nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp paclitaxel, dihydroartemisinin và polyethylen glycol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THIỆN GIÁP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA PHỨC HỢP PACLITAXEL, DIHYDROARTEMISININ VÀ POLYETHYLEN GLYCOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THIỆN GIÁP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO CHỨA PHỨC HỢP PACLITAXEL, DIHYDROARTEMISININ VÀ POLYETHYLEN GLYCOL LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 Người hướng dẫn khoa học : PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS TS Chul Soon Yong Nơi thực đề tài: Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia Bộ môn Công nghiệp Dược Khoa Dược – Đại học Yeungnam, Hàn Quốc HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành đối với: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS Chul Soon Yong Những người thầy giàu kinh nghiệm đầy nhiệt huyết định hướng, giúp đỡ thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Hải, ThS Phùng Cao Đại thầy cô, anh chị kỹ thuật viên thuộc viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế tạo điều kiện thiết bị, máy móc, hóa chất, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo Phịng ban khác, thầy cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy bảo, tạo điều kiện giúp đỡ hồn thành khóa học trường Cuối cùng, tơi xin cảm ơn chân thành gia đình tơi, bạn bè, đồng nghiệp động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Lê Thiện Giáp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỞNG QUAN 1.1 Tổng quan dihydroartemisinin 1.1.1 Tính chất lý, hóa 1.1.2 Dược động học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.4 Độc tính DHA 1.1.5 Định lượng DHA 1.1.6 Độ ổn định DHA 1.2 Tổng quan Paclitaxel 1.2.1 Tính chất lý, hóa dược chất 1.2.2 Dược động học 1.2.3 Cơ chế tác dụng 1.2.4 Chỉ định 1.2.5 Liều dùng, cách dùng 1.2.6 Một số phương pháp định tính 1.2.7 Một số phương pháp định lượng 1.3 Tổng quan phương pháp PEG hóa ứng dụng bào chế thuốc 1.3.1 Polyethylen glycol 1.3.2 Phương pháp PEG hóa 1.3.3 Một số phương pháp PEG hóa hệ tiểu phân nano 10 1.4 Tổng quan số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro số kết hợp hai thuốc 11 1.4.1 Một số phương pháp xác định độc tính tế bào in vitro 11 1.4.2 Chỉ số kết hợp (Combination index – CI) 13 1.5 Một số nghiên cứu liên quan 14 1.5.1 Một số nghiên cứu hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA 14 1.5.2 Một số nghiên cứu phương pháp PEG hóa 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Nguyên vật liệu 17 2.1.2 Thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol 19 2.2.2 Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano có chứa PTX DHA đánh giá số tiêu 19 2.2.3 Thử tác dụng độc tính tế bào in vitro hệ tiểu phân nano bào chế dòng tế bào HT-29 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol 20 2.3.2 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano có chứa PTX, DHA 22 2.3.3 Các phương pháp đánh giá 22 2.2.4 Phương pháp thử tác dụng chống ung thư in vitro dòng tế bào HT29 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Khảo sát phương pháp định lượng đồng thời DHA PTX 29 3.1.1 Độ đặc hiệu 29 3.1.2 Độ tương thích hệ thống 29 3.1.3 Độ tuyến tính 30 3.2 Kết tổng hợp phức hợp dược chất gắn polyethylen glycol 31 3.2.1 Tổng hợp dẫn chất 2’,7-disuccinylpaclitaxel 31 3.2.2 Tổng hợp liên hợp PEG ART 33 3.2.3 Tổng hợp phức hợp hai dược chất gắn polyethylen glycol 35 3.3 Bào chế tiểu phân nano chứa đồng thời paclitaxel dihydroartemisinin 37 3.3.1 Bào chế tiểu phân nano chứa phức hợp PPD 37 3.3.2 Bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp PPD DHA, PTX 38 3.3 Đánh giá số tính chất hệ tiểu phân nano PTX – DHA lựa chọn 42 3.3.1 Xác định hàm lượng dược chất nạp vào hệ nano 42 3.3.2 Đánh giá độ hòa tan in vitro hệ tiểu phân nano lựa chọn 42 3.3.3 Đánh giá hình thái cấu trúc hệ tiểu phân nano bào chế kính hiển vi điện tử truyền qua 43 3.5 Kết đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro 44 3.5.1 Kết đánh giá độc tính tế bào 44 3.5.2 Xác định hệ số kết hợp hai thuốc 45 3.5.3 Đánh giá khả nạp thuốc vào tế bào 46 PHẦN IV: BÀN LUẬN 47 4.1 Về phương pháp tổng hợp dẫn chất PPD 47 4.1.1 Về phản ứng tổng hợp dẫn chất 2’,7-disuccinylpaclitaxel 47 4.1.2 Về phản ứng tổng hợp dẫn chất DHA-suc-PEG PPD 48 4.2 Về bào chế hệ tiểu phân nano phức hợp chứa hai dược chất DHA PTX 49 4.2.1 Về ảnh hưởng thể tích pha ngoại (tỷ lệ pha dầu/pha nước) 49 4.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dược chất/chất mang 49 4.2.3 Ảnh hưởng lecithin 50 4.2.4 Ảnh hưởng chất ổn định pha nước 51 4.3 Về tác dụng chống ung thư in vitro hệ tiểu phân nano 52 4.3.1 Về việc kết hợp hai dược chất 52 4.3.2 Về việc dung nạp thuốc vào tế bào 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Cách viết tắt Thuật ngữ ACN Acetonitril CI Combination index Giải thích Chỉ số kết hợp Dược chất DC DCC Dicyclohexyl carbodiimid DCM Dicloromethan DIC N,N’-Diisopropylcarbodiimid DHA Dihydroartemisinin DMAP 4-dimethylamino pyridin DMSO Dimethyl sulfoxid EE Encapsulation efficiency Hiệu suất nano hóa thuốc FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm FT-IR Fourier Transform Infraced Spectroscopy Phổ hồng ngoại biến đổi HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao Kl/tt Khối lượng/thể tích KTTP Kích thước tiểu phân trung bình Tỷ lệ thuốc nano hóa LC Drug loading capacity MTS (5-(3-carboxymethoxyphenyl)2-(4,5-dimethyl-thiazoly)-3-(4sulfophenyl) tetrazolium OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate bufferred saline Đệm phosphat đẳng trương PDI Polydispersity index Chỉ số đa phân tán PEG Poly ethylen glycol PLGA Acid poly (lactic-co-glycolic) PMS Phenazine methosulfate PPD Paclitaxel-PEGDyhyroartemisinin complex PTX Paclitaxel PVA Polyvinyl alcol RSD Relative standard deviation SA Anhydrid succinic SKLM Phức hợp PTX-PEG-DHA Độ lệch chuẩn tương đối Sắc kí lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng DHA 44 Bảng 3.1 Kết chạy sắc kí hai dược chất 29 Bảng 3.2 Kết độ tương tích hệ thống 29 Bảng 3.3 Mối tương quan diện tích pic - nồng độ DHA PTX 30 pha động Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thực đến hiệu suất 32 phản ứng tổng hợp chất (1) Bảng 3.5 Ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất phản ứng tổng 34 hợp chất (2) Bảng 3.6 Bảng công thức bào chế hệ nano chứa phức hợp PTX- 37 PEG-DHA Bảng 3.7 Các công thức bào chế nano với tỷ lệ DC/chất mang khác 38 Bảng 3.8 Ảnh hưởng lượng lecithin pha dầu đến đặc tính tiểu 39 phân hệ tiểu phân nano phức hợp Bảng 3.9 Ảnh hưởng loại chất ổn định pha nước đến đặc tính tiểu 40 phân hệ tiểu phân nano Bảng 3.10 Ảnh hưởng tỷ lệ pha dầu/pha nước đến đặc tính vật lý hệ 41 tiểu phân nano với tỷ lệ khác pha dầu/pha nước Bảng 3.11 Hàm lượng dược chất nạp vào hệ nano 42 Bảng 3.12 Chỉ số kết hợp DHA PTX tỉ lệ khác 45 41 Zhang X., Qiao H., Liu J., et al (2010), "Dihydroartemisinin loaded nanostructured lipid carriers (DHA-NLC): Evaluation of pharmacokinetics and tissue distribution after intravenous administration to rats", Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 65(9), pp 670-678 42 Zhao L., Au J.L.-S., Wientjes M.G (2010), "Comparison of methods for evaluating drug-drug interaction", Frontiers in bioscience (Elite edition), 2, pp 241 43 Zhu k., Fan Q., Zhang x.-s., et al (2007), "HPLC quantitative determination of dihydroartemisinin in dihydroartemisinin and piperaquine phosphate tablets", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 27(9), pp 1484-1486 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh sắc kí đồ mẫu chuẩn đơn thành phần chuẩn hỗn hợp Phụ lục 2: Dữ liệu phổ thể cấu trúc chất Phụ lục 3: Dữ liệu phổ thể cấu trúc chất Phụ lục 4: Dữ liệu phổ thể cấu trúc PPD Phụ lục 5: Hình ảnh thể phân bố hệ tiểu phân nano chứa hai dược chất thể chuột nude Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ mẫu chuẩn đơn thành phần chuẩn hỗn hợp Hình PL 1.1 Sắc kí đồ mẫu chuẩn DHA Hình PL 1.2 Sắc kí đồ mẫu chuẩn PTX Hình PL 1.3 Sắc kí đồ mẫu placebo Hình PL 1.4 Sắc kí đồ mẫu chuẩn hỗn hợp DHA PTX Phụ lục 2: Dữ liệu phổ thể cấu trúc chất I hình ảnh phổ MS, IR, 1H-NMR 13C-NMR Hình PL 2.1 Phổ MS positive chất Hình PL 2.2 Phổ MS negative chất 100 98 1580.31 96 918.36 1491.34cm-1 94 947.04 637.11cm-1 802.89 1532.50cm-1 1024.48 92 980.84cm-1 %T 1647.19 90 2946.49cm-1 1416.74cm-1 709.04cm-1 1068.72cm-1 3481.54cm-1 88 1113.20cm-1 1372.18cm-1 86 1314.39 84 1177.04cm-1 1246.01cm-1 82 1203.46 1730.74cm-1 80 79 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 cm-1 Hình PL 2.3 Phổ IR chất Hình PL 2.4 Phổ 1H-NMR chất 1000 750 500 450 Hình PL 2.5 Phổ 13C-NMR chất II Chi tiết liệu phổ  Phổ MS (MeOH), m/z: 1054,2 [M+H]+; 1052,4 [M-H]- (CTPT C55H59NO20, KLPT 1054,06 đvC)  Phổ FT-IR (KBr), ν̅ (cm-1): 3481 (O-H); 2946 (C-H no); 1730 (C=O); 1647, 1532, 1491 (C=C); 1246, 1203 (C-O)  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 9,23 (1H, d, J = 8,5 Hz); 7,98 (2H, d, J = 7,5 Hz); 7,86 (2H, d, J = 7,5 Hz); 7,67 (2H, t, J = 7,5 Hz); 7,577,44 (7H, m); 7,22-7,19 (1H, m); 6,04 (1H, s); 5,81 (1H, d, J = 9,0 Hz); 5,52 (1H, t, J = 9,0 Hz); 5,43-5,35 (3H, m); 4,95 (1H, d, J = 9,5 Hz); 4,71 (1H, s); 4,04 (2H, s); 3,67 (1H, d, J = 7,0 Hz); 2,66-2,58 (3H, m); 2,50 (8H, s); 2,24 (3H, s); 2,10 (3H, s); 1,80-1,75 (1H, m); 1,68 (6H, m); 1,53-1,48 (1H, m); 1,05-0,98 (6H, m)  Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 206,76; 201,62; 173,52; 173,30; 172,92; 171,70; 168,86; 166,47; 165,21; 140,10; 137,34; 134,30; 132,45; 131,46; 129,77; 129,57; 128,70; 128,32; 127,38; 82,78; 79,73; 76,64; 75,10; 74,57; 74,06; 71,08; 70,55; 55,22; 54,06; 46,06; 42,90; 28,96; 28,77; 28,50; 28,43; 26,19; 22,45; 21,19; 20,43; 13,88; 10,52 Phụ lục 3: Dữ liệu phổ thể cấu trúc chất Hình PL 3.1 Phổ MS chất Hình PL 3.2 Phổ FT-IR chất Hình PL 3.3 Phổ 1H-NMR chất Hình PL 3.4 Phổ 13C-NMR chất Chi tiết liệu phổ  Phổ MS (MeOH), m/z: 759,13; 803,15; 847,06 [M+Na]+ (CTPT C21+2nH32+4nO9+n, KLPT 736,39; 780,41; 824,44 đvC tương ứng với n =7,8,9)  Phổ FT-IR (KBr) ν̅ (cm-1): 3371, 3336 (O-H); 2966, 2926, 2872 (C-H no, dao động hóa trị); 1739, 1701 (C=O); 1456, 1379 (C-H no, dao động biến dạng); 1159, 1130, 1097, 1012 (C-O)  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 8,78 (1H, d, J = 4,5 Hz); 8,36 (1H, t, J = 8,0 Hz); 8,15 (1H, d, J = 7,5 Hz); 7,86 (1H, m); 5,58 (1H, d, J = 10,0 Hz); 5,47 (1H, s); 4,22 (1H, t, J = 6,5 Hz); 4,04 (1H, m); 3,99-3,95 (1H, m); 3,73-3,67 (2H, m); 3,57-3,32 (37H, m); 2,58-2,56 (1H, m); 2,50-2,48 (1H, m); 2,22-2,19 (1H, m); 2,12-2,07 (1H, m); 1,93-1,89 (1H, m); 1,74-1,71 (1H, m); 1,56-1,45 (3H, m); 1,37-1,33 (2H, m); 1,26-1,22 (1H, m); 1,20 (3H, s); 1,12-1,07 (5H, m); 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz); 0,890,85 (1H, m); 0,68 (3H, d, J = 7,0 Hz)  Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 172,25; 171,54; 171,33; 169,10; 157,30; 153,78; 144,50; 144,18; 126,99; 104,05; 92,28; 92,16; 91,07; 80,34; 72,81; 70,26; 70,19; 68,67; 64,00; 60,68; 60,55; 51,60; 45,06; 45,04; 42,91; 41,14; 36,44; 34,18; 29,44; 25,98; 24,66; 23,76; 22,15; 21,48; 20,75; 20,52; 14,52; 12,21; 12,17 Phụ lục 4: Dữ liệu phổ thể cấu trúc chất Hình PL 4.1 Phổ MS phức hợp PPD Hình PL 4.2 Phổ FT-IR phức hợp PPD Hình PL 4.3 Phổ 1H-NMR phức hợp PPD Hình PL 4.4 Phổ 13C-NMR phức hợp PPD Chi tiết liệu phổ  Phổ MS (MeOH), m/z: 1817,20 [M+H]+ (CTPT C76+2nH89+4nNO28+n, KLPT 1816,95 đvC (n=8))  Phổ FT-IR (KBr), ν̅ (cm-1): 3566 (O-H); 2970, 2902 (C-H no, dao động hóa trị); 1741 (C=O); 1645, 1529 (C=C); 1452, 1371 (C-H no, dao động biến dạng); 1236, 1143, 1066, 1018 (C-O)  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 7,88-7,31 (15H, m, H thơm); 7,10 (1H, s, NH); 5,96 (1H, s); 5,72 (1H, s); 5,58 (1H, d, J = 10,0 Hz); 5,45 (1H, s); 5,44-5,23 (4H, m); 4,86 (1H, brs); 4,63 (1H, s); 4,05-4,03 (2H, m); 3,94 (3H, s); 3,57-3,50 (10H, m); 3,34-3,32 (12H, m); 3,08 (10H, s); 2,59-2,52 (6H, m); 2,42 (4H, m, CH3); 2,24-2,13 (7H, m); 2,07-1,92 (5H, m); 1,71-1,44 (13H, m); 1,19-1,18 (3H, m, CH3); 0,96-0,89 (8H, m); 0,79 (3H, d, J = 6,0 Hz, CH3); 0,68 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3)  Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 202,20; 172,37; 171,33; 170,82; 166,82; 165,72; 130,05; 129,20; 128,83; 128,11; 127,90; 127,85; 104,09; 92,31; 91,09; 80,33; 77,11; 75,04; 72,75; 70,23; 70,17; 68,65; 64,00; 60,67; 55,65; 51,57; 49,06; 45,02; 43,38; 36,48; 36,34; 32,07; 29,07; 28,79; 25,95; 20,91; 20,49; 14,49; 14,35; 12,14; 11,06; 10,99 Phụ lục 5: Hình ảnh thể phân bố hệ tiểu phân nano chứa hai dược chất thể chuột nude Hình PL Hình ảnh phân bố hệ tiểu phân nano chứa đồng thời PTX DHA chế chuột nude ... gắn polyethylen glycol 35 3.3 Bào chế tiểu phân nano chứa đồng thời paclitaxel dihydroartemisinin 37 3.3.1 Bào chế tiểu phân nano chứa phức hợp PPD 37 3.3.2 Bào chế hệ tiểu phân nano chứa. .. hệ tiểu phân nano có chứa PTX DHA đánh giá số tiêu - Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp DHA-PEG-PTX - Tiến hành bào chế hệ tiểu phân nano chứa DHA PTX sử dụng chất mang phức hợp. .. đề tài ? ?Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano chứa phức hợp paclitaxel, dihydroartemisinin polyethylen glycol? ?? tiến hành với mục tiêu sau: Tổng hợp phức hợp paclitaxel, dihydroartemisinin polyethylen