Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano dihydroartemisinin PLGA bao acid folic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HỮU PHONG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO DIHYDROARTEMISININ-PLGA BAO ACID FOLIC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HỮU PHONG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO DIHYDROARTEMISININ-PLGA BAO ACID FOLIC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 Người hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Thị Hường PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với: Cô TS Nguyễn Thị Hường Và thầy: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến Những thầy cô giàu kinh nghiệm đầy nhiệt huyết định hướng, giúp đỡ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Trần Ngọc Bảo thầy cô, anh chị kỹ thuật viên thuộc viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế tạo điều kiện thiết bị, máy móc, hóa chất, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo Phòng ban khác, thầy cô cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy bảo, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa học trường Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình tơi, bạn bè, đồng nghiệp động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà nội, ngày 30 tháng năm 2018 Phạm Hữu Phong MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dihydroartemisinin 1.1.1 Tính chất lý, hóa 1.1.2 Tác dụng dược lý 1.1.3 Dược động học 1.1.4 Độc tính DHA 1.1.5 Định lượng DHA 1.2 Tổng quan nano polyme 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 1.2.3 Đặc điểm phân bố tiểu phân nano dùng tiêm tĩnh mạch 1.2.4 Một số phương pháp để thu tiểu phân nano polyme 10 1.2.5 Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano thị trường 11 1.2.6 Vài nét chất mang PLGA 12 1.2.7 Vài nét FA, thụ thể FA 14 1.2.8 Vài nét Chitosan 15 1.3 Các phương pháp xác định độc tính tế bào số dòng tế bào ung thư hay sử dụng để thử in vitro DHA 16 1.3.1 Các phương pháp xác định độc tính tế bào 16 1.3.2 Một số dòng tế bào ung thư hay sử dụng để thử in vitro DHA 17 1.4 Một số nghiên cứu liên quan 18 1.4.1 Một số nghiên cứu nano DHA 18 1.4.2 Một số nghiên cứu nano bao acid folic hướng đích 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 22 2.1.1 Nguyên vật liệu 22 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.2.1 Xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 23 2.2.2 Xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA-CS-FA 23 2.2.3 Thử tác dụng ức chế ung thư in vitro hệ tiểu phân nano bào chế dòng tế bào ung thư KB, HL-60 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 24 2.3.2 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA 24 2.3.3 Đánh giá số đặc tính lý hóa hệ tiểu phân nano DHA 25 2.3.4 Thử tác dụng ức chế ung thư in vitro hệ tiểu phân nano DHA dòng tế bào ung thư 27 2.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm xử lý số liệu 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Khảo sát phương pháp định lượng DHA 30 3.1.1 Độ tuyến tính 30 3.1.2 Độ ổn định hệ thống 30 3.2 Kết xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 31 3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố công thức 32 3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố quy trình 35 3.3 Kết xây dựng công thức bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA38 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ CS-FA/ PLGA tới đặc tính hệ tiểu phân nano 38 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ FA/CS tới đặc tính hệ tiểu phân nano 39 3.3.3 Xác định có mặt FA hệ tiểu phân nano DHA bao CS-FA 40 3.4 Kết đánh giá hình thái, cấu trúc tiểu phân nano 45 3.5 Kết sơ thử tác dụng ức chế ung thư in vitro hệ tiểu phân nano DHA bào chế dòng tế bào ung thư KB, HL-60 47 CHƯƠNG BÀN LUẬN 49 4.1 Về phương pháp định lượng 49 4.2 Về phương pháp nhũ hóa bốc dung mơi có đồng máy siêu âm đầu dò 49 4.3 Về yếu tố ảnh hưởng tới trình bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 50 4.3.1 Ảnh hưởng yếu tố công thức 50 4.3.2 Ảnh hưởng thơng số quy trình bào chế hệ tiểu phân nano 51 4.4 Các phương pháp gắn FA lên tiểu phân nano kết bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao FA 53 4.4.1 Các phương pháp gắn FA lên tiểu phân nano 53 4.4.2 Kết bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA 54 4.5 Về kết xác định có mặt FA tiểu phân nano DHA-PLGA bao CSFA 55 4.6 Về kết sơ thử tác dụng ức chế ung thư in vitro hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS- FA dòng tế bào ung thư KB, HL-60 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitril CS: Chitosan DCC: Dicyclohexyl carbodimid DCM: Dicloromethan DHA: Dihydroartemisinin DL: Tỷ lệ nạp thuốc (Drug loading) DMSO: Dimethyl sulfoxid EE: Hiệu suất mang thuốc (Encapsulation efficiency) FA: Acid folic FDA: Cục quản lý thực phẩm dược phẩm (Food and Drug Administration) FR: Thụ thể folat (folat receptor) HL-60: Ung thư tế bào bạch cầu cấp người (human acute leukemia) KB: Ung thư biểu mô miệng người (human carcinoma in the mouth) KTTP: Kích thước tiểu phân NHS: N-hydroxysuccinimid PDI: Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) PEG: Poly ethylen glycol PLGA: Poly (acid lactic-co-glycolic) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SRB: Sulforhodamin B TBUT: Tế bào ung thư TCA: Acid tricloracetic TEM: Kính hiển vi điện tử truyền qua ( Transmission electron microscopy) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng DHA Bảng 1.2 Một số chế phẩm chứa tiểu phân nano lưu hành thị trường 12 Bảng 1.3 Một số dòng tế bào ung thư hay sử dụng để thử in vitro DHA 17 Bảng 2.1 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng để bào chế hệ tiểu phân nano DHA 22 Bảng 3.1 Mối tương quan diện tích pic nồng độ DHA 30 Bảng 3.2 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống 31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng thể tích pha ngoại tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 32 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ PLGA/dược chất tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng lượng siêu âm tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian siêu âm tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 37 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ CS-FA so với PLGA tới đặc tính hệ nano DHA-PLGA bao CS-FA 38 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ FA/CS tới đặc tính hệ nano DHA-PLGA bao CS-FA 39 Bảng 3.10 EE, LC số công thức tốt 47 Bảng 3.11 Kết sơ thử tác dụng dược lý 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Dihydroartemisinin Hình 1.2 Sự khác siêu vi cầu siêu vi nang Hình 1.3 Kỹ thuật nhũ hóa bốc dung mơi Hình 1.4 Kỹ thuật nhũ hóa khuếch tán dung mơi Hình 1.5 Cấu trúc hóa học thủy phân PLGA 13 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo Acid folic 14 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học Chitin Chitosan 15 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ DHA 30 Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng thể tích pha ngoại tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 32 Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng tỷ lệ PLGA/Dược chất tới đặc tính hệ nano DHA-PLGA 33 Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng nồng độ chất diện hoạt tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 35 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng lượng siêu âm tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 36 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng thời gian siêu âm tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA 37 Hình 3.7 Đồ thị ảnh hưởng tỷ lệ CS-FA so với PLGA tới đặc tính hệ nano DHA-PLGA bao CS-FA 38 Hình 3.8 Đồ thị ảnh hưởng tỷ lệ FA/CS tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA bao CS-FA 40 Hình 3.9 Phổ hấp thụ UV nano DHA-PLGA bao CS-FA 41 Hình 3.10 Phổ FT-IR nano DHA-PLGA bao CS-FA, DHA, PLGA, CS, FA 42 Hình 3.11 Phổ XRD nano DHA-PLGA bao CS-FA, nano DHA-PLGA bao CS, DHA nguyên liệu, CS nguyên liệu, FA nguyên liệu, PLGA nguyên liệu 44 Hình 3.12 Hình ảnh chụp TEM nano DHA-PLGA tỷ lệ 100 nm 45 Hình 3.13 Hình ảnh chụp TEM nano DHA-PLGA bao CS-FA tỷ lệ 200 nm 46 Hình 3.14 Hình ảnh chụp TEM nano DHA bao CS-FA tỷ lệ 500 nm 46 Hình 4.1.Hình ảnh mơ tả mức tăng lượng/cm2 tăng lượng siêu âm để khoảng cách xác định 52 Hình 4.2 Năng lượng nhận đơn vị cm2 tác động với cường độ 500W với tần số siêu âm 23 kHz 52 hành bốc dung môi Thu hỗn dịch nano FA hòa tan vào NaOH 20%, điều chỉnh pH đến 7,4 đệm phosphat, sau phối hợp dung dịch FA vào hỗn dịch nano thu khuấy từ 30 phút thu hệ tiểu phân nano Doxorubicin-CS-FA Một nghiên cứu khác Dhas cộng [11] thiết kế, tối ưu hóa thử giải phóng in vitro tiểu phân nano Bicatulamid bao phức hợp CS-FA điều trị ung thư tuyến tiền liệt Để bào chế tiểu phân nano Bicatulamid bao phức hợp CSFA nhóm nghiên cứu tiến hành: Bào chế phức hợp CS-FA phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng tác nhân tạo phản ứng DCC, triethylamin, NHS Kế tiếp nhóm nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Bicatulamid phương pháp kết tủa Sau phối hợp phức hợp CS-FA vào tiểu phân nano Bicatulamid thu tiểu phân nano Bicatulamid bao phức hợp CS-FA Trong nghiên cứu để bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao FA tiến hành theo phương pháp thứ 2: Bao phức hợp vật lý CS-FA lên tiểu phân nano DHA-PLGA 4.4.2 Kết bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA 4.4.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ CS-FA/PLGA tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA Tiến hành khảo sát tỷ lệ CS-FA với PLGA 0,2 ,0,3, 0,4, 0,6 (cố định tỷ lệ FA CS 1:1) Kích thước tiểu phân sau bao tất tỷ lệ tăng đáng kể so với trước bao (trước bao tiểu phân nano DHA-PLGA kích thước khoảng 130nm), Zeta có đảo chiều từ âm sang dương Với tỷ lệ 0,6 CS-FA PLGA nano có kích thước lớn 322,5±2,121 >300 nm, PDI 0,3375±0,067 cao, zeta 4,385±0,163 mV thấp hệ khơng ổn định Trong tỷ lệ CS-FA/PLGA 0,2 ,0,3, 0,4 kích thước tiểu phân tương đồng nhiên tỷ lệ 0,4 có PDI thấp có Zeta cao nhất, lượng FA có cơng thức lớn Do chúng tơi định lựa chọn tỷ lệ 0,4 CS-FA/PLGA tỷ lệ phù hợp cho bào chế nano DHA-PLGA bao CS-FA 54 Kết tương đồng với nghiên cứu Trần Trọng Biên nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano Artesunat sử dụng PLGA CS, tác giả đưa tỷ lệ CS/PLGA=0,47 tốt [1] 4.4.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ FA/CS tới đặc tính hệ tiểu phân nano DHAPLGA bao CS-FA Tiến hành khảo sát tỷ lệ FA/CS 1:1, 2:1, 3:1, 1:2, 1:3 (khối lượng/khối lượng) Tỷ lệ FA/CS 2:1, 3:1 cảm quan nano bị tủa, tỷ lệ FA/CS 1:1, 1:2,1:3 kích thước tiểu phân, PDI tương đồng, lượng FA cơng thức có tỷ lệ 1:1 cao Do chúng tơi định chọn tỷ lệ FA/CS 1:1 để bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA phù hợp 4.5 Về kết xác định có mặt FA tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA Hiện để xác định có mặt FA tiểu phân nano có nhiều phương pháp như: Trong nghiên cứu Ji JinGou cộng (2012) bào chế, xác định thử giải phóng in vitro hệ tiểu phân nano methotrexate gắn phức hợp CS-FA hướng đích Để xác định FA gắn phức hợp CS-FA nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp phổ 1H-NMR, FT-IR, nhiễu xạ X-ray [16] Trong nghiên cứu Dhas Namdev L.(2015) thiết kế tối ưu công thức hệ tiểu phân nano bicalutamid-PLGA bao phức hợp CS-FA dùng điều trị ung thư tuyến tiền liệt Để xác định FA gắn phức hợp CS-FA nhóm nghiên cứu sử dụng phổ UV, FT-IR, nhiễu xạ X-ray, DSC [11] Một nghiên cứu khác Hijaz cộng (2016) hạt nano oxid xeri bao FA hướng đích tác nhân dùng điều trị ung thư buồng trứng người Sau bào chế nano oxid xeri bao FA nhóm tác giả sử dụng phương pháp nhiễu xạ X-ray, quang phổ quang điện X-ray để xác định có mặt FA, để tính số lượng phân tử FA gắn tinh thể nano tính hàm ẩm từ phân tích nhiệt lượng [14] 55 Trong điều kiện thực tế sử dụng phương pháp cảm quan, quét phổ UV, phổ FT-IR X-ray để xác định có mặt FA tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA Với phương pháp sử dụng phổ hấp thụ UV để xác định có mặt FA tiểu phân nano DHA, kết cho thấy tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA có cực đại hấp thụ bước sóng 280 nm (là bước sóng có cực đại hấp thụ FA) điều giải thích: thành phần nano chất DHA,PLGA,CS khơng có vòng thơm nên khơng hấp thụ UV FA có cấu trúc vòng thơm nên hấp thụ UV bước sóng 280 nm Kết tương đồng với nghiên cứu Dhas Namdev L.(2015) [11] Với phương pháp sử dụng phổ FT-IR để xác định có mặt FA tiểu phân nano DHA, so sánh phổ IR nano DHA-PLGA bao CS-FA với FA nguyên liệu: nano có pic 1460, 1648,1737 cm-1 bị dịch chuyển tương ứng với pic 1485 (thể vòng thơm), 1605 thể liên kết N-H, 1695 cm-1 thể liên kết C=O FA nguyên liệu Kết tương đồng với nghiên cứu Hà Phương Thu cộng [33] Trong nghiên cứu tác giả sử dụng phổ FT-IR để chứng minh có mặt FA tiểu phân nano paclitaxel sử dụng chất mang PLA-TPGS bao FA: cụ thể nano paclitaxel có pic 1480, 1616, 1677 tương ứng với pic 1485 (thể vòng thơm), 1605 thể liên kết N-H, 1697 cm-1 thể liên kết C=O FA nguyên liệu Với phương pháp dùng phổ X-ray diffraction (XRD) kết cho thấy: nguyên liệu DHA FA có pic đặc trưng với cường độ tán xạ mạnh thể nguyên liệu DHA FA tồn dạng tinh thể Trong mẫu tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA, tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS, CS nguyên liệu, PLGA nguyên liệu không pic điều thể dược chất, FA, CS, PLGA hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA, nano DHA-PLGA bao CS tồn trạng thái vô định hình Như phương pháp phổ XRD chứng minh dược chất FA tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA trạng thái vơ định hình phân tán phân tử 56 Kết tương đồng với nghiên cứu Ji JinGou cộng (2012) [16] Nghiên cứu Ji JinGou cộng dược chất tiểu phân nano Methotrexat gắn phức hợp CS-FA dạng vơ định hình 4.6 Về kết sơ thử tác dụng ức chế ung thư in vitro hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS- FA dòng tế bào ung thư KB, HL-60 Tất mẫu thử (DHA nguyên liệu, nano DHA-PLGA, nano DHA-PLGA bao CS-FA toàn phần, nano DHA-PLGA bao CS-FA tinh chế) có tác dụng ức chế mạnh dòng tế bào ung thư KB HL-60 Trong mẫu thử nano DHAPLGA bao CS-FA tinh chế cho tác dụng ức chế mạnh so sánh với nano DHA bao CS-FA toàn phần, nano DHA-PLGA DHA nguyên liệu Còn mẫu trắng chứa nano PLGA, PLGA-CS khơng có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư Điều giải thích: với dạng bào chế nano DHA-PLGA làm tăng sinh khả dụng, kéo dài thời gian lưu thuốc tuần hoàn nên tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư mạnh DHA nguyên liệu Nano DHA bao CS-FA toàn phần, có gắn thêm FA tăng cường tính hướng đích thụ thể folat tế bào ung thư Bên cạnh CS gắn nano polysaccharid có khả phân hủy sinh học, có tính tương hợp sinh học cao, khơng độc CS mang điện tích dương giúp hướng đích đến tế bào ung thư mang điện tích âm bề mặt, CS làm kéo dài thời gian lưu thuốc, làm cho giảm giải phóng thuốc ạt polyme mang thuốc PLGA Chính lý nên tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư nano DHA-PLGA bao CS-FA toàn phần mạnh nano DHA-PLGA Nano DHA-PLGA bao CS-FA có EE khoảng 50% nên nano DHA-PLGA bao CS-FA toàn phần có khoảng 50% DHA dạng tự do, 50% dạng tiểu phân nano Còn nano DHA-PLGA bao CS-FA tinh chế qua màng siêu lọc tỷ lệ tiểu phân nano DHA 100% Như nano DHA-PLGA bao CS-FA tinh chế có nồng độ DHA dạng tiểu phân nano cao nano DHA-PLGA bao CS-FA toàn phần tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư mạnh 57 Mặt khác Nano DHA-PLGA có EE(%)=59,6±9,78, LC(%)=13,62±2,23 mẫu nano DHA-PLGA bao CS-FA có EE (%)=49,95±2,47, LC (%)= 11,38±2,28 thấy EE,LC sau bao giảm so với trước bao Như tác dụng ức chế ung thư in vitro mẫu nano DHA-PLGA bao CS-FA mạnh nano DHA-PLGA có khả tính hướng đích CS FA 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thực nghiệm chúng tơi đạt số kết sau: Đã xây dựng công thức phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA * Đã xây dựng công thức tốt thơng qua q trình khảo sát số thông số ảnh hưởng, công thức cụ thể sau: - Pha dầu: - Pha nước +DHA 10mg +Tween 80 với nồng độ 1% +PLGA 30mg 50ml nước Dung môi pha dầu 5ml DCM - Năng lượng siêu âm 90% công suất 130W với tần số 20KHz, nhiệt độ 4C, thời gian siêu âm phút Thời gian bốc dung môi nhiệt độ phòng Tỷ lệ CS-FA/PLGA 0,4, tỷ lệ CS/FA 1:1 (tỷ lệ khối lượng/khối lượng) Thời gian phối hợp dung dịch CS-FA vào nano DHA-PLGA 30 phút, nhiệt độ phòng, có khuấy từ * Hệ tiểu phân nano DHA-PLGA bao CS-FA thu có đặc tính sau: - Kích thước tiểu phân nano có kích thước khoảng 200-250 nm với số đa phân tán PDI hẹp