Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa fenofibrat

Việc ứng dụng hệ vận chuyển thuốc có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid vào nghiên cứu bào chế đã được chứng minh làm tăng sự hấp thu và khả năng kiểm soát giải phóng dược chất DC, do

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THANH MAI

Mã sinh viên: 1201364

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ TIỂU PHÂN NANO LIPID

CHỨA FENOFIBRAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THANH MAI

Mã sinh viên: 1201364

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ TIỂU PHÂN NANO LIPID

CHỨA FENOFIBRAT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Đào Văn Nam

2 ThS Lê Thị Thu Trang

Nơi thực hiện:

Bộ môn Vật lý - Hóa lý

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành nhất đến ThS Đào Văn Nam và ThS Lê Thị Thu Trang, hai người Thầy

đã không quản công sức và thời gian tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận nhất cho tôi trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô, Kỹ thuật viên bộ môn Vật lý - Hóa

lý, bộ môn Bào chế và Viện công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô trường Đại học Dược Hà Nội đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt năm tháng học tập ở giảng đường đại học

Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Mặc dù đã hết sức cố gắng trong quá trình thực hiện khóa luận nhưng kết quả báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì thế, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của quý thầy cô để hoàn thiện khóa luận này hơn nữa

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Bùi Thanh Mai

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 VÀI NÉT VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO LIPID 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Phân loại và ưu nhược điểm 2

1.1.3 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid SLN và NLC 4

1.1.4 Một số phương pháp đánh giá độ bền của hệ tiểu phân nano 6

1.1.5 Cơ chế làm tăng sinh khả dụng đường uống của dược chất khi bào chế vào hệ nano lipid 7

1.1.6 Ứng dụng của hệ nano lipid vào các dạng bào chế khác 9

1.2 VÀI NÉT VỀ FENOFIBRAT 10

1.2.1 Công thức hóa học 10

1.2.2 Tính chất lý hóa 10

1.2.3 Đặc tính dược động học 10

1.2.4 Dược lý và cơ chế tác dụng 11

1.2.5 Chỉ định, chống chỉ định, liều dùng 11

1.2.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ nano chứa fenofibrat 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 16

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan của dược chất trong lipid rắn 17

2.3.2 Phương pháp bào chế hệ NLC chứa fenofibrat 17

2.3.3 Các phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid chứa fenofibrat 17 2.3.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần công thức và lựa chọn công thức bào chế tối ưu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG FENOFIBRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 22 3.2 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC BÀO CHẾ CƠ BẢN VÀ THÔNG SỐ KỸ THUẬT CỦA QUÁ TRÌNH BÀO CHẾ 22 3.2.1 Lựa chọn thành phần trong công thức bào chế 22 3.2.2 Lựa chọn các thông số kỹ thuật 29 3.3 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN ĐẾN ĐỘ BỀN

VẬT LÝ VÀ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG DƯỢC CHẤT IN VITRO CỦA HỆ

NLC CHỨA FENOFIBRAT 30 3.3.1 Thiết kế thí nghiệm và kết quả 30 3.3.2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền vật lý và khả năng giải phóng

dược chất in vitro của hệ 33

3.4 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÔNG THỨC HỆ NLC CHỨA

FENOFIBRAT CÓ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG DƯỢC CHẤT IN VITRO VÀ

ĐỘ BỀN VẬT LÝ TỐI ƯU 36 3.4.1 Lựa chọn công thức tối ưu (CTTƯ) 36 3.4.2 Đánh giá một số đặc tính của hệ nano lipid chứa fenofibrat bào chế theo CTTƯ 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DM, DMHC Dung môi, Dung môi hữu cơ

DSC Differential scanning calorimetry - Quét nhiệt lượng vi sai

EE Entrapment efficiency - Hiệu suất bẫy thuốc

HPH High pressure homogenization - Đồng nhất hóa áp suất cao

HPLC High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng

cao HP-β-CD Hydroxypropyl-β-cyclodextrin

KTTB Kích thước trung bình

KTTP Kích thước tiểu phân

LC Loading capacity - Khả năng nạp thuốc

LCT Long chain triglycerids - Các triglycerid mạch dài

LDC Lipid - drug conjugates - Hệ liên hợp lipid - thuốc

MCT Medium chain triglycerids - Các triglycerid mạch trung bình

NLC Nanostructured lipid carriers - Hệ chất mang lipid cấu trúc nano NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drugs - Thuốc kháng viêm không

steroid

PDI Polydispersity index - Chỉ số đa phân tán

TEM Transmission electron microscope - Kính hiển vi điện tử truyền qua

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các kĩ thuật bào chế hệ tiểu phân nano lipid SLN và NLC 5 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình nghiên cứu 15 Bảng 2.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm 16

Bảng 3.2 Khả năng hòa tan của FB trong một số tá dược lipid rắn 23 Bảng 3.3 So sánh đặc tính của hệ NLC chứa FB khi thay đổi lipid lỏng 25 Bảng 3.4 Đặc tính của hệ NLC chứa FB khi sử dụng CDH khác nhau 27 Bảng 3.5 Các thành phần và tỷ lệ trong công thức NLC chứa FB 28

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc 33

Bảng 3.11 Thành phần công thức bào chế tối ưu của hệ NLC chứa FB 37 Bảng 3.12 Kết quả đánh giá các mẫu bào chế theo CTTƯ sau bảo quản 1

ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng

40

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá các mẫu bào chế theo CTTƯ sau 3 tuần bảo

quản ở điều kiện nhiệt độ phòng

40

Bảng 3.14 So sánh giá trị biến đầu ra theo dự đoán phần mềm và thực tế

của mẫu bào chế theo CTTƯ sau 1 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng

40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.2 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ Miglyol đến % FB

giải phóng sau 10 giờ

34

Hình 3.3 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 đến tỉ lệ

KTTB mẫu sau 3 chu kì đông - rã và sau bào chế 1 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng

35

Hình 3.4 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 đến sự

xuất hiện tủa của mẫu sau thực hiện 3 chu kì đông - rã

35

Hình 3.6 Đồ thị % DC giải phóng in vitro theo thời gian của các mẫu

bào chế theo CTTƯ sau 1 ngày và 3 tuần bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Fenofibrat (FB) là một dẫn chất của acid fibric đã được sử dụng trên 20 năm với tác dụng hạ cholesterol máu Đây là hoạt chất tốt nhất và duy nhất thuộc nhóm acid fibric được dùng phổ biến hiện nay So với các thuốc nhóm statin, fenofibrat nổi bật nhờ tính an toàn, có tác dụng trên hầu hết các chứng tăng lipid máu và làm tăng các cholesterol tốt Hơn nữa, fenofibrat có thể được dùng phối hợp với các thuốc thuộc nhóm statin nhằm làm tăng hiệu quả và tính an toàn Tuy nhiên giống như các thuốc khác có khả năng tan kém trong nước, sinh khả dụng (SKD) đường uống của FB thấp và không ổn định Đã có rất nhiều bản quyền được đăng kí liên quan đến giải pháp tăng độ hòa tan và SKD của FB, đặc biệt từ năm 2010 đến nay

đã có thêm hơn 15 bản quyền được đăng ký mới cho thấy vấn đề tăng độ hòa tan và SKD của FB vẫn đang có tính thời sự cao

Công nghệ nano ra đời đã đánh dấu một bước ngoặt lịch sử đối với nền công nghiệp dược phẩm, mở ra những hướng phát triển mới trong việc nghiên cứu, bào chế ra các sản phẩm mới với nhiều ưu điểm vượt trội so với các dạng bào chế quy ước Việc ứng dụng hệ vận chuyển thuốc có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid vào nghiên cứu bào chế đã được chứng minh làm tăng sự hấp thu và khả năng kiểm soát giải phóng dược chất (DC), do đó làm tăng SKD của chế phẩm đường uống nói riêng và các đường đưa thuốc khác nói chung Với các kết quả khả quan đem lại, hệ nano lipid hứa hẹn là một hệ vận chuyển thuốc tiềm năng cho các thuốc ít hoặc không tan trong nước

Với mong muốn ứng dụng được hệ nano lipid để tăng SKD của dược chất

fenofibrat, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano

lipid chứa fenofibrat” gồm 3 mục tiêu sau:

1 Xây dựng được công thức bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa fenofibrat

2 Đánh giá được ảnh hưởng của một số yếu tố đến đặc điểm về độ bền vật lý

và khả năng giải phóng DC in vitro của hệ NLC chứa fenofibrat

3 Đánh giá một số đặc tính của hệ NLC chứa FB bào chế được

1.1.2 Phân loại và ưu nhược điểm

Hệ tiểu phân nano lipid được chia thành 4 dạng chính: hệ hạt nano lipid rắn (solid lipid nanoparticles - SLN), hệ chất mang lipid cấu trúc nano (nanostructured lipid carriers - NLC), hệ liên hợp lipid - thuốc (lipid - drug conjugates - LDC) và pharmacosomes (PCS) [31]

Hình 1.1: Các hệ tiểu phân nano lipid chính

1.1.2.1 Hệ hạt nano lipid rắn (SLN)

Được giới thiệu từ năm 1991, hệ SLN được biết đến là một hệ vận chuyển thay thế cho những hệ vận chuyển keo thông thường như: nhũ tương, liposomes, hạt polyme kích thước micro…[29] Hệ SLN có các ưu điểm: (i) sử dụng các lipid sinh

lý, tránh sử dụng dung môi hữu cơ (DMHC) trong sản suất, (ii) cải thiện SKD của các thuốc ít tan trong nước, các hợp chất không bền, (iii) ứng dụng vào hệ vận chuyển thuốc hướng đích, cải thiện tính thấm qua da khi dùng đường bôi ngoài da, (iv) có khả năng nâng cấp quy mô sản suất, khử trùng và đông khô, (v) bảo vệ DC

dễ bị phân hủy trong ruột và nhạy cảm với môi trường bên ngoài, (vi) tạo được nồng độ cao các chất có hoạt tính sinh dược học Tuy nhiên, hệ SLN vẫn còn nhiều điểm hạn chế, gồm: (i) khả năng nạp thuốc còn thấp, (ii) sự trục xuất thuốc ra khỏi

hệ trong quá trình bảo quản, (iii) hàm lượng nước cao trong pha phân tán (70 99,9%), (iv) quá trình tái kết tinh của lipid trong quá trình bảo quản dẫn đến giảm

-độ bền của hệ [15]

1.1.2.2 Hệ chất mang lipid cấu trúc nano (NLC)

Hệ NLC được Luck giới thiệu năm 1997, Muller và Dingler tiếp tục nghiên cứu năm 1998 được coi là thế hệ thứ 2 của hệ nano lipid khi kết hợp các lipid rắn và lipid lỏng, tạo ra các cấu trúc có trật tự ít hơn, dẫn đến sự “bẫy” các DC vào bên trong cấu trúc tốt hơn trong suốt quá trình bảo quản, do đó cải thiện được những hạn chế của SLN [14] Một vài ưu điểm của hệ NLC so với SLN: (i) tăng hiệu suất nạp thuốc, (ii) giảm kích thước tiểu phân, (iii) giảm nguy cơ gel hóa và sự rò rỉ thuốc ra ngoài chất mang trong suốt quá trình bảo quản do sự chuyển dạng của lipid [41] Có 3 dạng mô hình cấu trúc của NLC đã được đề xuất, được thể hiện ở hình 1.2, phụ thuộc vào loại lipid sử dụng và kĩ thuật bào chế [14]

Hình 1.2: Các loại cấu trúc của hệ NLC

(a) tinh thể không hoàn hảo, (b) dạng vô định hình, (c) dạng phức tạp

1.1.2.3 Các loại nano lipid khác

a Hệ liên hợp lipid - thuốc (LDC)

Hệ SLN và NLC có chung một nhược điểm chính là khả năng nạp thuốc thấp, đặc biệt với những thuốc thân nước do độ tan kém của chúng trong hỗn hợp

lipid Để giải quyết vấn đề này, hạt nano LDC được phát triển để cải thiện khả năng nạp thuốc từ 10% (giới hạn nạp thuốc của SLN) lên 33%, đặc biệt đối với những hoạt chất thân nước cần dùng liều cao [28] Hệ LDC được hình thành bởi sự tạo muối giữa thuốc và các lipid đa cation (polycationic lipid) (như acid béo, steroid, glycerid, phospholipid) hoặc bằng các liên kết đồng hóa trị Các thuốc điều trị ung thư, các thuốc điều trị hướng đích và điều trị gen là những nhóm thuốc chính để ứng dụng hệ LDC [20]

b Pharmacosomes (PCS)

PCS là các phức hợp phospholipid lưỡng tính (thường dùng phosphatidylcholin) gắn với thuốc thông qua cầu nối giữa phospholipid với những thuốc có nhóm hydro hoạt động (-COOH, -OH, -NH2…) được phát triển để hạn chế nhược điểm của các hệ nano lipid thông thường Ưu điểm nổi bật của hệ là khả năng giảm thiểu độc tính đường ruột, cải thiện sự hấp thu bởi phức hợp phospholipid - thuốc, khả năng tải thuốc cao và tránh được sự rò rỉ thuốc ra khỏi chất mang do thuốc được liên kết đồng mol với các phospholipid thông qua các liên kết đồng hóa trị PSC là một hệ đưa thuốc tiềm năng cho rất nhiều loại thuốc như kháng viêm không steroid, các protein, thuốc tim mạch và thuốc ung thư [37]

1.1.3 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid SLN và NLC

Có nhiều phương pháp để tạo hệ tiểu phân nano lipid SLN và NLC, bao gồm: đồng nhất hóa áp suất cao (HPH), đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn và/hoặc siêu âm, đi từ vi nhũ tương, bốc hơi dung môi, khuếch tán dung môi, tiêm dung môi, nhũ tương kép, chuyển pha Trong đó, kĩ thuật HPH và bào chế đi từ vi nhũ tương được đánh giá là có tiềm năng cao nâng cấp quy mô để sản xuất thương mại [14] Bảng 1.1 tóm tắt một số kỹ thuật bào chế hệ SLN và NLC hay dùng

Bảng 1.1: Các kĩ thuật bào chế hệ tiểu phân nano lipid SLN và NLC [35]

Kĩ thuật Tóm tắt cách làm Ưu điểm Nhược điểm

- HPH lạnh: làm lạnh nhanh (1) bằng

N2 lỏng hoặc đá khô, nghiền nhỏ đến KTTP 50 - 100µm, phân tán trong pha nước chứa CDH rồi ĐNH ở nhiệt độ thấp

- Không cần dung môi (DM)

- Thời gian ngắn

- Độ lặp lại cao

- Khả năng nâng cấp quy mô

- Có thể áp dụng với chất nhạy cảm với nhiệt

làm phân hủy thuốc

- Thiết bị phức tạp

- Nhanh chóng, hiệu quả kinh tế

- Năng lượng thấp, khả năng nâng cấp quy

mô

- Không cần

DM

- Nồng độ CDH cao

- Nồng độ TPNN thấp, hàm lượng nước cao

DC và lipid kết tủa tạo hệ tiểu phân

- Tránh tiếp xúc nhiệt độ

- Giảm PDI và KTTP

- Nồng độ TPNN thấp

- Tồn dư

DM trong sản phẩm

- Tương đối đơn giản và dễ thực hiện

- Tránh tiếp xúc nhiệt độ

- Tồn dư

DM trong sản phẩm

- Khó nâng cấp quy mô Nhũ tương

kép

Hòa tan DC trong dung môi thân nước, phân tán trong pha dầu tạo nhũ tương N/D Tiền nhũ tương được nhũ hóa trong dung dịch thân nước tạo nhũ tương kép N/D/N

- Áp dụng được với dược chất thân nước

- Tránh tiếp xúc nhiệt độ

- KTTP và PDI rộng

1.1.4 Một số phương pháp đánh giá độ bền của hệ tiểu phân nano

Hệ tiểu phân nano lipid tạo thành có cấu trúc hệ hỗn dịch, do đó có thể đánh giá độ bền của hệ tiểu phân bằng việc sử dụng các phương pháp thử trong điều kiện nhiệt độ phòng và điều kiện khắc nghiệt như sau [7],[8],[39]:

1.1.4.1 Phương pháp tiến hành

- Thử ở điều kiện nhiệt độ phòng: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng 25 - 35oC

- Thử ở điều kiện khắc nghiệt:

+ Ly tâm: Quá trình ly tâm ảnh hưởng nhiều đến các đặc tính lý hóa của hệ

TPNN, đẩy nhanh tốc độ gel hóa và sa lắng, thể hiện qua sự thay đổi KTTP [39] Thường tiến hành ly tâm mẫu bào chế với tốc độ < 6000 vòng/phút x 30 phút

+ Rung lắc: Cũng giống như ly tâm, quá trình rung lắc làm thay đổi đến độ

ổn định vật lý của hệ tiểu phân khiến các tiểu phân dễ tập hợp với nhau [39] Thường tiến hành rung lắc bằng máy Vortex trong 30 phút

+ Thay đổi nhiệt độ: Sự thay đổi nhiệt độ gây ra sự biến đổi nhanh chóng

đặc tính vật lý và hóa học của hệ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự kết tụ tiểu phân, sự trục xuất thuốc khỏi chất mang, sự gel hóa Để dự đoán tuổi thọ hóa học có thể sử dụng phương trình Arrhenius, tuy nhiên độ ổn định vật lý thì có thể không tuân theo [24] Mặc dù vậy, việc bảo quản mẫu ở điều kiện lão hóa cấp tốc là cần thiết để dự đoán và theo dõi độ ổn định dài hạn của công thức theo thời gian [39] Có nhiều kỹ thuật đánh giá độ bền của hệ theo nhiệt độ hay sử dụng:

 Bảo quản mẫu ở nhiệt độ lạnh (4oC) trong ngăn mát tủ lạnh hoặc tủ vi khí hậu

 Bảo quản mẫu ở nhiệt độ lạnh sâu: Hệ tiểu phân được tiến hành đông

đá hoàn toàn ở -70o

C trong 48 giờ, sau đó để rã đông hoàn toàn ở 25oC

 Thực hiện chu kì đông - rã: Bảo quản mẫu ở tủ đá để đông hoàn toàn sản phẩm sau đó rã đông ở nhiệt độ 25oC (bảo quản ở mỗi điều kiện tối thiểu 5 giờ)

Có thể thực hiện tới 3 chu kì

 Thực hiện chu kì nóng - lạnh: mẫu được bảo quản ở tủ vi khí hậu và nhiệt độ được thay đổi liên tục giữa 4 và 40oC mỗi 24 giờ trong 7 ngày

1.1.4.2 Các chỉ tiêu đánh giá

Mẫu sau khi bảo quản ở các điều kiện khác nhau được đánh giá độ bền dựa trên các tiêu chí: cảm quan (sự đồng nhất, sự tách pha, sự tủa dược chất), kích thước, phân bố kích thước tiểu phân, thế Zeta và so sánh với các mẫu ban đầu Sự thay đổi KTTB của hệ nano được thể hiện bằng tỉ số KTTB trước : KTTB sau thử nghiệm Giá trị này càng gần 1 và mẫu sau khi thử nghiệm ở điều kiện khắc nghiệt

ít thay đổi thể chất thì hệ càng bền [2]

Ngoài các tiêu chí trên, việc kiểm tra tính chất lưu biến cũng được áp dụng

để dự đoán đặc tính của hệ và cung cấp thông tin để cải thiện độ ổn định và hiệu suất chung [7] Một nghiên cứu đã chứng minh việc kiểm tra tính chất lưu biến ngắn hạn (tiến hành trong vài tuần đầu) có thể đánh giá được độ ổn định vật lý dài hạn (6

- 12 tháng) Kiểm tra tính chất lưu biến có thể phân biệt được một số quá trình phân tách nhũ tương: (i) cream hóa hoặc lắng đọng do chênh lệch tỷ trọng, (ii) tạo tủa bông do lực hút Val-der-Waals lớn hơn lực đẩy giữa các giọt, (iii) kết tụ Ostwald gây ra bởi độ tan khác nhau giữa các hạt kích thước khác nhau, (iv) kết tập tăng lên

do sự mỏng đi và gián đoạn của lớp màng film lỏng, (v) hiện tượng đảo pha [39]

1.1.5 Cơ chế làm tăng sinh khả dụng đường uống của dược chất khi bào chế vào hệ nano lipid

Tác dụng tăng cường hấp thu của hệ nano lipid dẫn đến tăng SKD đường uống của DC có thể được giải thích bằng các cơ chế sau:

1.1.5.1 Tăng thời gian lưu giữ trong đường tiêu hóa

Khi dùng thuốc có thành phần lipid đặc biệt là cùng với bữa ăn nhiều chất béo sẽ kéo dài thời gian lưu ở đường tiêu hóa hơn Điều này dẫn đến việc kích thích bài tiết muối mật và dịch tụy, kích thích sự vận chuyển bạch huyết, giảm các chuỗi phản ứng chuyển hóa và đào thải thuốc, thay đổi tốc độ dòng máu mạch mạc treo và gan, qua đó cải thiện đáng kể SKD đường uống của thuốc [12]

1.1.5.2 Khả năng kết dính với thành ruột của hạt nano

Đặc tính kết dính có ở tất cả các hạt tiểu phân nano không chỉ riêng nano lipid và tăng theo tỉ lệ diện tích bề mặt Sau khi kết dính vào thành ruột, thuốc sẽ được giải phóng chính xác tại nơi hấp thu Ngoài ra, quá trình kết dính được chứng minh là có độ lặp lại cao thể hiện qua việc ít thay đổi SKD Dữ liệu nghiên cứu thuốc ở dạng nano tinh thể trên chuột cho thấy có ít sự dao động về kết quả trên nhóm chuột nhịn ăn và nhóm được cho ăn Nghiên cứu trên tiểu phân nano lipid cũng cho kết quả tương tự [28]

1.1.5.3 Thay đổi hàng rào vật lý, sinh hóa

Một số lipid và CDH có thể giảm hoạt động hệ vận chuyển thuốc ra ngoài đường ruột (ví dụ P-glycoprotein), ức chế hoạt động chuyển hóa trong các nhung mao và các lumen đường ruột Ngoài ra sự kết hợp giữa lipid, CDH và các sản phẩm tiêu hóa có thể làm tăng SKD đường uống dựa trên việc tăng tính thấm của màng tiêu hóa CDH còn có thể làm lỏng hóa màng tế bào ruột và mở các liên kết vòng bịt (tight junctions) [10]

1.1.5.4 Kích thích hệ vận chuyển ruột - bạch huyết

Những lipid được tạo thành từ triglycerid mạch dài (long chain triglycerid - LCT) và triglycerid mạch trung bình (medium chain triglycerid - MCT) được vận chuyển theo các cách khác nhau trong cơ thể Trong khi MCT được vận chuyển trực tiếp qua máu tĩnh mạch cửa vào hệ tuần hoàn, LCT kích thích sự hình thành lipoprotein, do đó tạo điều kiện cho vận chuyển qua hệ bạch huyết Nhờ vậy, những thuốc như testosteron (vốn bị chuyển hóa bước một qua gan nhiều) khi sử dụng dạng tiền thuốc ester với chuỗi mạch dài thân dầu sẽ được hấp thu trực tiếp qua thành ruột vào hệ bạch huyết và vào hệ tuần hoàn mà không qua gan, SKD đường uống sẽ được tăng lên đáng kể [10]

1.1.5.5 Tăng độ hòa tan và hấp thu qua quá trình tạo micell

Tác dụng cải thiện hấp thu của lipid có thể được giải thích rõ hơn qua các thí nghiệm của Charman cùng các cộng sự [11] Quá trình hấp thu thuốc tại đường tiêu

hóa được mô tả như sau: lipid bị phân hủy bởi các enzym trong ruột dẫn đến sự hình thành các chất hoạt động bề mặt mono, diglycerid trên bề mặt tiểu phân làm các tiểu phân này bị biến đổi, hình thành dạng micell chứa DC được hòa tan bên trong Các micell này sẽ liên kết với muối mật có tính diện hoạt tạo phức hợp micell Cuối cùng, thuốc được hấp thu cùng với các micell

Một vài cơ chế làm tăng hấp thu thuốc đường uống được thể hiện ở hình 1.3

Hình 1.3: Một vài cơ chế hấp thu của hệ nano lipid [17]

A: Hấp thu qua kẽ tế bào; B: Hấp thu qua các tế bào M; C: Hấp thu dạng cấu trúc

giống chylomicron qua tế bào biểu mô

1.1.6 Ứng dụng của hệ nano lipid vào các dạng bào chế khác

Bên cạnh đường uống, do có những ưu điểm vượt trội về khả năng cải thiện đặc tính DC, độc tính thấp, kích thước nhỏ, khả năng giải phóng tại đích, khả năng lưu giữ và ổn định dược chất tốt sau tiệt trùng, phun mù hay đông khô mà các hệ nano lipid có thể áp dụng vào các đường dùng khác nhau [15]

- Đường tiêm: Tiềm năng ứng dụng hệ nano lipid cho đường tiêm là rất lớn,

đặc biệt là với các tác nhân chống ung thư, tác nhân đánh dấu trong chẩn đoán hình ảnh, thuốc chống co giật, loạn thần, thuốc điều trị HIV, kháng sinh, chuyển nạp gen, thuốc tim mạch, thuốc vận chuyển lên hệ thần kinh trung ương [21]

- Đường hô hấp: Những thuốc điều trị lao (rifampicin, isoniazid và

pyrazinamid), kháng ung thư hoặc các thuốc peptid (insulin, thymopentin)…được

nghiên cứu đưa vào hệ nano sử dụng qua đường hô hấp cho tác dụng tại chỗ hoặc toàn thân [42]

- Mĩ phẩm và chế phẩm qua da: Ngoài ưu điểm chung, với đường đưa thuốc

này hệ nano giúp cải thiện độ ổn định hóa học của các hoạt chất nhạy cảm với ánh sáng, quá trình ô-xi hóa và thủy phân bởi môi trường bên ngoài Các glucocorticoid, NSAID, thuốc điều trị nấm, vẩy nến, viêm da dị ứng, mụn hoặc các hoạt chất dùng trong mĩ phẩm đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng trên thực tế [34]

- Đường mắt: Tính tương thích về mặt sinh học và khả năng bám dính niêm

mạc của hệ giúp kéo dài thời gian lưu giữ ở giác mạc, tăng tác dụng tại đích Các kháng sinh (tobramycin), thuốc giảm đau (natri diclofenac, ibuprofen), thuốc điều trị glaucom, herpes tại mắt đã được nghiên cứu trên động vật và đem lại nhiều kết quả khả quan [15],[38]

1.2 VÀI NÉT VỀ FENOFIBRAT

1.2.1 Công thức hóa học

- Công thức phân tử: C20H21ClO4

- Khối lượng phân tử: 360,83g/mol

- Tên khoa học: Isopropyl 2-[4-(4-chlorobenzoyl)phenoxy]-2-methyl-propanoat

- FB ổn định ở nhiệt độ thường, nhiệt độ nóng chảy: 79o- 82oC[6]

thường và người có lipid máu cao Thời gian bán thải của thuốc ở người có chức năng thận bình thường khoảng 20 giờ Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nước tiểu (70% sau 24 giờ), chủ yếu dưới dạng liên hợp gluconic [3]

1.2.4 Dược lý và cơ chế tác dụng

Fenofibrat là thuốc hạ lipid máu thuộc dẫn chất của acid fibic.Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (các lipoprotein tỷ trọng rất thấp và thấp), làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao và còn làm giảm triglycerid máu Do đó thuốc cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương FB có thể làm giảm 20 - 25% cholesterol toàn phần và 40 - 50% triglycerid trong máu Ðiều trị bằng FB cần phải liên tục và kết hợp chế độ ăn [3]

1.2.5 Chỉ định, chống chỉ định, liều dùng

- Chỉ định: FB được sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các typ

IIa, IIb, III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn

- Chống chỉ định: Suy thận nặng; rối loạn chức năng gan nặng; bệnh lý túi

mật; trẻ dưới 10 tuổi; phụ nữ có thai và đang cho con bú

Trẻ trên 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định căn nguyên chính xác của tăng lipid máu ở trẻ Có thể điều trị kết hợp với chế độ ăn được kiểm soát chặt chẽ trong 3 tháng Liều tối đa khuyên dùng là 5mg/kg/ngày

Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng FB thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác) [3]

1.2.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ nano chứa fenofibrat

Sinh khả dụng của một thuốc không chỉ phụ thuộc vào đặc tính hóa học của

DC mà còn phụ thuộc vào dạng bào chế Đặc biệt, việc tăng diện tích bề mặt thông qua việc giảm kích thước tiểu phân là một hướng nghiên cứu chính nhằm cải thiện

độ hòa tan thấp, vốn là trở ngại dẫn đến SKD thấp của các thuốc nhóm II (thấm tốt nhưng tan kém trong nước) Mối quan hệ giữa việc tăng diện tích bề mặt và tăng tốc

độ hòa tan tuân theo phương trình Noyes - Whitney [22]:

dc

dt = 𝑘 𝐴 (𝐶𝑆 − 𝐶)

Trong đó: dc/dt: Biến thiên nồng độ theo thời gian; C: Nồng độ của thuốc

trong dung dịch; Cs: Độ tan; A: Diện tích bề mặt hiện có; k: Hệ số khuếch tán

Việc tăng tỉ lệ hòa tan dc/dt bằng việc tăng diện tích bề mặt sẽ làm tăng SKD của những thuốc tan kém trong nước [22],[44] Do đó, xu hướng ứng dụng các công nghệ bào chế tạo hệ cấu trúc nano đối với FB nói riêng và DC nói chung đã và đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà bào chế

Năm 2008, Waard H và cộng sự [13] đã công bố kỹ thuật tạo tinh thể nano của FB bằng phương pháp đông khô Trong nghiên cứu này, hai dung dịch mannitol trong nước và FB trong tertiary butyl alcohol được trộn lẫn vào nhau ở 60oC, làm lạnh nhanh và sấy đông khô ở -25oC.Đến năm 2011, Hu J và cộng sự cũng bào chế thành công tiểu phân FB có kích thước trung bình 320nm bằng kỹ thuật phun sấy.Cụ thể các tác giả đã phối hợp dung dịch FB trong EtOH và dung dịch gồm SLS, HPMC E3 và lactose hoặc mannitol trong nước.Hỗn dịch này được phun sấy ngay lập tức sau khi được đồng nhất hóa Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X (XRD)

và quét nhiệt lượng vi sai (DSC) cho thấy FB tồn tại ở trạng thái kết tinh Độ hòa tan của FB dạng nano tinh thể tăng lên rất nhiều so với nguyên liệu thường và dạng

vi hạt, trên 80% hòa tan sau 5 phút và gần như 100% hòa tan sau 10 phút [19]

Một trong các giải pháp tăng độ hòa tan của các chất khó tan là tạo hệ tự vi nhũ hóa (TVNH) Khi gặp môi trường hòa tan, hệ phân tán DC và tá dược hình thành vi nhũ tương Thành phần của hệ TVNH thường gồm có DC, CDH và pha

dầu có bản chất là các lipid mạch ngắn hoặc trung bình Các nhóm tác giả Patel A.R [30], Wei J.D [43], Kazi Mohsin [27] đã đăng tải nghiên cứu bào chế hệ TVNH chứa FB vào năm 2007, 2010 và 2016 Các tác giả đã khảo sát các đặc tính

về các yếu tố ảnh hưởng, khả năng tự nhũ hóa, kích thước vi nhũ tương, khả năng

giải phóng DC và SKD in vivo Mặc dù FB có khả năng hòa tan rất nhanh từ hệ

TVNH có KTTB < 100nm, việc ứng dụng vào thực tế sẽ gặp trở ngại vì việc dùng nhiều CDH trong thời gian dài có thể làm thay đổi sinh lý của các tế bào niêm mạc, không có lợi cho sức khỏe người bệnh

Ngoài lipid, việc sử dụng các polyme thiên nhiên làm hệ chất mang nano cũng thu hút sự chú ý lớn vì độ an toàn và hiệu quả mang thuốc cao cùng sự tương thích về mặt sinh học Các nhà khoa học Hàn Quốc [44] đã tiến hành nghiên cứu để

so sánh những hệ hạt nano chứa FB từ những polyme khác nhau: Polyvinylpyrrolidon (PVP), hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD), gelatin Cụ thể, siêu vi cầu PVP, siêu vi tiểu thể HP-β-CD, siêu vi nang gelatin chứa FB được tạo ra với tỉ lệ khối lượng tối ưu lần lượt FB/PVP/SLS = 2,5:4,5:1, FB/HP-β-CD = 1:4 và FB/gelatin = 1:8 Các thành phần được hòa tan hoàn toàn trong EtOH ở nhiệt

độ 50 - 60oC rồi tiến hành phun sấy Đặc tính lý hóa, khả năng hòa tan trong dung môi thân nước, tỉ lệ phân tán và dược động học trên chuột được nghiên cứu so sánh với thuốc dạng nguyên liệu Kết quả cho thấy rằng: Mặc dù tốc độ hòa tan chậm nhưng siêu vi nang gelatin thể hiện độ hòa tan trong môi trường thân nước cao nhất

và cải thiện SKD tốt nhất (5,5 lần so với thuốc so sánh)

Bên cạnh các công bố về hệ nano lipid chứa FB bào chế theo phương pháp truyền thống [22],[27],[40], Xingwang Zhang và các cộng sự đã tiến hành bào chế

hệ nano lipid được PEG hóa chứa FB bằng phương pháp khuếch tán dung môi Các tác giả thu được hệ tiểu phân có KTTB là 186,7nm, hiệu suất bẫy thuốc > 95% và

sự hấp thu đường tiêu hóa được tăng lên đáng kể so với dạng nano lipid bào chế theo cách truyền thống cũng như dạng thương mại (Lipanthyl) là 123,9% và 157,0% tương ứng [45] Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc giảm dịch nhày (mucin trapping), giảm sự giáng hóa lipid và cải thiện sự thấm qua niêm mạc là những

hướng chính làm tăng độ hấp thụ đường uống bởi vì sự phân giải lipid sớm sẽ làm tủa thuốc và kết tập các hạt lại khi chúng không thể ngay lập tức đi vào micell tạo bởi muối mật và các phospholipid; còn mucin được biết đến là 1 glycoprotein bao phủ bề mặt các tế bào viền của đường tiêu hóa, nhận biết các hạt nano và đưa ra ngoài Hệ nano lipid PEG hóa được coi là một hướng đi hiệu quả vì hạn chế được các khó khăn của hệ nano lipid dùng đường uống do giảm sự nhận biết của các mucin và giảm sự phân giải tiểu phân lipid sớm

Khi sử dụng những chất ổn định để tối ưu công thức, độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano lipid có thể kéo dài đến 3 năm, do đó có thể sử dụng như một dạng thuốc đường uống Dạng thuốc lỏng có thể thuận tiện cho một số nhóm bệnh nhân nhất định như trẻ nhỏ, người già, tuy nhiên dạng bào chế ưu tiên nhất vẫn là dạng khô: viên nang, viên nén, dạng phân tán nhanh… Có nhiều phương pháp có thể làm rắn hóa hỗn dịch nano lipid như phun sấy hoặc đông khô [9] Phun sấy là một trong những kĩ thuật được sử dụng thường xuyên nhất bởi hệ thống đơn giản và dễ dàng nâng cấp quy mô Zhiqiang Tian và các cộng sự [40] đã rắn hóa hệ NLC-FB bằng kĩ thuật bao bồi từng lớp lên pellet trơ Sau khi tạo được hệ NLC từ Precirol ATO 5, Captex 100, Tween 80 và FB, hỗn dịch được pha loãng trong dung dịch chứa PVP K17 (7% w/v) rồi phun sấy từng lớp lên pellet trơ Nghiên cứu về SKD đường uống được tiến hành giữa pellet chứa NLC, hỗn dịch NLC ban đầu và viên nang Lipanthyl trên đối tượng chó Beagle Kết quả cho thấy cả hệ NLC ban đầu và sau khi rắn hóa đều làm tăng hấp thu so với Lipanthyl (366,4% và 356,6%), các giá trị Cmax cũng cao hơn rất nhiều so với dạng quy ước Pellet chứa NLC được rắn hóa

có tốc độ tái phân tán nhanh, có sự khác biệt không nhiều về sự giáng hóa lipid, SKD đường uống so với hệ NLC hỗn dịch

Nghiên cứu này của chúng tôi tập trung vào việc bào chế và đánh giá độ bền

cũng như khả năng giải phóng DC in vitro của hệ tiểu phân nano chứa FB bào chế

từ những lipid hay được sử dụng như: Precirol ATO 5 và Miglyol Đây là các tá dược lipid đã được chứng minh là an toàn với đường tiêu hóa và được ứng dụng làm hệ chất mang lipid ở các nghiên cứu khác [35]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1: Nguyên liệu sử dụng trong quá trình nghiên cứu

TT TÊN HÓA CHẤT TIÊU CHUẨN XUẤT XỨ

14 Compritol ATO 888 (glyceryl behenat) NSX Gattefosse - Pháp

15 Gelot 64 (glyceryl monostearat +

17 Precirol ATO 5 (glyceryl palmitostearat

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.2: Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm

3 Cột thẩm tích (màng PS, kích thước

4 Máy đo phân bố kích thước tiểu phân

và thế Zeta Zetasizer Nano

9 Hệ thống HPLC Agilent 1200,

15 Cân phân tích, cân kĩ thuật, các dụng

cụ thủy tinh khác…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Lựa chọn tá dược và xác định tỷ lệ thành phần của công thức bào chế hệ tiểu phân nano lipid chứa FB

- Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm, sử dụng phần mềm FormRules v2.0 phân tích ảnh hưởng của các thành phần tới độ bền vật lý và khả

năng giải phóng dược chất in vitro của hệ

- Lựa chọn công thức có độ bền vật lý và khả năng giải phóng DC in vitro tối

ưu bằng phần mềm INForm v3.2, bào chế, đánh giá một số đặc tính của hệ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp khảo sát khả năng hòa tan của dược chất trong lipid rắn

Chuẩn bị các lọ thủy tinh khác nhau chứa 1g tá dược lipid rắn và lượng FB khác nhau (0,1g; 0,2g; 0,3g; 0,4g; 0,5g) Đun nóng 70 - 75oC trong bể dầu, sử dụng máy khuấy từ gia nhiệt cho hỗn hợp nóng chảy, khuấy đều trong 10 phút DC tan hoàn toàn trong tá dược khi dung dịch đồng nhất, không quan sát thấy các hạt DC,

để nguội đến nhiệt độ phòng DC không kết tủa trở lại

2.3.2 Phương pháp bào chế hệ NLC chứa fenofibrat

Hệ NLC chứa FB được bào chế theo phương pháp nhũ hóa - nóng chảy, sử

dụng siêu âm kết hợp khuấy từ:

Bước 1: Hòa tan hoàn toàn DC và các thành phần lipid rắn, lipid lỏng, CDH thân

dầu, sử dụng máy khuấy từ gia nhiệt, duy trì ở nhiệt độ 74 - 75oC, thu được pha dầu

Bước 2: Hòa tan CDH thân nước trong nước cất, sử dụng máy khuấy từ gia nhiệt,

duy trì ở nhiệt độ 80oC ± 2oC, thu được pha nước

Bước 3: Phối hợp hai pha Sử dụng máy siêu âm cầm tay (công suất 100W, tần số

26kHz, biên độ 100%), siêu âm liên tục trong 10 phút, duy trì ở nhiệt độ 75 ± 1o

C

Bước 4: Tiếp tục khuấy không gia nhiệt, cho nhiệt độ giảm dần về nhiệt độ phòng Bước 5: Điều chỉnh thể tích bằng nước cất

2.3.3 Các phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid chứa fenofibrat

2.3.3.1 Phương pháp định lượng fenofibrat

Định lượng FB bằng phương pháp HPLC [1]:

Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 30,0mg FB vào bình định mức 50ml

Hòa tan FB trong 30ml acetonitril (ACN), siêu âm trong 10 phút cho tan hết Thêm ACN tới vạch, lắc đều, thu được dung dịch gốc có nồng độ khoảng 600,0µg/ml Pha loãng dung dịch gốc với lượng ACN thích hợp thu được các dung dịch chuẩn FB với các nồng độ khoảng: 4,8µg/ml; 12,0µg/ml; 24,0µg/ml; 48,0µg/ml; 60,0µg/ml; 72,0µg/ml; 120,0µg/ml

- Chế độ bơm mẫu: bơm mẫu tự động

- Mẫu thử (thu bằng phương pháp thích hợp) được lọc qua màng lọc 0,2μm

mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn

2.3.3.2 Các phương pháp đánh giá đặc tính hệ NLC chứa fenofibrat

a Đo kích thước và phân bố kích thước tiểu phân

Sử dụng máy Zetasizer Nano ZS90 theo nguyên lý tán xạ ánh sáng động

Tiến hành: mẫu được pha loãng 20 lần bằng nước cất đã lọc qua màng lọc

0,2µm để tránh hiện tượng đa tán xạ, lắc đều Tốc độ đếm tiểu phân nằm trong khoảng 200 - 400kcps Mẫu pha loãng được đo bằng cuvet nhựa, nhiệt độ đo 25 ±

2oC Đưa ra kết quả trên màn hình máy tính KTTB (nm), PDI, D90 (nm) dựa trên phân bố kích thước theo thể tích

b Đo thế Zeta

Sử dụng máy Zetasizer Nano ZS 90 theo nguyên tắc điện di tán xạ ánh sáng

Tiến hành: Mẫu được pha loãng 20 lần bằng nước cất đã lọc qua màng

0,2µm, lắc đều Tốc độ đếm tiểu phân nằm trong khoảng 200 - 400kcps Mẫu pha loãng được đo bằng cuvet dùng một lần, nhiệt độ đo 25 ± 2oC Đưa ra kết quả thế Zeta trung bình (mV)

c Phương pháp xác định hình thái tiểu phân

Sử dụng kính hiện vi điện tử truyền qua (TEM) EMLab - NIHE, dựa trên nguyên tắc: sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao (40 - 100kV) chiếu xuyên qua vật mẫu, dùng thấu kính từ để tạo ảnh có độ phóng đại lớn (x50 - x600.000), ảnh được hiện lên trên màn huỳnh quang

Tiến hành: Mẫu được pha loãng bằng nước cất theo tỉ lệ thích hợp, cho lên

đĩa đựng mẫu, làm bốc hơi hơi nước rồi tiến hành đo Kết quả thu được là ảnh TEM các tiểu phân của hệ nano lipid

d Phương pháp định lượng FB có trong hệ (định lượng toàn phần)

- Hút chính xác 0,5ml mẫu bào chế, phân tán trong khoảng 6ml EtOH Đun cách thủy khoảng 10 phút kết hợp siêu âm trong bể siêu âm để đảm bảo các thành phần trong hệ được hòa tan hết Sau đó để nguội từ từ về nhiệt độ phòng, bổ sung EtOH vừa đủ 10,0ml, các thành phần lipid sẽ kết tủa Lấy phần dịch trong lọc qua màng PTFE 0,2µm, pha loãng 2 lần rồi định lượng bằng phương pháp HPLC đã nêu

ở mục 2.3.3.1

- Nồng độ FB toàn phần được tính dựa vào diện tích pic mẫu thử và đường chuẩn đã xây dựng

e Xác định hiệu suất bẫy và khả năng nạp thuốc trong hệ tiểu phân nano lipid

Hiệu suất bẫy thuốc và khả năng nạp thuốc trong hệ NLC chứa FB được xác định thông qua lượng FB tự do trong hệ và lượng FB tổng như sau:

 Xác định lượng FB toàn phần (trong 1,0ml): tiến hành như mục 2.3.3.2.d

 Xác định lượng FB tự do: Hút khoảng 3ml mẫu nano lipid, đem lọc qua cột thẩm tích Nồng độ FB trong dịch lọc được xác định bằng phương pháp HPLC

đã nêu ở mục 2.3.3.1 Từ đó tính được lượng DC tự do

 Xác định khối lượng tiểu phân (trong 1,0ml): dựa theo khối lượng cân dược chất và tá dược thực tế

Công thức tính hiệu suất bẫy:

f Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng in vitro của hệ tiểu phân nano lipid

- Điều kiện thử giải phóng:

+ Môi trường thử: Do tính chất ưa dầu của FB mà người ta luôn gặp khó khăn trong việc lựa chọn một môi trường giải phóng cung cấp đầy đủ các điều kiện hòa tan và ổn định DC Đối với các trường hợp như vậy, môi trường giải phóng được thêm vào CDH hoặc DM có khả năng hòa tan DC nhằm làm tăng độ tan của DC Trong hệ nano lipid chứa FB, môi trường giải phóng có chứa cồn 50% EtOH (v/v) được áp dụng [26]

 Túi thẩm tích (màng RC, kích thước lỗ màng 12 - 14kDa, Spectra/Por@2 - Dialysis membrane - Mỹ)

 Máy khuấy từ, tốc độ khuấy: 100 vòng/phút

 Nhiệt độ môi trường giải phóng: 37 ± 0,5oC duy trì bằng bể điều nhiệt

 Môi trường giải phóng: 200ml môi trường EtOH : nước theo tỉ lệ 1:1 (v/v)

- Cách tiến hành: Vào thời điểm t = 0 giờ, đặt túi thẩm tích có chứa chính xác

1,0ml hệ tiểu phân vào trong môi trường giải phóng Tại các thời điểm t = 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ và 10 giờ hút 1,0ml môi trường và bổ sung ngay 1,0ml môi trường

mới Dịch lấy ra được định lượng bằng phương pháp HPLC theo mục 2.3.3.1

- Xác định % DC giải phóng theo thời gian: Tính nồng độ FB trong môi

trường thử giải phóng tại từng thời điểm dựa vào Spic mẫu thử và đường chuẩn đã xây dựng Tỉ lệ DC giải phóng tại từng thời điểm được tính dựa trên lượng FB đã

giải phóng (gồm lượng FB trong môi trường + lượng FB đã lấy khi hút mẫu) và lượng FB toàn phần đem thử

g Các phương pháp đánh giá độ bền vật lý của hệ

Qua tham khảo tài liệu [7],[8] cùng với điều kiện có sẵn tại bộ môn, tiến hành đánh giá độ bền của mẫu bào chế như sau:

- Điều kiện bảo quản: mẫu sau khi bào chế được nghiên cứu ở 2 điều kiện:

+ Bảo quản liên tục ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Với những mẫu khảo sát ban đầu, một phần sẽ được bảo quản ở trong ngăn mát tủ lạnh (4o

C)

+ Thực hiện 3 chu kì đông - rã, lưu giữ ở mỗi điều kiện ít nhất 5 giờ

- Các mẫu được đánh giá các đặc tính của sản phẩm bao gồm: trạng thái tồn tại, sự xuất hiện tủa, phân bố KTTP (gồm KTTB, PDI và D90) ở các thời điểm: 1 ngày sau bào chế ở điều kiện nhiệt độ phòng, 1 ngày sau thực hiện 3 chu kì đông -

rã Riêng với công thức tối ưu, mẫu được bảo quản sau 3 tuần ở nhiệt độ phòng sẽ

được xác định phân bố KTTP, thế Zeta và thử giải phóng DC in vitro

2.3.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần công thức và lựa chọn công thức bào chế tối ưu

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc., USA) để thiết kế thí nghiệm cổ điển một cách ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm

Xác định các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn công thức bào chế thích hợp bằng phần mềm FormRules v2.0 và INForm v3.2 (Intelligensys LTD., UK), dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG FENOFIBRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.3.1 Kết quả về sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ FB được thể hiện trong bảng 3.1 và được minh họa ở hình 3.1

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ FB

Nồng độ

(µg/ml) 4,8 12,0 24,0 48,0 60,0 72,0 120,0

Spic

(mAU.s) 133,2 319,4 658,9 1325,4 1645,3 2009,7 3373,0

Hình 3.1: Tương quan tuyến tính giữa nồng độ FB và Spic

Nhận xét: Giữa diện tích pic và nồng độ FB có sự tương quan tuyến tính với

nhau trong khoảng nồng độ từ 4,8 - 120,0µg/ml do hệ số tương quan lớn hơn 0,99 Như vậy có thể sử dụng phương pháp HPLC (mô tả ở mục 2.3.3) để định lượng FB

trong hệ nano và trong môi trường thử giải phóng in vitro

3.2 XÁC ĐỊNH CÔNG THỨC BÀO CHẾ CƠ BẢN VÀ THÔNG SỐ KỸ THUẬT CỦA QUÁ TRÌNH BÀO CHẾ

3.2.1 Lựa chọn thành phần trong công thức bào chế

y = 28.14x - 18.06 R² = 0.999

FB thân dầu, bền vững ở nhiệt độ thường, nóng chảy ở nhiệt độ 79 - 82oC nên phù hợp để làm dược chất trong hệ nano lipid bào chế theo phương pháp nhũ hóa - nóng chảy Thành phần của hệ nano lipid chứa FB bao gồm:

- Dược chất

- Thành phần pha dầu: tá dược lipid rắn, tá dược lipid lỏng, CDH thân dầu

- Thành phần pha nước: CDH thân nước, dung môi nước

Với mục đích đánh giá ảnh hưởng của thành phần và tỉ lệ thành phần tới sự hình thành, độ bền và khả năng giải phóng DC từ hệ tiểu phân nên chỉ xét đến các thành phần sau:

Ghi chú: “+”: tan; “-”: không tan

Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy FB hòa tan tốt nhất trong Precirol ATO

5 và Compritol ATO 888 Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu để chọn ra được lipid phù hợp Bào chế hệ tiểu phân theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2 với công thức sau, trong đó tá dược lipid rắn là Precirol ATO 5 hoặc Compritol ATO 888, nhiệt độ pha dầu được cố định ở 80oC để đảm bảo Compritol, Precirol và DC đều nóng chảy hoàn toàn :

Fenofibrat: 0,03g Tween 80: 0,3g

Đo KTTB, PDI và xác định đặc tính của mẫu sau bào chế ở điều kiện nhiệt

độ phòng, chúng tôi nhận thấy mẫu làm từ Compritol có độ bền kém hơn (xuất hiện tủa sau 5 ngày bào chế), KTTB lớn hơn (201,5nm; D90 < 396,1nm) so với mẫu sử dụng Precirol (hệ bền trong thời gian quan sát; KTTB 152,4nm; D90 < 295,3nm), ngoài ra mẫu Compritol dễ gel hóa hơn Điều này có thể giải thích do việc sử dụng chất mang là Compritol có nhiệt độ nóng chảy cao hơn làm tăng độ nhớt của hệ dẫn đến giảm tác động lực phân tán, KTTP lớn [25],[35] Với kết quả đã khảo sát,

chúng tôi lựa chọn tá dược lipid rắn là Precirol ATO 5

Trong hầu hết các trường hợp, nồng độ lipid tổng được lựa chọn từ 5 - 10% Khi tăng tổng lượng lipid lên sẽ dẫn đến tăng lượng thuốc nạp được, tuy nhiên sẽ làm tăng KTTP (thậm chí đến kích thước micro) và giảm độ bền (do quá trình tái kết tinh của lipid), mở rộng khoảng phân bố kích thước [25],[31] Trong nghiên cứu

này, chúng tôi lựa chọn nồng độ Precirol biến thiên trong khoảng 2 - 4% để KTTP

tạo ra nhỏ và đảm bảo độ bền cho hệ

Theo kết quả nghiên cứu đã công bố, sự chuyển dạng thù hình của lipid từ dạng kém bền, có năng lượng cao (dạng α hoặc β’) sang dạng bền vững, có năng lượng thấp hơn (dạng β) là nguyên nhân chính gây nên việc trục xuất thuốc ra ngoài chất mang và khả năng nạp thuốc kém [36] Để hạn chế quá trình này, ngoài việc sử dụng thêm lipid lỏng, chúng tôi phối hợp sử dụng nhiều loại lipid rắn khác nhau Trong điều kiện hóa chất sẵn có cùng với khả năng hòa tan FB trong tá dược, chúng tôi lựa chọn sử dụng thêm Gelot 64 Ngoài ra, do cấu trúc phần thân nước có tính diện hoạt (kết hợp giữa Glyceryl stearat và PEG - 75 stearat) nên Gelot 64 được kỳ vọng có thể tăng giải phóng FB từ hệ nano lipid; đồng thời việc kết hợp nhiều CDH

có thể cản trở sự kết tập của các hạt một cách hiệu quả hơn [25] Khi cho thêm Gelot 64 vào, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ Gelot 64 nhỏ (0,2 - 1,0%) giúp KTTB

hệ nhỏ hơn, PDI nhỏ hơn, giảm váng bề mặt, nhưng khi tăng lên cao (> 1,5%) sẽ

làm giảm độ bền của hệ rất nhiều (mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng và sau 3 chu kì đông - rã có nhiều kết tủa xuất hiện) Nguyên nhân của hiện tượng này có thể do khi dùng nhiều Gelot 64 sẽ làm thay đổi tính chất cốt lipid làm giảm khả năng ổn định của cấu trúc tiểu phân

Lựa chọn nồng độ Precirol ATO 5 là 2,0 - 4,0%; Gelot 64 là 0,0 - 1,0%

3.2.1.2 Tá dược lipid lỏng

Lipid lỏng được sử dụng trong hệ NLC sẽ làm tăng hiệu suất bẫy và khả năng nạp thuốc khi so sánh với hệ SLN Điều này có thể do sự phối hợp giữa các phân tử khác nhau (như các acyl glycerol mạch dài của lipid rắn với các acyl glycerol mạch ngắn của lipid lỏng) dẫn đến sự kết tinh của mạng lưới với nhiều tinh thể không hoàn hảo, giúp chứa được nhiều DC hơn và làm tăng độ bền của hạt [31]

Tiến hành bào chế mẫu với các lipid lỏng khác nhau: Miglyol, acid oleic, IPM theo công thức sau:

Bảng 3.3: So sánh đặc tính của hệ NLC chứa FB khi thay đổi lipid lỏng

Lipid

lỏng

KTTB (nm) PDI

D90 (nm)

Tỉ lệ KTTB

Sự xuất hiện tủa

ở điều kiện nhiệt

độ phòng

sau 3 chu

kì đông-rã

IPM 163,4 0,201 < 295,3 1,92 Có tủa sau 4 ngày Có tủa Acid oleic 214,3 0,283 < 531,2 2,21 Có tủa sau 2 ngày Có tủa