Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy dị ghép tế bào gốc tạo máu. 20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy và người cho tế bào gốc tạo máu.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT CHIMERISM TRÊN BỆNH NHÂN DỊ GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR STR Cao Sỹ Ln*, Phan Thị Xinh*,** TĨM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) dị ghép tế bào gốc tạo máu (TBGTM). Đối tượng và phương pháp: 20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của BN BCCDT và người cho TBGTM. Thực hiện phản ứng multiplex PCR Short Tandem Reapeat (STR) để xác định các dấu ấn STR có giá trị theo dõi điều trị sau ghép và tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT dị ghép TBGTM. Kết quả: Trong 18 STRs, chúng tơi đã xác định được 4 dấu ấn STR có giá trị theo dõi điều trị sau ghép trên cặp người cho‐người nhận là CMR‐04 và 5 dấu ấn STR đối với các cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03. Đồng thời, xác định được tỷ lệ chimerism của các BN sau ghép tại nhiều thời điểm khác nhau. Ngồi ra, kết quả chimerism tương đồng với kết quả xác định giới tính bằng kỹ thuật FISH trong trường hợp người cho‐người nhận khác giới tính. Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR, giúp theo dõi việc mọc mảnh ghép trên BN dị ghép TBGTM tại Bệnh viện truyền máu huyết học. Từ khóa: bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT), short tandem repeat (STR), chimerism, tế bào gốc tạo máu (TBGTM). ABSTRACT DETECTION OF CHIMERISM IN ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION USING MULTIPLEX STR‐PCR Cao Sy Luan, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 169 ‐ 174 Purpose: To detect chimerism in acute myeloid leukemia (AML) patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Material and Methods: Twenty bone marrow or peripheral blood samples of AML patients and donors were collected. Using a commercial multiplex PCR amplification of fluorescent labeled short tandem repeat (STR) markers to detect informative STRs and analyze chimerism after allogeneic HSTC. Result: Among 18 STRs, we found 4 informative STRs in CMR‐04, 5 informative STRs in CMR‐01 and CMR‐02, 6 informative STRs in CMR‐03. Simultaneously, patient/donor cell chimerism was detected at several times during the post‐transplant period. Moreover, the result of chimerrism analysis by STR‐ PCR‐based is similar to result of FISH‐based in cases sex‐mismatched transplantation. Conclusion: We successfully established the procedure of chimerism analysis by using multiplex STR‐ PCR to help monitoring engraftment in patient after allogeneic HSTC in Blood Transfusion and Hematology hospital Key words: acute myeloid leukemia (AML), short tandem repeat (STR), chimerism, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Bệnh viện Truyền máu‐Huyết học TP.HCM ** Đại học Y Dược TP.HCM. Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Email: phanthixinh@yahoo.com * 170 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Trong điều trị các bệnh lý ác tính về máu thì dị ghép tế bào gốc tạo máu (TBGTM) là một trong những phương pháp hiệu quả và ưu tiên được lựa chọn cho bệnh nhân (BN), đặc biệt đối với BN thuộc nhóm tiên lượng trung bình và xấu hoặc BN tái phát sau điều trị hóa trị liệu. Việc xác định tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận hay còn gọi là chimerism để qua đó đánh giá việc mọc mảnh ghép là thành cơng hay thất bại là một trong những bước cần thiết của dị ghép tủy. Để đánh giá việc mọc mảnh ghép thì có thể dựa trên cơ sở là sự khác nhau về giới tính, nhóm máu, HLA hay các dấu ấn phân tử như Short Tandem Reapeat (STR) và Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Hiện nay, có 3 kỹ thuật di truyền học phân tử để xác định chimerism là kỹ thuật FISH (u cầu phải có sự khác biệt về giới tính giữa người cho và người nhận), PCR khuếch đại các đoạn STR và SNP. Trong đó, kỹ thuật PCR khuếch đại các đoạn STR để xác định tỷ lệ chimerism được sử dụng ngày càng phổ biến với ưu điểm là độ nhạy cao, khả năng ứng dụng rộng và chỉ cần một lượng mẫu nhỏ để phân tích(8). STR là những trình tự ngắn DNA trên nhiễm sắc thể với chiều dài thường từ 2‐6 bp và có tính lặp lại. Có nhiều loại STR khác nhau: dinucleotide, trinucleotide, tetranucleotide, pentanucleotide và hexanucleotide. Có hơn 20.000 tetranucleotide STR được xác định ở người(2). STR chiếm khoảng 3% trong tổng bộ gen người(5). Có nhiều kiểu sắp xếp các STR với nhau, hoặc là lặp lại nhiều STR của cùng một kiểu hoặc là lặp lại của nhiều kiểu STR khác nhau. Sự khác nhau về kích thước của các STR trên mỗi cá nhân khác nhau là do khác nhau về số đơn vị lặp lại. Do đó, các STR có thể được xem như là dấu ấn để phân biệt giữa các cá thể với nhau. Vì vậy, với những ưu điểm là tính đa hình cao, kích thước nhỏ nên các STR thường được sử dụng để xác định chimerism bằng kỹ thuật PCR(6). Có nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng multiplex PCR khuếch đại các STR có gắn 170 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 huỳnh quang để xác định nhanh các STR mang thơng tin, tức là các STR có sự khác nhau về kích thước giữa người cho và người nhận(9). Hiện nay, PCR khuếch đại các STR có gắn huỳnh quang được xem như là tiêu chuẩn vàng để xác định chimerism sau ghép và kết quả đánh giá việc mọc mảnh ghép rất khả quan(1). ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của BN bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và người cho TBGTM tương ứng được thu thập tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) TP. HCM từ tháng 5/2013 đến tháng 7/2013. Trong đó, có 4 mẫu máu ngoại vi của 4 BN BCCDT trước ghép và 4 mẫu máu của 4 người cho TBGTM tương ứng, 12 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của người bệnh sau ghép tại các thời điểm khác nhau. Các cặp ghép này được đặt tên mã nghiên cứu là CMR‐01, CMR‐02, CMR‐03 và CMR‐04. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mơ tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới. Phương pháp tiến hành Ly trích DNA từ mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi bằng GenElute blood genomic DNA kit (Sigma, Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm. Thực hiện phản ứng multiplex PCR với 18 cặp mồi (bảng 1) bằng PowerPlex 18D system kit (Promega, Mỹ). Lượng DNA dùng cho phản ứng multiplex PCR là 10ng và chương trình ln nhiệt gồm 96oC trong 2 phút, 26 chu kỳ của 94oC trong 10 giây và 60oC trong 1 phút, hồn thành ở 60oC trong 20 phút trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ). Bảng 1: Danh sách 18 kiểu dấu ấn STR của kit PowerPlex 18D system Màu Loại STR huỳnh quang Kích thước sản phẩm PCR Số kiểu đơn vị lặp lại Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Màu Loại STR huỳnh quang Kích thước sản phẩm PCR Số kiểu đơn vị lặp lại 5-24 Penta E FL 379-474 D18S51 FL 286-366 D21S11 FL 203-259 7-10, 10.2, 11-13, 13.2, 14-27 24, 24.2, 25, 25.2, 2628, 28.2, 29, 29.2,30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36-38 TH01 FL 152-195 3-9, 9.3, 10-11,13.3 D3S1358 FL 103-147 9-20 FGA TMR-ET 314-460 14-18, 18.2, 19, 19.2, 20, 20.2, 21, 21.2, 22, 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2, 25, 25.2, 26-30, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 48.2, 50.2 TPOX TMR-ET 265-293 6-13 D8S1179 TMR-ET 203-251 7-19 TMR-ET 127-183 10-24 Amelogeni TMR-ET n 109, 115 X, Y vWA Penta D JOE 376-449 2.2, 3.2, 5-17 CSF1PO JOE 321-357 6-15 D16S539 JOE 264-304 5, 8-15 D7S820 JOE 218-250 6-14 D13S317 JOE 176-208 7-15 D5S818 JOE 122-158 7-16 223-295 10, 12, 14-28 163-215 5.2, 6.2, 8-12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2 D2S1138 CXR-ET D19S443 CXR-ET Hỗn hợp dung dịch điện di gồm 10μl Hi‐Di, 1μl ILS500 và 1μl sản phẩm PCR được biến tính ở 960C trong 3 phút và sốc nhiệt ở 00C trong 3 phút trước khi tiến hành điện di mao quản bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐4 polymer và capillary 36 cm (Applied Biosystems). Kết quả điện di được phân tích bằng phần mềm GeneMapper. Kết quả điện di mẫu DNA của người cho TBGTM và BN trước ghép sẽ được phân tích để chọn ra các kiểu dấu ấn STR mang thơng tin, có giá trị theo dõi điều trị sau ghép, còn đối với kết Nghiên cứu Y học quả điện di mẫu DNA của BN sau ghép thì sử dụng diện tích vùng đỉnh của các dấu ấn STR này để xác định tỷ lệ chimerism. Mỗi một dấu ấn STR mang thơng tin sẽ được sử dụng để tính một tỷ lệ chimerism tương ứng. Tỷ lệ chimerism của BN sau ghép là trung bình tỷ lệ chimerism từng dấu ấn STR. Các dấu ấn STR được sử dụng để phân tích chimerism phải thỏa mãn các tiêu chuẩn là phải có ít nhất một allele khác nhau về kích thước giữa người cho và người nhận, khoảng cách giữa 2 allel tối thiểu là hai đơn vị lặp lại. Đồng thời, chiều cao các đỉnh của các STR khi điện di phải >50 RFU và không vượt quá thang đo RFU(7). Tỷ lệ chimerism được tính theo cơng thức sau: Trong đó: ‐ ∑D: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu ấn STR mang thơng tin ở người cho ‐ ∑R: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu ấn STR mang thơng tin ở người nhận KẾT QUẢ Với lượng mẫu DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR là 10ng cho kết quả là chiều cao các đỉnh của người cho và người nhận trước ghép cũng như của người nhận sau ghép đều trong tiêu chuẩn cho phép, thỏa điều kiện là chiều cao tối thiểu >50 RFU và không vượt quá thang đo RFU. Đối với mẫu trước ghép chúng tơi xác định được 4 dấu ấn STR mang thơng tin trên cặp người cho‐người nhận có mã số là CMR‐04, 5 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03. Đối với mẫu sau ghép, chúng tơi xác định được tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT sau ghép ở những thời điểm khác nhau (bảng 2). Trong 4 cặp người cho‐người nhận thì cặp CMR‐02 và CMR‐04 là dị ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA, còn cặp CMR‐03 và CMR‐01 là dị ghép TBGTM thuận hợp HLA hồn tồn. 171 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học Bảng 2: Kết quả chimerism của BN BCCDT sau ghép TBGTM Mã BN CMR-02 CMR-04 CMR-03 CMR-01 (%) (%) (%) (%) Ngày sau ghép Ngày 58,45 60,43 Ngày 14 95,50 100,00 Ngày 21 100,00 98,10 99,59 Ngày 28 98,09 100,00 Ngày 35 100,00 100,00 100,00 Đối với BN CMR‐02 sau ghép 7 ngày, dựa trên diện tích vùng đỉnh của 5 kiểu dấu ấn STR mang thơng tin chúng tơi tính được tỷ lệ chimerism của từng kiểu dấu ấn STR và tỷ lệ chimerism trung bình là 58,45% (bảng 3). Hệ thống STR CSF1PO Allele (D) Penta E Allele (R) Diện tích peak 3609 11 3080 Diện tích peak Allele (R) 12 3792 16 3283 10 8777 11 11 14060 12 5501 12 TPOX 14 1816 15 15 3575 8 12094 11 4467 CMR (%) 61.47 55.49 6430 18 FGA CMR (%) 2264 D8S1179 Bảng 3: Kết quả chimerism của BN CMR‐02 sau ghép 7 ngày Hệ thống STR Allele (D) 59.01 4848 22 22 6901 23 2626 64.86 Tỷ lệ CMR trung bình (%): 58.45 51.40 Người cho Da1 Da1 Người nhận Ra1 Ra1 Người nhận sau ghép Ra1 D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Da1 Ra1 Da1 Penta E Hình 1: Kết quả diện di một số dấu ấn STR của người cho, người nhận trước và sau ghép ngày 7 trên BN CMR‐02 172 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học Nghiên cứu Y học Trong hình 1 là kết quả của 5 trên 18 dấu ấn STR của người cho, người nhận trước và sau ghép ngày 7 trên BN CMR‐02. Chúng ta có thể thấy trong 5 dấu ấn STR (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51 và Penta E) thì chỉ có Penta E là dấu ấn mang thơng tin và đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho mục đích phân tích chimerism. Kết quả cũng cho thấy ở người bệnh sau ghép ngày 7 thì vừa xuất hiện những đỉnh đặc trưng của người cho và người nhận. BÀN LUẬN Lượng DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR là 10 ng, với kết quả chiều cao các đỉnh thu được của người cho, người nhận trước và sau ghép đều đạt tiêu chuẩn. Kết quả này chứng tỏ 10 ng là lượng DNA phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex PCR STR cho mục đích xác định tỷ lệ chimerism trên BN dị ghép TBGTM. Kết quả chimerism trong bảng 2 cho thấy tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận tăng dần theo thời gian đối với trường hợp dị ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA. Chẳng hạn, đối với CMR‐02 sau ghép 7 ngày thì tỷ lệ chimerism là 58,45%, tới ngày 14 thì tỷ lệ này là 95,5% và đến ngày 21 thì đạt 100%. Trong khi đó, đối với trường hợp dị ghép TBGTM thuận hợp HLA hồn tồn thì tỷ lệ này là gần 100% ở các thời điểm khác nhau sau ghép. Theo nghiên cứu của Dodero A và cộng sự thì tỷ lệ chimerism trong máu ngoại vi sau ghép 30 ngày trên hầu hết BN (92%) đạt >95%(3). Tương tự, trong một nghiên cứu khác của Doney KC và cộng sự khi đánh giá chimerism tại ngày 28 sau ghép thì 45/47 BN có tỷ lệ chimerism trong tủy là > 90%(4). Do đó, Từ các kết quả chimerism sau ghép trên 4 BN có thể đưa ra nhận định là bước đầu mảnh ghép đã mọc tốt trong cơ thể BN sau ghép. Đồng thời, kết quả chimerism dựa trên PCR các dấu ấn STR và FISH trong bảng 4 cũng cho thấy có sự tương đồng về tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận sau ghép giữa hai kỹ thuật. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, đối với ca CMR‐02 sau ghép ngày 14 thì tỷ lệ chimerism 172 Chun Đề Truyền Máu – Huyết Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 được xác định bởi kỹ thuật multiplex PCR STR là 95,5% tương ứng với kết quả FISH cũng là 95,5% hay sau ghép ngày 21 thì cả hai kỹ thuật cũng đều cho kết quả là 100%. Tương tự, kết quả chimerism đối với ca CMR‐04 được xác định bằng kỹ thuật multiplex PCR STR và FISH sau ghép ngày 14 lần lượt là 100% và 98% hay sau ghép ngày 21 là 98,1% và 97,5%. Điều này chứng tỏ việc xác định tỷ lệ chimerism bằng kỹ thuật PCR STR là một kỹ thuật đáng tin cậy để theo dõi tiến triển của việc mọc mảnh ghép trên BN BCCDT sau dị ghép TBGTM. Ngồi ra, trong 4 cặp BN di ghép TBGTM thì chỉ có 2 cặp có thể sử dụng kỹ thuật FISH để đánh giá việc mọc mảnh ghép, là 2 cặp mà người cho và người nhận có sự khác biệt về giới tính. Trong khi đó, kỹ thuật multiplex PCR STR thì có thể đánh giá được trên cả 4 cặp BN mà cần khơng quan tâm người cho và người nhận có cùng giới tính hay không. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng rộng của dấu ấn STR và một lần nữa khẳng định giá trị của kỹ thuật multiplex PCR STR trong việc xác định chimerism. Bảng 4: Kết quả chimerism và FISH của BN BCCDT sau ghép TBGTM Mã BN CMR-02 CMR-04 Ngày CMR(%) FISH(%) CMR(%) FISH(%) sau ghép Ngày 58,45 60,43 Ngày 14 95,50 95,50 100,00 98,00 Ngày 21 100,00 100,00 98,10 97,50 Ngày 28 98,09 Ngày 35 100,00 100,00 100,00 KẾT LUẬN Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR. Kết quả nghiên cứu giúp xác định tỷ lệ chimerism trên BN sau ghép. Qua đó, góp phần hỗ trợ đánh giá tiến triển của việc mọc mảnh ghép cũng như dự đốn sự thành cơng hay khả năng thải ghép trên BN BCCDT dị ghép TBGTM được hiệu quả hơn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Nghiên cứu Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO Bader P, Niethammer D, Willasch A, et al (2005). How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplantation; 35, 107–119. Collins JR, Stephens RM, Gold B, et al (2003). An exhaustive DNA micro‐satellite map of the human genome using high performance computing. Genomics; 82, 10‐19. Dodero A, Carniti C, Raganato A, et al (2009). Haploidentical stem cell transplantation after a reduced‐intensity conditioning regimen for the treatment of advanced hematologic malignancies: posttransplantation CD8‐depleted donor lymphocyte infusions contribute to improve T‐cell recovery. Blood ; 113, 4771‐4779. Doney KC, Loken MR, Bryant EM, et al (2008). Lack of utility of chimerism studies obtained two to three months after myeloablative haematopoietic cell transplantation for acute lymphocytic leukaemia. Bone Marrow Transplant; 42, 271– 274. Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409, 860‐921. Lawler M, Humphries P, McCann SR (2009). Evaluation of mixed chimerism by in vitro amplification of dinucleotide repeat sequences using the polymerase chain reaction. Blood; 77,2504–2514. Lion T, Watzinger F, Preuner S, et al (2012). The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia; 26, 1821 – 1828. Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G (2004). Evaluation of STR informativity for chimerism testing ‐ comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor recipient pairs. Leukemia; 18, 248–254. Thiede C, Florek M, Bornhauser M, et al (1999). Rapid quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat dấu ấns and fluorescence detection. Bone Marrow Transplant ; 23, 1055– 1060. Ngày nhận bài báo: Ngày 30 tháng 7 năm 2013 Ngày phản biện: ngày 09 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013 173 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học ... ĐẶT VẤN ĐỀ Trong điều trị các bệnh lý ác tính về máu thì dị ghép tế bào gốc tạo máu (TBGTM) là một trong những phương pháp hiệu quả và ưu tiên được lựa chọn cho bệnh nhân (BN), đặc biệt đối ... 95,5% hay sau ghép ngày 21 thì cả hai kỹ thuật cũng đều cho kết quả là 100%. Tương tự, kết quả chimerism đối với ca CMR‐04 được xác định bằng kỹ thuật multiplex PCR STR và FISH sau ghép ... chứng tỏ 10 ng là lượng DNA phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex PCR STR cho mục đích xác định tỷ lệ chimerism trên BN dị ghép TBGTM. Kết quả chimerism trong bảng 2 cho thấy tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận