Đề tài nghiên cứu tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano của rutin, tạo nhũ tương và đồng nhất hóa với thiết bị Ultra-Turrax và siêu âm, kích thước và dãy phân bố kích cỡ của tiểu phân được chụp với kính hiển vi điện tử truyền qua và nhiễu xạ laser, định lượng rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao detector PDA, bước sóng 255 nm.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CỦA RUTIN Trương Công Trị*, Khưu Mỹ Lệ*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano rutin Phương pháp nghiên cứu: Tạo nhũ tương đồng hóa với thiết bị Ultra-Turrax siêu âm Kích thước dãy phân bố kích cỡ tiểu phân chụp với kính hiển vi điện tử truyền qua nhiễu xạ laser Định lượng rutin sắc ký lỏng hiệu cao detector PDA, bước sóng 255 nm Kết quả: Đã xây dựng cơng thức quy trình bào chế tiểu phân nano rutin phương pháp nêu Bằng thiết bị TEM LB 550, đo đạc kích thước dãy phân bố kích thước hạt từ 66,6 nm đến 339,3 nm Lượng hoạt chất nhũ hóa chiếm 1,3% so với tổng lượng lipid Kết luận: Kết cho thấy bào chế tiểu phân nano rutin phương pháp tạo nhũ tương đồng hóa với thiết bị Ultra-Turrax siêu âm Từ khóa: Rutin, tiểu phân nano, TEM ABSTRACT FORMULATION OF RUTIN LIPID NANOPARTICLES Truong Cong Tri, Khuu My Le, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 559 - 564 Objectives: The aim of the study was to prepare rutin lipid nanoparticles Methods: Rutin nanoparticles were prepared by emulsification and homogenization with Ultra-Turrax and ultrasound Particle size and distribution were analysed by transmission electron micrography and laser diffraction HPLC was used to determine the quantity of rutin at a wavelength of 255 nm Results: Nanoparticles were successfully prepared by emulsification and homogenization The particle size and distribution ranged from 66,6 nm to 339,3 nm Quantity of emulsified rutin is about 1,3% of total lipid Conclusions: The present results provided evidence that rutin nanoparticles could be prepared by emulsification and homogenization with Ultra-Turrax and ultrasound Keywords: Rutin, nanoparticles, TEM ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều hoạt chất có tác dụng trị liệu tan nên sinh khả dụng Nồng độ thuốc máu không ổn định yếu tố làm thay đổi hiệu điều trị Vấn đề cải thiện sinh khả dụng kiểm sốt tốc độ phóng thích hoạt chất để nâng cao hiệu điều trị, giảm tác dụng phụ điều cần thiết Từ đó, cải tiến kỹ thuật bào chế, việc sử dụng chất mang có kích thước *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: GS TS Nguyễn Minh Đức Chuyên Đề Dược Khoa nhỏ, hệ tiểu phân nano, nghiên cứu Lợi tiểu phân nano chúng đóng vai trò hệ thống phân phối, mang hoạt chất tan nước vượt qua hàng rào sinh học thể(1) Hơn nữa, kích thước giảm đi, độ tan hoạt chất tan cải thiện đáng kể(3) Ngồi ra, tiểu phân nano kiểm sốt tốc độ phóng thích theo thời gian nên hạn chế tình trạng nồng độ hoạt chất huyết tương không ổn định Hệ tiểu phân nano lipid ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vnn.vn 559 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 thu hút ý nhà khoa học nhờ lợi dễ dàng nâng cỡ lơ quy mơ cơng nghiệp(4,6), độc tính(7) kiểm nghiệm tiêu chất lượng sản phẩm(5) Nhằm bước đầu ứng dụng kỹ thuật bào chế dược phẩm, dược phẩm chứa hoạt chất tan từ dược liệu, tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano rutin” Mục tiêu Mục tiêu đề tài nhằm bào chế hệ tiểu phân nano rutin phân tích tính chất tiểu phân thiết bị phù hợp ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Nguyên vật liệu Rutin (Ban NCKH, Việt Nam), hỗn hợp acid capric acid caprylic (Labrafac CC - Gattefossé - France), glycerin behenat (Compritol Gattefossé - France), stearoyl macrogolglycerid (Gelucire Gattefossé France), phosphatidylcholin (Lipoid GMBH - Germany) dung môi, hóa chất cần thiết khác đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất Trang thiết bị Máy đồng hóa (Ultra-Turrax - Germany), bể siêu âm (Sonorex - Germany), kính hiển vi điện tử truyền qua (JEM 1400 - Jeol - Japan), máy đo phân bố kích cỡ hạt (LB 550 - Horiba Jobin Yvon - Mỹ), máy HPLC (Shimadzu LC-10AD - Nhật) Phương pháp nghiên cứu Thiết lập công thức Tiến hành xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano phương pháp tạo nhũ tương đồng hóa thiết bị Ultra-Turrax siêu âm(2,9) Khảo sát thành phần công thức, từ chọn cơng thức phù hợp để nang hóa rutin Quy trình bào chế Hòa tan chất hoạt động bề mặt vào nước 70oC, khuấy pha nước Ultra-Turrax với tốc độ 10.000 vòng / phút (5 phút) Đun pha dầu 560 lên 70oC, phối hợp pha dầu vào pha nước Ultra-Turrax với tốc độ 10.000 vòng / phút (5 phút) Tăng tốc độ khuấy lên 20.000 vòng/phút (5 phút), tiếp tục siêu âm nhũ tương (5 phút) Kết tinh hạt bên tiểu phân nhiệt độ phòng (30oC)(8) Đánh giá số tính chất tiểu phân Sự phân bố kích cỡ hạt Tiến hành xác định dãy phân bố kích cỡ tiểu phân theo phương pháp nhiễu xạ laser Phân tích sau bào chế mẫu 24 Nhiệt độ phân tích 25oC Dựa vào biểu đồ, xác định kiểu phân bố kích thước, dãy phân bố kích cỡ, kích thước trung bình tiểu phân giá trị thơng số d50, d75, d90 Kích thước hình thể học tiểu phân Tiểu phân sau bào chế đo kích thước thực tế khảo sát hình thể học TEM để đánh giá hình dạng cấu trúc bên tiểu phân Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân Khảo sát ảnh hưởng tốc độ thời gian khuấy đến kích thước tiểu phân theo mơ hình yếu tố đầy đủ tiến đến vùng gần dừng phương pháp Box–Wilson KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát số tính chất rutin Trước thiết lập cơng thức, tiến hành khảo sát tính tan rutin tá dược (dầu) số dung môi Kết cho thấy rutin tan phần tá dược dầu tan tốt methanol, ethanol so với dung môi nước Kết khảo sát điều kiện sắc ký rutin Máy HPLC Shimadzu LC – 10AD Cột: X.Terra LC 18 (250 mm x 4,6 mm), cỡ hạt: µm, tiền cột Supelcosil Pha động: CH3CN- H2O (36: 64) Detector PDA, bước sóng phát hiện: 255 nm Nhiệt độ cột: 25 - 30oC Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Tốc độ dòng: 0,52 ml/phút Nghiên cứu Y học Kết thiết lập công thức Thành phần cơng thức bào chế trình Thể tích tiêm mẫu: 30 µl bày bảng Bảng Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano Thành phần Công thức Công thức Công thức Công thức Labrafac CC (g) 20 15 10 Compritol (g) 10 15 Thành phần khác vđ (g) 100 Cảm quan nhũ tương Nhũ tương lỏng, trắng Nhũ tương lỏng Nhũ tương đặc, mịn, Nhũ tương đặc, mềm, mịn, trắng đục trắng đục sữa, đặc CT1, trắng đục sữa, không sữa, đồng đồng đục sữa tách lớp Độ bền nhũ tương Sau tuần nhũ tương Tách lớp sau ngày Tách lớp sau ngày Tách lớp sau bền bảo quản 30oC để nguội 30oC để nguội 30oC Khi điều chế nhũ tương theo công thức bị loại bỏ Công thức với lipid dạng lỏng có lipid dạng lỏng chưa phối hợp hoạt chất, chiếm 20% chọn để nang hóa rutin (hình kết thu hệ tiểu phân ổn định, bền 1) sau tháng bảo quản nhiệt độ mát Tuy nhiên, cơng thức có phối hợp lipid dạng rắn, nhũ tương tạo thành chưa ổn định nhanh chóng bị tách lớp sau vài ngày điều chế Ở dạng lỏng, lipid chuỗi carbon dài có cấu trúc linh động đan xen vào chuyển sang dạng rắn, chúng có xu hướng duỗi thẳng hàng, đẩy lipid lỏng (và hoạt chất) khỏi tiểu phân làm tiểu phân bền, tượng tách lớp xảy Điều đặc biệt lưu ý lipid dạng rắn, nhiệt độ môi trường thấp nhiệt độ tan chảy chúng (khoảng 5oC) chúng trở trạng thái rắn nên việc kiểm soát nhiệt độ lúc điều chế phải chặt chẽ Quá trình điều chế phải tiến hành Hình Hình ảnh kích thước tiểu phân nano chụp TEM nhiệt độ cao nhiệt độ tan chảy lipid rắn từ - 10oC Vì lý trên, cơng thức 2, Kết khảo sát cơng thức có phối hợp rutin Kết khảo sát cơng thức có phối hợp rutin trình bày bảng Bảng Kết khảo sát cơng thức nang hóa rutin với hàm lượng khác Công thức Lượng rutin (mg) Cảm quan Độ bền nhũ tương (sau tuần bảo quản o o 30 C 20 C) 100 10 11 12 200 300 350 400 450 500 550 Nhũ tương lỏng, mịn, trắng đục sữa, màu sắc đồng Có rutin lắng xuống đáy, Có rutin lắng xuống đáy (ít), Khơng có rutin lắng xuống đáy, không tách lớp, đạt yêu cầu cảm không tách lớp, đạt yêu cầu không tách lớp, đạt yêu cầu cảm quan cảm quan quan Chuyên Đề Dược Khoa 561 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Như vậy, hàm lượng rutin phối hợp vào công thức nhỏ 300 mg Bảng Ma trận bố trí thí nghiệm kết N bi xo 1 1 350 x1 -1 -1 -75 x2 1 -1 -1 -50 yu 250 350 300 500 Kết đánh giá ý nghĩa hệ số hồi quy (bảng 4) Bảng Kết đo kích thước hạt TN điều kiện Hình Hình thể học kích thước tiểu phân công thức chụp TEM Kết khảo sát từ TEM cho thấy rutin nang hóa lõi tiểu phân có kích thước khoảng 200 nm (hình 1) Điều hồn tồn phù hợp với mục tiêu bào chế dạng hòa tan cho tác dụng nhanh dạng kết tinh giúp kéo dài tác dụng tiểu phân nano Công thức Labrafac CC .20% Rutin .0,3% Chất diện hoạt x% Chất diện hoạt y% Nước cất vừa đủ .100 g Kết khảo sát ảnh hưởng tốc độ thời gian khuấy đến kích thước tiểu phân Ma trận bố trí thí nghiệm kết trình bày bảng Phương trình hồi quy thực nghiệm: y = 350 –75x1 –50x2 Dựa vào phương trình hồi quy, hệ số bi mang dấu âm, vậy, có khả hai yếu tố có ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân tương quan theo chiều nghịch, nghĩa gia tăng tốc độ thời gian khuấy kích thước tiểu phân giảm 562 X1 6 6 6 yuTB X2 20000 20000 20000 20000 20000 20000 yu 250 300 250 300 200 250 258,33 Ttn hệ số bi 6,45 3,2 Tra bảng student, Tlt (0,05,5) = 2,57 < 3,2 Do đó, hai hệ số bi có ý nghĩa Như vậy, tốc độ thời gian khuấy tăng, kích thước hạt giảm Vấn đề tăng đến mức độ để thu tiểu phân có kích thước khoảng 100 - 200 nm điều kiện cho phép máy móc thiết bị Kết thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng phương pháp Box–Wilson (bảng 5) Kết từ TEM cho thấy thí nghiệm thí nghiệm có kích thước tiểu phân khoảng 200 nm, phù hợp với yêu cầu tiểu phân nano Tuy nhiên, thí nghiệm 6, thời gian tốc độ khuấy cao thí nghiệm nên chọn điều kiện tối ưu thí nghiệm với thời gian khuấy 7,0 phút tốc độ khuấy 20.750 vòng/phút Bảng Thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng N X0i X1 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 X2 20000 20750 21500 22250 23000 yu 250 200 200 250 300 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Kết thực nghiệm kiểm chứng điều kiện tối ưu Kết xác định kích thước tiểu phân 03 mẫu công thức điều kiện (thời gian khuấy 7,0 phút tốc độ khuấy 20750 (vòng / phút) TEM cho thấy kích thước tiểu phân 03 mẫu khoảng 200 nm (hình 3) Hình Kích thước hình ảnh tiểu phân TN kiểm chứng chụp TEM Đánh giá tính chất tiểu phân Kết đánh giá tính chất tiểu phân nano nang hóa rutin (bảng 6) Bảng Kết đánh giá tính chất tiểu phân nano nang hóa rutin Tính chất Mơ tả Quan sát mắt thường, nhũ tương dạng lỏng, trắng đục đồng giống sữa Cảm quan Kích thước dãy phân Kích thước trung bình tiểu phân: 190,1 nm bố kích cỡ Dãy phân bố kích thước: 66,6 nm - 339,3 nm Mode: 117,4 nm Trung vị: 106,7 nm d50, d75, d90: 114,5 nm; 172,1 nm; 339,3 nm Tiểu phân có hình cầu, bờ đều, phân tán đồng nhất, khơng kết tụ, lõi chứa rutin Hình thể học Hàm lượng rutin mẫu bào chế: 260,23 mg Định lượng Mẫu khơng nang hóa rutin: Quan sát mắt thường, sau 04 tháng hệ tiểu phân có dạng lỏng, Độ ổn định trắng đục đồng giống sữa, không tách lớp, khơng kết bơng Mẫu nang hóa rutin: Quan sát mắt thường, sau 03 tháng hệ tiểu phân có dạng lỏng, trắng đục đồng giống sữa, không tách lớp, không kết Biểu đồ phân bố kích cỡ Hình Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân điều chế từ công thức Chuyên Đề Dược Khoa Hình Sắc ký đồ rutin mẫu bào chế Theo kết tính tốn, hàm lượng trung bình rutin 260,23 mg 100 g công 563 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 thức Nếu so với tổng lượng lipid rutin chiếm khoảng 1,3% Kết thẩm định quy trình định lượng rutin cơng thức HPLC cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống (RSD mẫu chuẩn thử 1,67 1,12), khoảng nồng độ tuyến tính từ 12,5 - 125 μg/ml (R2 = 0,9975), có độ xác cao với RSD% = 0,92% tỉ lệ phục hồi trung bình 100,1% ± 1,0% TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Bằng phương pháp tạo nhũ tương đồng hóa với thiết bị Ultra-Turrax siêu âm, đề tài điều chế thành công tiểu phân nano nang hóa rutin Hỗn hợp acid capric caprilic sử dụng công thức tá dược dầu phù hợp để hòa tan nang hóa rutin Đây kết bước đầu khả quan tảng để nghiên cứu sâu nhằm ứng dụng kỹ thuật bào chế chế phẩm chứa hoạt chất rutin có tác dụng điều trị bệnh lý tĩnh mạch 564 Bunjes H (2005), “Characteration of solid lipid nano - and micropartical”, CRC Press LLC, 42 - 58 Hu F.Q., Zhang Y., Du Y.Z., Yuan H (2007), “Nimodipine loaded lipid nanospheres prepared by solvent diffusion method in a drug saturated aqueous system”, International Journal of Pharmaceutics, - Mauludin R., Müller H.R., Keck M.C (2008), “Kinetic solubility and dissolution velocity of rutin nanocrystals”, European Journal of Pharmaceutical Sciences 36, 503 – 504 Müller R.H., Radtke M., Wissing S.A (2002), “Solid lipid nanoparticals and nano structured lipid carriers in cosmetic and dermatological preparations”, Advanced Drug Delivery Reviews 54, pp 133 - 141 Müller R.H., Radtke M., Wissing S.A (2007), “Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs”, International Journal of Pharmaceutics 242, 121 -128 Radtke M., Muller R.H., Nanostructured lipid drug carriers, Nanotechnology, 48 - 52 Traul K.A., Driedger A., Ingle D.L., Nakhasi D (2000), “Review of the toxicologic properties of medium - chain triglycerides”, Food and chemical toxicology 38, pp.79 - 98 Xia Q., Hao X., Lua Y., Wei X., Wei H., Mab Q.H., Gua N (2007), “Production of drug-loaded lipid nanoparticles based on phase behaviors of special hot microemulsions”, Colloids and Surfaces A: Physicochem Eng Aspects, - Yuan H, Wang L.L., Doo Y.Z., You J., Hu F.Q., Zeng S (2007), “Preparation and characteristics of nanostructured lipid carriers for control - releasing progesterone by melt emulsification”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2-3 Chuyên Đề Dược Khoa ... thuật bào chế dược phẩm, dược phẩm chứa hoạt chất tan từ dược liệu, tiến hành đề tài Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano rutin Mục tiêu Mục tiêu đề tài nhằm bào chế hệ tiểu phân nano rutin phân. .. bên tiểu phân nhiệt độ phòng (30oC)(8) Đánh giá số tính chất tiểu phân Sự phân bố kích cỡ hạt Tiến hành xác định dãy phân bố kích cỡ tiểu phân theo phương pháp nhiễu xạ laser Phân tích sau bào chế. .. kích thước tiểu phân 03 mẫu khoảng 200 nm (hình 3) Hình Kích thước hình ảnh tiểu phân TN kiểm chứng chụp TEM Đánh giá tính chất tiểu phân Kết đánh giá tính chất tiểu phân nano nang hóa rutin (bảng