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập trình bày nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết. Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu,... Mời các bạn cùng tham khảo.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN CÁC ĐIỂM ĐỘT BIẾN TRÊN GEN GYRA VÀ PARC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU PHÂN LẬP Lê Văn Hưng Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh giải thích chế đề kháng vi khuẩn lậu cần thiết Tiến hành giải trình tự gen 71 chủng vi khuẩn lậu phân lập từ bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin vi khuẩn lậu Kết cho thấy chủng nhạy cảm có nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentratation - MIC) 0,002 - 0,060 µg/ml khơng có đột biến gen Các chủng có MIC cao xuất nhiều đột biến gen gyrA parC Trên gen gyrA: 100% số chủng có đột biến codon 91 (Ser thành Phe) 63,8% số chủng có đột biến codon 95 (Asp thành Ala), đột biến vị trí khác có tần số thấp Trên gen parC: 44,9% số chủng có đột biến codon 87 (Ser thành Asn) Đột biến codon 86 91 xuất với tần số thấp Từ khóa: vi khuẩn lậu, kháng kháng sinh, ciprofloxacin, đột biến gen I ĐẶT VẤN ĐỀ Ciprofloxacin kháng sinh định điều trị bệnh lậu với liều uống (500 mg), kháng sinh thầy thuốc bệnh nhân ưa chuộng Do đó, việc lạm dụng kháng sinh dẫn tới tốc độ đề kháng tăng nhanh khơng có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin trở thành kháng sinh khơng có tác dụng vi khuẩn lậu thời gian tới Nhiều nghiên cứu nhà khoa học giới Trees D L cộng (1998) Trung tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1], Su X Lind I (2001) Đan Mạch [2] chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin cho thấy: chủng đề kháng với ciprofloxacin có thay đổi gen gyrA gen parC Đó gen có liên quan đến kháng ciprofloxacin Gen gyrA có độ dài Địa liên hệ: Lê Văn Hưng - Bộ môn Da liễu - Trường Đại học Y Hà Nội Email: levanhungvdl@yahoo.com Ngày nhận: 26/03/2013 Ngày chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid; vùng định đề kháng quinolon dài khoảng 279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid Gen parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hố 768 amino acid; vùng định đề kháng quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá 85 amino acid Những nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh, chế đề kháng vi khuẩn lậu cần thiết phải tiến hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu cho cơng tác phòng chống bệnh lây truyền qua đường tình dục nói chung bệnh lậu nói riêng Xuất phát từ lý đề tài nghiên cứu tiến hành nhằm mục tiêu: góp phần tìm hiểu chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin vi khuẩn lậu II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng Trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến 2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám bệnh viện Da liễu Trung ương, phân lập 503 chủng Nghiên cứu chọn ngẫu nhiên 35 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tháng từ tháng năm 2007 đến tháng 12 năm Phương pháp 2007 71 chủng vi khuẩn lậu 3.1 Kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu Vật liệu Nhuộm Gram →Nuôi cấy môi trường Tủ nuôi cấy CO2 Sanyo (Nhật Bản) Môi Thayer - Martin →Test Oxidase Neisseria 4H trường Thayer - Martin, Neisseria 4H, Oxidase → Kết luận: Neisseria gonorrhoear → Tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E - test để xác định MIC vi khuẩn lậu (Mỹ) Thanh giấy E - test (Thụy Điển) Chủng chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp) (bảng 1) Bảng Các đoạn mồi dùng phản ứng PCR giải mã trình tự gen [3] Trình tự mồi (5’ - 3’) Gen Kích thước đoạn gen khuếch đại Mồi xi Mồi ngược CGGCGCGTACTGTACGCGATGCA AATGTCTGCCAGCATTTCATGTGAGA GyrA 279bp Mồi xuôi Mồi ngược ATGCGCGATATGGGTTTGAC GGACAACAGCAATTCCGCAA ParC 255bp Thiết kế 3.2 Quy trình PCR gen gyrA gen parC Sử dụng hóa chất hãng Bio - rad (Hoa Kỳ) với cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy trình PCR gen gyrA gen parC Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 10x (5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl2 50 mM (1,5 3.3 Quy trình giải trình tự gen Quy trình giải trình tự đoạn gen chứa đột biến thực theo quy trình hướng dẫn hãng a Tinh sản phẩm PCR MinElute PCR Purification Kit: Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản ml); Taq polymerase UI/ml (0,5 ml); Dung dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi phẩm PCR, trộn pipet Cho toàn ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml) Tổng thể tích 50 ml dịch vào cột chiết tách Ly tâm 13.000 vòng/ phút phút Hút bỏ phần dịch lọc Thêm - Chu kỳ nhiệt: 93oC phút - [93oC 30 giây - 52oC phút 72 C phút] x 30 chu kì - 72oC phút o - Sản phẩm khuếch đại gen Điện di sản phẩm PCR gel agarose 750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút phút Hút bỏ dịch lọc Ly tâm thêm 20.000 vòng/phút phút Chuyển cột chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml Thêm 20 ml buffer EB vào cột chiết tách Để 1,5% dung dịch đệm TBE 1x Bản thạch sau chạy điện di ngâm dung nhiệt độ phòng phút, sau ly tâm 10.000 vòng/phút Bảo quản -20oC dịch ethidium bromid 0,5 mg/ml 30 phút, b Phản ứng giải trình tự (Sequencing Reaction) rửa qua nước cất Chụp ảnh gel buồng tối ánh sáng cực tím Sản phẩm PCR dùng để giải trình tự 36 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen gyrA gen parC TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ly tâm 14.000 vòng/phút 20 phút Hút bỏ Core Kit: Pha Premix gồm 5X sequencing buffer (4 ml); dNTP mix (1 ml); A dye dịch Thêm 200 ml cồn 70% Ly tâm 14.000 vòng/phút phút Hút bỏ dịch terminator (0,5 ml); C dye terminator (0,5 ml); G dye terminator (0,5 ml); T dye terminator Để khô nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Hồ tan 25 ml final buffer (0,5 ml); AmpliTaq (1 ml) Thành phần phản ứng: Premix 8µl, sản phẩm PCR sau tinh 5µl, mồi 3,2 pmol, nước cất vừa đủ 20µl Chu kỳ nhiệt: 96oC 10 giây – [96oC 10 giây – 50oC giây – 60oC phút] x 25 chu kỳ - 4oC phút c Tinh sản phẩm - Đọc kết máy ABI PRISM 310 hãng Applied Biosystem Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu so sánh với trình tự nucleotide gen gyrA parC chủng vi khuẩn lậu gốc để tìm điểm khác với chủng gốc III KẾT QUẢ Thêm vào 20 ml sản phẩm sequencing: ml KCH3COO 3M pH = 7,0; 14,5 µl nước cất; 62,5 µl cồn 100% Để nhiệt độ phòng 15 phút Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA, parC Hình Kết điện di sản phẩm PCR Hình Kết điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA Giếng 1: chứng âm xác định đoạn gen ParC Giếng 1: chứng âm Giếng 2: chứng dương Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng 2: chứng dương Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng đến 7: kết dương tính Giếng đến 7: kết dương tính TCNCYH 83 (3) - 2013 37 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến) Trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến) IV BÀN LUẬN vậy, MIC có mối liên quan với số lượng vi khuẩn lậu gồm: chủng nhạy cảm 69 đột biến [4] Với MIC nhỏ, mang đột biến MIC lớn mang nhiều đột biến Kết chủng đề kháng Phân tích đột biến gen gyrA parC phối hợp đột tương đồng với nghiên cứu tác giả giới [5, 6, 7] Tuy nhiên, biến gen cho thấy: tất chủng đề kháng có đột biến gen nghiên cứu thu kết khác với tác giả tác giả giới gyrA parC, số lượng đột biến tăng theo nồng độ MIC chủng nhạy cảm MIC chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Nghiên cứu giải trình tự gen 71 chủng 0,002 - 0,060 µg/ml (2,8%) khơng có thay đổi gen gyrA codon 91 (Ser thành Phe) Điều chủng vi khuẩn lậu lây trình tự DNA 11 chủng đề kháng có MIC - µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang đột biến truyền Việt Nam có nguồn gốc từ chủng mang tính khu vực [8] Kết gen gyrA không mang đột biến gen parC chủng đề kháng có MIC - µg/ nghiên cứu thu chứng minh đề kháng vi khuẩn lậu với ml (8,5%) mang đột biến gen gyrA ciprofloxacin, loại thuốc xem liệu parC; 52 chủng đề kháng có MIC - 32 µg/ ml (73,2%) mang đột biến gồm đột biến pháp hàng đầu vào năm 1990, tăng lên nhanh chóng mức MIC cao đáng báo codon 91 (Ser thành Phe) codon 95 (Asp thành Ala) gen gyrA, đột biến động với đột biến vi khuẩn lậu Do giám sát liên tục tính kháng kháng codon 87 (Ser thành Asn) gen parC Như sinh, với khuynh hướng ngày gia tăng 38 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC chủng đa đề kháng lan truyền cộng đồng cần thiết để tránh thất bại điều trị Otero, L., et al (2001) First Isolate of a Neisseria gonorrhoeae Strain Associated With an Ofloxacin Treatment Failure in Spain Sex Transm Dis, 28(10), 576 - 578 V KẾT LUẬN Xu J S., Wang B., Wang C X., et al Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon Đích (2006) Study on fluoroquinolone resistance tác động nhóm kháng sinh ADN gyrase topoisomerase IV vi khuẩn Sự and the relationship between resistance and đột biến vi khuẩn lậu (tại gen gyrA parC làm thay đổi đích kháng sinh, dẫn orrhoeae Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, đến đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin vi khuẩn lậu Shultz T R., Tapsall J W., White P A (2001) Correlation of in vitro susceptibilities to Lời cảm ơn newer quinolones of naturally occurring quino- Xin cảm ơn giúp đỡ chân thành từ PGS.TS Trần Hậu Khang, ThS Trần Mẫn Chu, ThS Phạm Đăng Bảng, PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, CN Ninh Thị Dần, CN Lê Phương Thảo bệnh viện Da liễu Trung ương GS.TS Norihisa Ishii, Viện truyền nhiễm quốc gia, Nhật Bản mutations of gyrA and parC in Neisseria gon27(8), 702 - 704 lone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains with changes in gyrA and parC Antimicrob Agents Chemother, 45(3), 734 - 738 Tanaka M., Nakayama H., Haraoka M., et al (2000) Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high prevalence of ciprofloxacin-resistant solates in Japan, 1993 to 1998 J Clin Microbiol, 38(2), 521 - 525 TÀI LIỆU THAM KHẢO Zhang T., Zhou X., Chen Y., et al Trees D L., Sandul A L., Whittington W L et al (1998) Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacinresistant isolates of Neisseria gonorrhoeae Anti- (2009) Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in gyrA and parC genes in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai, China J Huazhong Univ Sci Technolog microb Agents Chemother, 42(8), 2103 - 2105 Su X., Lind I (2001) Molecular basis of high - level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Denmark Med Sci, 29(1), 29 - 34 from Neisseria 1995 to 1998 Antimicrob Chemother, 45(1), 117 - 123 Agents Chaudhry U., Ray K., Bala M., et al (2002) Mutation patterns in gyrA and parC genes of ciprofloxacin resistant isolates of gonorrhoeae from India Sex Transm Infect, 78(6), 440 - 444 Summary MUTATIONS IN GYRA AND PARC GENES OF NEISSERIA GONORRHOEAE ISOLATED FROM PATIENTS We study the antibiotic resistance and resistance mechanisms of N gonorrhoeae We sequenced a part of gyrA and parC genes of 71 strains from patients admitted at the National Hospital for Dermatology and Venereology with urethral and vaginal discharges to understand the resistance mechanisms to ciprofloxacin Ciprofloxacin-susceptible strains (MIC 0,002-0,060 µg/ TCNCYH 83 (3) - 2013 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ml) had no mutation The number of gyrA and parC mutations were proportional to MIC level The strains had Ser(91)Phe and Asp(95)Ala with the prevalence of 100% and 63.8%, respectively, and lower prevalence at other positions on gyrA On parC, 44.9% of the strains had Ser(87)Asn and lower prevalence at other positions Key words: N gonorrhoeae, antibiotic resistance, ciprofloxacin, gene mutations XÁC ĐỊNH CA BỆNH ẤU TRÙNG SÁN DÂY CHÓ ECHINOCOCCUS ORTLEPPI KÝ SINH Ở PHỔI TẠI VIỆT NAM Nguyễn Văn Đề1, Tạ Chi Phương2, Ngô Thế Quân2 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh nhân nam giới tỉnh Thanh Hóa mổ điều trị bệnh viện Bệnh phổi Quốc gia tháng năm 2013 Trước vào viện tháng, bệnh nhân cảm thấy tức ngực bên phải, không sốt không ho X - quang phổi có khối u bên phổi phải, bạch cầu toan tăng (12,8%) Kết xét nghiệm ELISA dương tính với kháng nguyên Echinococcus Kết phẫu thuật cắt bỏ khổi u thấy kén nước (cyst) có kích thước x cm Trong kén có nhiều đầu sán dây xác định Echinococcus ortleppi hình thái học thẩm định sinh học phân tử (sử dụng gen NADH hydrogenasa 23S rebosome với tương đồng nucleotide với Echinococcus ortleppi GenBank 99,5%) Đây ca bệnh ấu trùng sán dây chó Echinococcus ortleppi, khẳng định bệnh có Việt Nam Từ khóa: phổi, Echinococcus ortleppi, hydatid cyst disease, Việt Nam I ĐẶT VẤN ĐỀ nhiệt đới mà ấu trùng có liên quan đến bệnh dài - mm gồm - đốt, ký sinh ruột non nang nước sán chó (cystic hydatid disease) lưu hành Nam Brazil (Balbinotti et al, 2012) họ chó Trong 20 lồi thuộc giống (chi) Echinococcus, có lồi quan trọng liên quan đến y [1] lần Echinococcus ortleppi (genotype G5) thông báo Italy (Casulli học E granulosus (gây nang nước - cystic echinococcosis) E multilocularis (gây bọc et al, 2008) [2] Ấu trùng sán dây chó ký sinh động vật có vú chó, mèo, gấu, báo, khỉ, Sán dây chó (Echinoccocus) trưởng thành nhiều túi nước - alveolar echinococcosis)[8] Phân tích gen cho thấy Echinococcus granulosus (G1) Echinococcus ortleppi (G5) thể đơn bội Echinococcus granulosus xứ Địa liên hệ: Nguyễn Văn Đề, môn Ký sinh trùng, trường Đại học Y Hà Nội Email: ngvdeyhn@gmail.com Ngày nhận: 26/03/2013 Ngày chấp thuận: 40 người có cừu, dê, bò, lạc đà, hươu động vật gậm nhấm Ấu trùng ký sinh gan hay phủ tạng khác tạo bọc nước lớn chứa nhiều đầu sán, bọc nước thường gan (65%), phổi (10%) số quan khác thận, não Khi bọc nước vỡ, giải phóng đầu sán đầu sán bám vào phủ tạng khác tạo nên bọc nước [3, 4, 5] Bệnh sán dây chó (Echinococcosis) gặp TCNCYH 83 (3) - 2013 ... gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến) Trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến) IV BÀN LUẬN vậy, MIC có mối liên quan với số lượng vi khuẩn. .. số lượng vi khuẩn lậu gồm: chủng nhạy cảm 69 đột biến [4] Với MIC nhỏ, mang đột biến MIC lớn mang nhiều đột biến Kết chủng đề kháng Phân tích đột biến gen gyrA parC phối hợp đột tương đồng với... mang đột biến truyền Vi t Nam có nguồn gốc từ chủng mang tính khu vực [8] Kết gen gyrA không mang đột biến gen parC chủng đề kháng có MIC - µg/ nghiên cứu thu chứng minh đề kháng vi khuẩn lậu