Mục tiêu nghiên cứu của bài viết là mô tả tỷ lệ xuất hiện một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát. Bước đầu xác định mối liên quan giữa một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 với vô sinh nam.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI GEN NAT2 VÀ GSTP1 MÃ HĨA ENZYM CHUYỂN HĨA XENOBIOTIC NAM GIỚI VƠ SINH Vũ Thị Huyền*; Nguyễn Thị Trang*; Uông Ngọc Nguyên*; Trần Đức Ph n* TÓM TẮT Mục tiêu: khảo sát đột biến GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) liên quan gây vô sinh (VS) nam Đối tượng phương pháp:ADN 200 đối tượng nghiên cứu (100 nam giới VS 100 người bình thường) nhân lên xác định đột biến gen kỹ thuật ARMS - PCR Kết quả: kiểu gen CT TT gen NAT2 (481C>T), (OR 3,12; 95%CI: 1,72 - 5,68, p < 0,001) GA + AAcủa gen GSTP1(G313A) (OR 5,25; 95%CI: 2,71 - 10,19, p < 0,001) có nguy cao gây VS nam Kết luận: nghiên cứu thí điểm cho thấy đa hình GSTP1 (G313A) vàNAT2 (481C>T) dấu hiệu di truyền liên quan với stress oxy hóa tình trạng VS ngun phát * Từ khóa: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Vô sinh nam; Đột biến Identification of Genetics Polymorphism of Xenobiotic Metabolic Enzymes NAT2 and GSTP1 in Infertile men by ARMS-PCR Method Summary Objectives: To investigate whether two common single-nucleotide polymorphisms (SNP) of the NAT2 gene (481C>T (L161L) and GSTP1 (313G>A (I105V)) were associated with susceptibility to male infertility Subjects and methods: A total 200 DNA samples (100 infertile patients and 100 fertile men) were genotyped for the polymorphisms by ARMS - PCR Results: There was a significant association between the NAT2 variant genotypes (CT + TT (481C>T), (OR 3.12; 95%CI: 1.72 - 5.68, p< 0.001) and or NAT2 variant genotypes GSTP1 (G313A), (OR 2.95; 95%CI: 1.51 - 5.79, p < 0.001) with idiopathic infertility risk Conclusions: This pilot study found that the polymorphisms GSTP1 (481C>T) and NAT2 (590G>A) were some novel genetic markers for susceptibility to idiopathic male infertility, but the risk is potentiated by exposure to various environmental oxidants * Keyworks: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Infertile men; Mutation ĐẶT VẤN ĐỀ Vơ sinh nói chung VS nam giới nói riêng vấn đề sức khỏe sinh sản, gây ảnh hưởng lớn tới chất lượng sống nhiều cặp vợ chồng toàn giới Một nguyên nhân gây VS mà đề cập nhiều cân chuyển hóa chất thể, có chuyển hóa xenobiotic * Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Vũ Thị Huyền (drhuyenvu@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 29/08/2017 Ngày báo đăng: 05/09/2017 292 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Xenobiotic chất hóa học lạ thể, bao gồm chất đưa vào thể hàng ngày thuốc, rượu, thuốc lá, mỹ phẩm, chất bảo quản, thuốc bảo vệ thực vật Khi trình chuyển hóa xenobiotic trạng thái cân giúp thể đào thải, khử độc tránh tác động không tốt xenobiotic thể [1 Khi q trình chuyển hóa xenobiotic bị rối loạn, xuất tình trạng tích tụ xenobiotic sản phẩm chuyển hóa chúng thể, bao gồm gốc tự khơng có lợi Đó nguyên nhân gây nhiều bệnh, có VS [2] Trong q trình chuyển hóa xenobiotic, NAT2 GSTP1 gen có vai trò quan trọng việc mã hóa enzym liên quan đến biến đổi xenobitic giai đoạn II, biến đổi thành chất dễ thải trừ môi trường Gen GSTP1 nằm NST 11q13.3 có số alen phổ biến GSTP1*A, GSTP1*B, GSTP1*C, GSTP1*D Thay G thành A vị trí 313 exon dẫn đến làm thay axít amin isoleucin thành valin vị trí 105 Đột biến điểm exon ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu enzym GSTP1[3 Gen Arylamine N-acetyltransferase (NAT2) nằm NST số (8p22), gen mã hóa enzym NAT2 giai đoạn II chuyển hóa xenobiotics có vai trò giải độc số hóa chất arylamine, hydrazines, amin thơm dạng dị vòng để tạo thành chất trung gian thông qua phản ứng N-acetyl hóa O-acetyl hóa Khi bị đột biến dẫn đến rối loạn chức enzym giải độc, dẫn đến ung thư VS nam giới [4 Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen NAT2 gen GSTP1 VS nam giới tiến hành nhiều quốc gia Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng gen Mục tiêu nghiên cứu:Mô tả tỷ lệ xuất số đột biến gen NAT2 GSTP1 nam giới VS nguyên phát Bước đầu xác định mối liên quan số đột biến gen NAT2 GSTP1 với VS nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Bệnh nhân nam VS không rõ nguyên nhân độ tuổi sinh sản (20 - 50) làm xét nghiệm tinh dịch đồ Trung tâm Tư vấn - Di truyền, Đại học Y Hà Nội từ 2015-2017 * Tiêu chuẩn lựa chọn: - Nhóm bệnh: 100 nam giới VS khơng có tinh trùng tinh trùng (< 15 triệu, WHO 2010) - Nhóm chứng: 100 nam giới khỏe mạnh, có * Tiêu chuẩn loại trừ: nam giới VS chẩn đoán xác định nguyên nhân: viêm quan sinh dục, giãn tĩnh mạch tinh, tắc nghẽn đường sinh dục, đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y, nhiễm sắc đồ bất thường, nội tiết tố bất thường, bị bệnh ung thư, cấp tính, tâm thần… Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết mẫu ADN từ máu ngoại vi (chống đông EDTA) kit tách ADN Express (Lytech, Nga) Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định đa hình gen GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) với trình tự mồi: 293 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Bảng 1: Trình tự mồi để khuếch đại gen Gen GSTP1 Tr nh tự mồi Polymorphism F: 5'- TGGGAGGGATGAGAGTAGGA -3' (313G>A (I105V) NAT2 (exon 5) R: 5'- CAGGGTCTCAAAAGGCTTCAGT-3' 481 С/Т F: 5'-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3' L161L R: 5'-TTGGGTGATACATACACAAG-3' (exon 2) Kỹ thuật ARMS - PCR thực với thể tích 50 μl phản ứng có chứa 5µl (50100 ng) ADN di truyền, ống (allen bình thườnghoặc allen đột biến) 17,5 µl đệm PCR, 2,5 µl primer mix (mồi bình thường mồi đột biến), 0,2 Taq ADN polymerase 25 µl dầu khống (Lytech, Nga) với chu trình ln nhiệt: 930C/1 phút; 35 chu kì (93oC/10s, 64oC/10s, 72oC/20s), 72oC/10 phút Sản phẩm PCR sau điện di thạch agarose 3% để xác định kiểu gen đối tượng nghiên cứu * Xử lý số liệu:số liệu thu thập xử lý phần mềm SPSS 16.0 * Đạo đức nghiên cứu: BN hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu có quyền rút khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân thông báo kết xét nghiệm gen Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật KÊT QUẢ NGHIÊN CỨU Ph n bố tuổi nhóm nghiên cứu Bảng 2: Phân bố nhóm tuổi nhóm bệnh nhóm chứng Nhóm chứng Tuổi Nhóm bệnh p % n % 20 - 29 40 40,0 27 27,0 30 - 39 42 42,0 53 53,0 40 - 49 15 15,0 20 20,0 50 - 59 3,0 0 X ± SD 31,88 ± 6,33 33,95 ± 7,19 p > 0,05 > 0,05 Ở hai nhóm bệnh nhóm chứng, nam giới độ tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ cao Độ tuổi chiếm tỷ lệ thấp 50 - 59 tuổi Tỷ lệ phân bố nhóm tuổi nhóm bệnh chứng khơng có khác biệt 294 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Đặc điểm nội tiết tố nhóm nam giới VS Bảng 3: Đặc điểm nội tiết nhóm bệnh nhóm chứng Nhóm X ± SD (IU/L) n FSH LH Testosteron Nhóm bệnh 100 17,34 ± 3,27 16,33 ± 2,53 13,02 ± 1,62 Nhóm chứng 100 11,62 ± 12,60 6,56 ± 4,19 15,86 ± 5,50 - 20 - 20 10 - 35 Giới hạn bình thường Giá trị trung bình FSH, LH testosterone BN nhóm bệnh nhóm chứng giới hạn bình thường Kết ph n tích đ t biến gen NAT2 C481T nhóm bệnh nhóm chứng Bảng 4: Kết phân tích gen đột biến gen NAT2 C481T NAT2 481C>T Nhóm bệnh (n = 100) Nhóm chứng (n = 100) CC 49 (49%) 75 (75%) Chi-squared 14,35 p < 0,001 OR 95%CI 0,32 0,18 - 0,58 3,12 1,72 - 5,68 0,02 - 50,89 CT 51 (51%) 25 (25%) TT (0%) (0%) 1,0 CT+TT 51 (51%) 25 (25%) 3,12 1.72 - 5.68 Tỷ lệ mang người mang kiểu gen CT nhóm bệnh 51%, nhóm chứng 25% Khơng gặp trường hợp mang gen TT hai nhóm Trường hợp CT+TT gặp nhóm bệnh nhóm chứng 51% 25% có nguy cao gây VS nam (OR = 3,12; CI = 1,72 - 5,68) Kết ph n tích đ t biến gen GSTP1G313A nhóm bệnh nhóm chứng Bảng 5: Kết phân tích gen đột biến gen GSTP1 G313A GSTP1 G313A Nhóm bệnh (n = 100) Nhóm chứng (n = 100) GG 50 (50%) 84 (84%) GA 36 (36%) 16(16%) AA 14 (14%) (0%) GA+AA 50 (50%) 16 (16%) Chi-squared 30,32 p < 0,001 26,14 p < 0,001 OR 95%CI 0,19 0,10 -0,7 2,95 1,1 - 5,79 33,69 1,8 -573,6 5,25 2,1 -10,9 Tỷ lệ người mang kiểu gen GA nhóm bệnh 36%, nhóm chứng 16% 14% nhóm bệnh mang kiểu gen AA, khơng gặp trường hợp mang kiểu gen AA nhóm chứng Kiểu gen GA+AA gặp nhóm bệnh nhóm chứng 50% 16% có nguy cao gây VS nam với (OR = 5,25; CI = 2,71 - 10,19; p < 0,001) 295 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 BÀN LUẬN Nghiên cứu cho thấy: nhóm chứng nam giới VS, tuổi thấp 22, tuổi cao 50, độ tuổi trung bình 31,88 ± 6,33 Trong đó, nhóm tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ cao (42%) Ở nhóm bệnh, người có độ tuổi thấp 22, cao 49, độ tuổi trung bình 33,95 ± 7,19 Độ tuổi trung bình nhóm khơng khác biệt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, độ tuổi trung bình nhóm nghiên cứu chúng tơi cao chút so với nghiên cứu tác giả Yufeng Quin (2013) Trung Quốc (28,41 ± 4,61)[5] thấp so với nghiên cứu nước phương Tây (Sonia Brahem (2011): 37,65) [6] Điều độ tuổi kết hôn Việt Nam thấp so với nước phương Tây, việc quan tâm đến sức khỏe người dân đãtốt trước Vì vậy, họ khám sớm Ở phương Tây, nam giới lập gia đình muộn so với Việt Nam, nam giới khám điều trị VS muộn Trong 100 BN nhóm bệnh nhóm chứng làm xét nghiệm nội tiết tố Kết cho thấy: nồng độ FSH huyết (17,34 ± 3,27 IU/L) (11,62 ± 12,60 IU/L), LH huyết (16,33 ± 2,53 IU/L) (6,56 ± 4,19 IU/L),testosterone huyếtthanh (17,02 ± 5,23 IU/L) (15,86 ± 5,50 IU/L) giới hạn bình thường Nghiên cứu chúng tơi tương đối phù hợp với tác giả Ngô Xuân Bái (2010) [7 , Shalender Bhashin (2007) [8 Điều nghĩ tới giả thiết trường hợp vô tinh, tinh trùng nam giới VS hậu rối loạn 296 di truyền, có bất thường gen Do đó, ảnh hưởng tới chức sản xuất tinh trùng ống sinh tinh, hoạt động sản xuất hormon FSH LH tuyến yên, testosteron tế bào Leyding bình thường Giả thiết phù hợp với mục đích nghiên cứu chúng tơi Mặt khác, đối tượng nghiên cứu nhóm bệnh chúng tơi nam giới VS nguyên phát, loại trừ nguyên nhân: viêm quan sinh dục, giãn tĩnh mạch tinh, tắc nghẽn đường sinh dục, đoạn nhỏ NST Y, nhiễm sắc đồ bất thường, nội tiết tố bất thường Như vậy, kết thể BN nhóm bệnh phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu Đánh giá đột biến gen NAT2 (C481T) nhóm bệnh với kiểu gen dị hợp tử CT (51%) cao nhóm chứng (25%) cho thấy nguy VS tăng đáng kể người mang kiểu gen OR = 3,12; CI = 1,72 - 5,68, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Không gặp trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử (TT) hai nhóm Nghiên cứu Yarosh CS (2014) [9] 203 BN VS nam 227 nam giới bình thường cho kết quả: Ở nhóm bệnh có 46,8% trường hợp dị hợp tử, 34,5% bình thường, 18,7% đồng hợp tử đột biến Ở nhóm chứng: 51,5% trường hợp dị hợp tử, 34,8% bình thường 14,1% đồng hợp tử đột biến Kết phân tích cho thấy tỷ lệ phân bố genotype alen hai nhóm bệnh nhóm chứng khơng khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tuy nhiên, theo TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 nghiên cứu tác giả trên, trường hợp mang đột biến C481T gen NAT2 làm tăng cường tính nhạy cảm dẫn đến VS nam có tiếp xúc với chất oxy hóa như: khói thuốc (OR = 1,7; 95%CI = 1,02 - 2,87; p = 0,042), lạm dụng rượu (OR = 2,14; 95%CI = 1,08 - 4,27; p = 0,029), lượng thức ăn chất xơ (OR = 1,68; 95%CI = 1,01 - 2,79; p = 0,04) [45] Như vậy, có khác kết chúng tối với nghiên cứu Yarosh CS (2014) Nguyên nhân khác biệt chủng tộc, địa chất, môi trường tiếp xúc với chất độc hại người Việt Nam khác so với người phương Tây, điều dẫn tới khác biệt tỷ lệ xuất đột biến gen ảnh hưởng đột biến gen đến trường VS nam Nghiên cứu đột biến GSTP1(G313A) 100 BN nhóm, chúng tơi thấy: tỷ lệ mang gen GA nhóm bệnh 36%, nhóm chứng 16% với OR = 2,95; CI = 1,51 - 5,75; p < 0,001 14% nhóm bệnh mang kiểu gen AA, khơng gặp trường hợp mang kiểu gen AA nhóm chứng với OR = 33,69, CI = 1,98 573,16 Kiểu gen GA+AA gặp nhóm bệnh nhóm chứng 50% 16% với OR = 5,25; CI = 2,71 - 10,19; p < 0,005 Điều cho thấy nguy VS hay gặp BN mang kiểu gen Nghiên cứu Feng Z CA (2017) [10 kết hợp đột biến gen SPO11 GSTP1 trường hợp VS I nam giới, kết so sánh 216 BN 198 người bình thường cho thấy tần suất đột biến đơn G313A gen GSTP1 (GSTP1 Leu105Val) nhóm có khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tác giả kết luận có kết hợp đột biến gen GSTP1G313A nam giới VS Nghiên cứu Xiong D K CS (2015) [11 , tỷ lệ đột biến gen GSTP1G313A nhóm BN azoospermia, oligospermia lớn nhóm chứng Kết có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Nghiên cứu đột biến gen GSTP1 G313A Yarosh CS (2014)[12 203 bệnh nhân nam VS I 227 người bình thường cho thấy đột biến gen làm tăng nguy VS nam giới (OR = 1,50, 95% CI 1,02 - 2,20, p = 0.04) Như vậy, kết nghiên cứu phù hợp với tác giả Điều góp phần củng cố thêm giả thiết biến đổi gen GSTP1 G313A chuyển hóa xenobiotic nguyên nhân dẫn đến VS nam KẾT LUẬN Tần số xuất kiểu gen nhóm bệnh nhóm chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê với X2: 14, 35 (NAT2) 30,2 (GSTP1) Tỷ lệ xuất kiểu gen dị hợp tử đồng hợp đột biến nhóm bệnh 51% (NAT2) 50% (GSTP1) Trong nhóm chứng 25% (NAT2) 16% (GSTP1) Bước đầu nhận thấy có mối liên quan đột biến gen GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) với VS nam Các kiểu gen GA+AA(GSTP1) CT+TT (NAT2) có nguy cao gây VS nam với OR là: 5,25 (95%CI: 2,71 - 10,19) 3,12 (95%C I: 1,72 - 5,68) 297 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngơ Xn Bái, Nguyễn Thị Bình Nghiên cứu đặc điểm tinh dịch nông độ FSH, LH Testosterone huyết người bị nhược tinh Bộ môn Mô phôi Đại học Y Hà Nội 2010 Andrew D Patterson, Frank J Gonzalez, Jeffrey R Idle Xenobiotic metabolism - A view through the metabolometer Chem Res Toxicol 2010 May 17, 23 (5), pp.851-860 H C Schuppe, P Wieneke Xenobiotic metabolism, genetic polymorphisms and male infertirity Andrologia 2000, vol 32, pp.255-262 Chen Z H, Xian J F, Luo L P Association between GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms and gastric cancer risk, and their interactions with environmental factors Genet Moi Res 2017, 16 (1) Magalon H, PatinE, Austerlitz F Population genetic diversity of the NAT2 gene supports a role of acetylation in human adaptation to farming in Central Asia European Journal Human Genetic 2008, 16 (2), pp.243-251 Yufeng Qin Interactions between Urinary 4-tert-Octylphenol levels and metabolism enzyme gene variants on idiopathic male infertility.Plos one 2013, Vol 298 Brahem S, Mehdi M, Elghezai H et at The effects of male aging on semen quality, spearm DNA framentation and choromosomal abnormalities in an infertile population Journsl of Assisted Reproduction and Genetics 28 (5), pp.425-432 Shalender Bhasin Approach to the infertile Man.J Clin Endocrinol Metab 2007, 92 (6), pp.1995-2004 Yarosh S.L, Kokhtenko E.V, Churnosov M.I et al Synergism between the Nacetyltransferase gene and oxidant exposure increases the risk of idiopathic male infertility Report Biomed Online 2014, 29 (3), pp.362-369 10 Feng Z, Jing Z, Liu H, Liao S Association of SPO11 and GST gene polymorphisms with idiopathic male infertility in ethnic Han Chinese Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2015, 32 (6), pp.866-870 11 Xiong D.K, Chen H.H, Ding X.P Association of polymorphisms in glutathione S-transferase genes (GSTM1, GSTT1, GSTP1) with idiopathic azoospermia or oligospermia in Sichuan China Asian J Androl 2015, 17 (3), pp.481-6 12.Yarosh S.L, Kokhtenko E.V, Churnosov M.I Joint effect of glutathione S-transferase genotypes and cigarette smoking on idiopathic male infertility Adrologia 2015, 47 (9), pp.980-986 ... vị trí 105 Đột biến điểm exon ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu enzym GSTP1[ 3 Gen Arylamine N-acetyltransferase (NAT2) nằm NST số (8p22), gen mã hóa enzym NAT2 giai đoạn II chuyển hóa xenobiotics có... số đột biến gen NAT2 GSTP1 nam giới VS nguyên phát Bước đầu xác định mối liên quan số đột biến gen NAT2 GSTP1 với VS nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Bệnh nhân nam VS... ung thư VS nam giới [4 Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen NAT2 gen GSTP1 VS nam giới tiến hành nhiều quốc gia Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng gen Mục tiêu