Mục tiêu của bài viết nhằm nghiên cứu chiết xuất naringin bằng dung môi ethanol từ cùi bưởi (Citrus maxima), qua đó xây dựng quy trình chiết xuất naringin từ cùi bưởi bằng dung môi ethanol. Bài viết nghiên cứu chiết xuất hoạt chất này bằng dung môi an toàn, rẻ tiền để đạt hiệu quả cao, chính vì vậy dung môi ethanol được lựa chọn cho nghiên cứu này.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN BẰNG DUNG MÔI ETHANOL TỪ CÙI BƢỞI (CITRUS MAXIMA) Nguyễn Cẩm Vân*; Nguyễn Minh Chính*; Đào Văn Đôn* Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Nguyễn Văn Thuận** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng quy trình chiết xuất naringin từ cùi Bưởi dung môi ethanol Đối tượng phương pháp: tiến hành thực nghiệm để khảo sát lựa chọn yếu tố xây dựng quy trình chiết xuất naringin từ cùi Bưởi thu mua Hà Nội Kết quả: điều kiện chiết xuất naringin tối ưu dung môi ethanol bao gồm: phương pháp chiết siêu âm có gia nhiệt, dung mơi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/dược liệu (10/1), nhiệt độ chiết xuất 55 , chiết lần, lần chiết Hiệu suất chiết naringin quy trình 85,6% độ tinh khiết naringin đạt 94,1% Kết luận: khảo sát lựa chọn yếu tố xây dựng quy trình chiết naringin từ cùi Bưởi dung mơi an tồn, rẻ tiền hiệu suất chiết cao (85,6%) * Từ khóa: Cùi Bưởi; Chiết xuất; Naringin; Ethanol Study on the Extraction of Naringine by Ethanol from Citrus Maxima Summary Aims: To establish the procedure to extract naringine from citrus maxima using ethanol Subjects and methods: Conducting experiments to investigate and select factors and establish the procedure to extract naringine from citrus maxima bought in Hanoi Results: Conditions for optimal extraction of naringine using ethanol including using ultrasonic extraction with heat; ethanol 70%; the ratio of the solvent/herbal (10/1); the extraction temperature at 55 celsius; 03 times of extraction with 60 minutes each The efficiency of this naringine extraction procedure reached 85.6% and purity of naringine was 94.1% Conclusion: The factors have been investigated and selected and the procedure of extracting naringine from citrus maxima using ethanol solvent has been established with safety, low cost and high efficiency (85.6%) * Key words: Citrus maxima; Extraction; Naringine; Ethanol ĐẶT VẤN ĐỀ Bưởi (Citrus maxima) loại ăn quả, trồng phổ biến nước ta giới [5] Ngày nay, trước phát triển khoa học kinh tế, phận trước coi dư thừa vỏ quả, cùi, hạt, ý đến dần đưa vào nghiên cứu số Ngành Dược phẩm, Thực phẩm, Mỹ phẩm * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn TuÊn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 22/08/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 14/12/2014 Ngày báo đăng: 30/12/2014 19 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Naringin - hợp chất thuộc nhóm flavonoid có vỏ lồi Citrus nói chung, cùi Bưởi nói riêng nghiên cứu cơng bố số tác dụng chống lão hóa, làm giảm cholesterol, ngăn ngừa cao huyết áp, giảm tai biến tim mạch, làm lành vết loét dày, phòng chống ung thư có tác dụng làm đẹp da [6, 7] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu, chiết xuất narigin số phương pháp khác nhau, phương pháp phải dùng thiết bị phức tạp, phải dùng dung môi độc hại, gây ô nhiễm mơi trường, khơng an tồn cho sức khỏe [2, 3, 4] Do đó, cần có nghiên cứu chiết xuất hoạt chất dung mơi an tồn, rẻ tiền để đạt hiệu cao, dung mơi ethanol lựa chọn cho nghiên cứu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị - Nguyên liệu: cùi Bưởi thu mua khu vực ngoại thành Hà Nội, mẫu Khoa Dược liệu, Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Học viện Quân y - Hoá chất: naringin chuẩn Sigmaaldrich, MeOH, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Dụng cụ - thiết bị: hệ thống HPLC WATERS 2695D, detector PDA, kênh dung môi; thiết bị siêu âm gia nhiệt Memmert GmbH+ Co KG D-91126 Schwabach FRG (Đức); bình chiết dụng cụ thủy tinh khác, 20 Tiến hành thí nghiệm Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược, Học viện Quân y Phƣơng pháp nghiên cứu * Định lượng naringin HPLC: - Xử lý mẫu cùi Bưởi: cân xác 0,5 g bột cùi Bưởi khơ (bột khơ mịn), cho vào bình cầu 250 ml, thêm xác 50 ml MeOH Ðun sôi hồi lưu 30 phút, làm mát Bổ sung MeOH vừa đủ, trộn ly tâm Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước phân tích HPLC - Xử lý mẫu sản phẩm chiết xuất naringin: cân xác 1,5 mg mẫu cho vào bình định mức 25 ml, thêm MeOH vừa đủ tới vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước phân tích HPLC - Điều kiện HPLC: cột RP18 (4,6 x 250 mm; µm); detector UV: 283 nm; pha động: acetonitril: axít phosphoric 0,5% (20:80, v/v); tốc độ dòng: ml/phút; thể tích bơm mẫu: 20 µl - Đánh giá: hàm lượng naringin chiết theo công thức: x HLNaringin (%) = 10-4 C: nồng độ naringin dung dịch mẫu thử (µg/ml); V: thể tích methanol (ml); M: khối lượng dược liệu (g); a: hàm ẩm dược liệu (%) * Xây dựng quy trình chiết xuất: - Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt chiết siêu âm gia nhiệt + Chiết siêu âm: 50 g bột cùi Bưởi chiết với 200 ml ethanol 960 nhiệt độ 750C Sau giờ, gạn lấy dịch chiết Chiết tiếp tục bã dược liệu với ethanol (200 ml x lần) + Chiết Shoxlet: chiết 50 g bột cùi Bưởi với 200 ml ethanol 960 Sau giờ, gạn lấy dịch chiết TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 + Chiết ngấm kiệt: cho 50 g bột cùi Bưởi vào bình ngấm kiệt, thêm ethanol 960 tới ngập dược liệu - cm Sau 24 giờ, rút từ từ dịch chiết, đồng thời bổ sung dung mơi vào bình ngấm kiệt Tiến hành chiết tới thu 300 ml dịch chiết - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng: nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/dược liệu; số lần chiết xuất; nhiệt độ thời gian chiết xuất - Dịch chiết ethanol cô chân không nhiệt độ 500C tới cao 1/1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết định lƣợng naringin nguyên liệu cùi Bƣởi Đánh giá hàm lượng naringin nguyên liệu cùi Bưởi HPLC Bảng 1: Kết định lượng naringin cùi Bưởi (n = 5) (mg) 0,4956 15,57 ± 0,4 9,48 3,58 ± 1,4 Hàm lượng naringin mẫu nghiên cứu 3,58 ± 1,4% Dược điển Việt Nam chưa có quy định cho hàm lượng naringin tối thiểu cùi Bưởi Tuy nhiên, Dược điển Trung Quốc quy định naringin cùi Bưởi không thấp 3,5% [1] Như vậy, mẫu cùi Bưởi khảo sát đạt tiêu chuẩn chất lượng hàm lượng naringin theo quy định Dược điển Trung Quốc Đây sở để tính hiệu suất chiết quy trình Kết lựa chọn phƣơng pháp chiết Tiến hành khảo sát phương pháp chiết xuất: chiết siêu âm, chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt mô tả Lượng mẫu chiết 50 g bột cùi Bưởi khô Bảng 2: Kết chiết xuất naringin theo phương pháp chiết khác (n = 5) (g) Siêu âm (1) 1,44 ± 1,1 52,90 ± 0,8 43,90 ± 1,1 Shoxlet (2) 1,45 ± 0,7 53,20 ± 2,4 44,53 ± 2,9 Ngấm kiệt (3) 1,10 ± 2,5 60,55 ± 0,7 38,38 ± 3,0 Phương pháp ngấm kiệt cho hiệu suất chiết 38,38%, thấp nhiều so với phương pháp chiết siêu âm chiết Shoxlet (p < 0,05) Do đó, phương pháp khơng lựa chọn cho nghiên cứu Tuy nhiên, tạp chất phương pháp ngấm kiệt so với phương pháp chiết siêu âm chiết Shoxlet, không bị tác động nhiệt độ (tác nhân 21 p1-2 > 0,1 p1-3 < 0,05 làm tạp tan nhiều dung mơi chiết xuất) Vì vậy, số nghiên cứu sử dụng phương pháp Hiệu suất chiết phương pháp chiết siêu âm phương pháp chiết Shoxlet tương đương (43,90 ± 1,1% 44,53 ± 2,9%) (p > 0,1) Tuy nhiên, so với phương pháp chiết siêu âm, phương pháp chiết Shoxlet có thời gian chiết dài, TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 việc khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất khó thực Hơn nữa, phương pháp chiết Shoxlet triển khai quy mơ nhỏ phòng thí nghiệm, khó có khả triển khai quy mơ cơng nghiệp Vì vậy, phương pháp chiết siêu âm lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết xuất Tiến hành chiết xuất naringin cùi Bưởi theo quy trình gồm thơng số sau: bột cùi Bưởi: 15 g cho lần chiết; dung môi chiết: hỗn hợp ethanol - nước; phương pháp chiết: siêu âm có gia nhiệt Khảo sát thơng số: nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ chiết xuất, số lần chiết xuất thời gian chiết xuất Sau chiết, gộp dịch chiết, cô đến cao đặc Hòa tan nóng 100 ml nước, để nhiệt độ phòng đến xuất tủa, lọc thu tủa sấy 55oC đến khô, thu sản phẩm flavonoid thô Xác định hàm lượng naringin sản phẩm thô Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ ethanol Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết xuất (nồng độ: 96%, 80%, 70% 40%) theo điều kiện Bảng 3: Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết tới hiệu suất chiết (n = 5) (g) Ethanol 96% (1) 0,43 ± 0,7 58,96 ± 1,9 48,70 ± 2,5 Ethanol 80% (2) 0,54 ± 1,9 59,82 ± 1,7 62,27 ± 2,2 Ethanol 70%(3) 0,56 ± 1,3 60,20 ± 1,0 64,11 ± 2,1 Ethanol 40% (4) 0,31 ± 4,1 49,62 ± 1,1 29,83 ± 5,1 Trong số nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 70% dung môi chiết xuất khối lượng flavonoid toàn phần lớn (0,56 g), đồng thời hàm lượng naringin cắn chiết cao (64,12%) Vì vậy, ethanol 70% lựa chọn dung môi chiết xuất cho khảo sát p3-1 < 0,05 p3-2 > 0,1 p3-4 < 0,05 p3-5 > 0,1 Kết khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi - dƣợc liệu Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu: 5/1; 7/1; 10/1; 12/1 Hiệu suất chiết hàm lượng flavonoid thô chiết với tỷ lệ dung môi khác Bảng 4: Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi - dược liệu tới hiệu suất chiết (n = 5) (g) 22 5/1 (1) 0,43 ± 3,7 59,50 ± 1,7 48,66 ± 5,1 7/1 (2) 0,51 ± 0,9 59,56 ± 1,2 57,80 ± 1,5 10/1 (3) 0,60 ± 0,9 60,32 ± 1,2 69,65 ± 1,3 12/1 (4) 0,60 ± 2,2 61,68 ± 1,3 71,45 ± 3,3 p3-1 < 0,05 p3-2 < 0,05 p3-4 > 0,1 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Tỷ lệ dung môi/dược liệu (5/1) cho hiệu suất chiết thấp (48,66%) Khi tăng tỷ lệ dung môi, hiệu suất chiết tăng lên, cao tỷ lệ 12/1 (71,45%), khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê tỷ lệ 10/1 (69,65%) tỷ lệ 12/1 (71,45%) (p > 0,1) Từ kết khảo sát trên, lựa chọn tỷ lệ dung môi/dược liệu 10/1 cho khảo sát Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết xuất Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất chiết nhiệt độ sau: nhiệt độ phòng, 550C 780C Bảng 5: Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu suất chiết (n = 5) (g) Nhiệt độ phòng (1) (%) (%) 0,44 ± 3,6 59,72 ± 1,4 50,85 ± 4,1 0,60 ± 0,8 61,32 ± 1,1 70,96 ± 1,7 0,62 ± 1,7 59,96 ± 1,4 71,34 ± 1,4 55 C (2) 78 C (3) Tăng nhiệt độ chiết xuất làm tăng lượng flavonoid chiết Kết có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Ở nhiệt độ phòng, lượng flavonoid chiết đạt 0,4444 g (hiệu suất 50,85%), tăng nhiệt độ lên 550C, làm tăng đáng kể lượng flavonoid chiết (0,6040 g, hiệu suất 70,96%) Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ lên nhiệt độ sôi dung môi (780C), khối lượng cắn flavonoid thu P2-1 < 0,05 P2-3 > 0,1 tăng lên không đáng kể (0,6212 g, hiệu suất 71,34%) Do vậy, chiết xuất 550C thích hợp nghiên cứu Kết khảo sát ảnh hƣởng số lần chiết xuất Tiến hành chiết xuất dược liệu với số lần chiết khác nhau: lần, lần, lần lần Bảng 6: Kết khảo sát ảnh hưởng số lần chiết tới hiệu suất chiết (n = 5) (g) lần (1) 0,29 ± 0,4 59,84 ± 0,9 33,26 ± 1,1 lần (2) 0,55 ± 0,4 61,30 ± 1,0 64,27 ± 1,2 lần (3) 0,61 ± 0,6 61,08 ± 1,6 71,10 ± 1,7 lần (4) 0,62 ± 0,7 61,32 ± 0,5 72,52 ± 1,0 Khi tăng số lần chiết, lượng flavonoid toàn phần chiết tăng lên Lượng flavonoid thu chủ yếu lần chiết Ở lần chiết 4, lượng flavonoid thu giảm Khi tăng số lần chiết xuất naringin từ lần lên lần, hiệu suất chiết tăng theo 23 P3-1 < 0,05 P3-2 > 0,1 P3-4 > 0,1 tương ứng từ 33,26 - 72,52% Hiệu suất chiết lần 72,52% so với chiết lần 71,10%, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,1) Do đó, chiết xuất lần phù hợp, tiếp tục tăng số lần chiết lượng hoạt chất tăng lên khơng đáng kể TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết xuất Tiến hành khảo sát thời gian lần chiết siêu âm: 30 phút, giờ, 1,5 Đánh giá hiệu suất chiết thời gian khác Bảng 7: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết tới hiệu suất chiết (n = 5) (giờ) (g) 0,5 (1) 0,55 ± 0,5 57,50 ± 1,1 60,14 ± 1,0 (2) 0,61 ± 0,5 61,50 ± 0,7 71,63 ± 1,1 1,5 (3) 0,61 ± 1,0 61,88 ± 2,7 72,95 ± 3,6 (4) 0,62 ± 1,0 62,28 ± 1,6 74,09 ± 1,6 p2-1 < 0,05 p2-3 > 0,1 Thời gian chiết ảnh hưởng đến lượng flavonoid thu Chiết siêu âm 0,5 cho khối lượng flavonoid thấp (0,5460 g) hiệu suất chiết thấp - Dung môi chiết xuất: EtOH 70% - Tỷ lệ dung môi/dược liệu: 10/1 - Nhiệt độ chiết xuất: 550C (60,14%) Khi tăng thời gian chiết - Số lần chiết: lần xuất, khối lượng flavonoid thô tăng - Thời gian chiết: hiệu suất chiết tăng Chiết siêu âm có hiệu suất chiết cao Kết có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 so sánh với chiết 0,5 Tuy nhiên, khối p2-4 > 0,1 - Thu hồi dung môi đến cao 1/1, để 24 cho lắng tủa - Lọc rửa tủa EtOH 96% lượng flavonoid thô tăng không đáng kể - Sấy tủa 500C, thu sản phẩm thô (0,6080 g; 0,6153 g; 0,6210 g) thời Quy trình chiết flavonoid từ dược liệu gian thay đổi từ giờ, 1,5 đến cùi Bưởi trình bày sau: 50 g với p > 0,1 Điều gây lãng phí thời bột cùi Bưởi làm ẩm 180 ml gian cho trình chiết xuất, tốn ethanol 70% 10 phút Tiến hành lượng chạy máy, làm tăng lượng tạp chất chiết siêu âm gia nhiệt với 500 ml ethanol Từ khảo sát trên, lựa chọn thời 70% nhiệt độ 550C Sau giờ, gạn lấy gian chiết xuất dịch chiết Tiếp tục chiết bã dược liệu với Từ kết khảo sát trên, xác định ethanol 70% lần (500 ml x lần) thơng số quy trình chiết xuất Gộp dịch chiết bốc chân không đến naringin từ cùi Bưởi sau: 24 cao 1:1 nhiệt độ 500C (hình 1) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bột cùi Bưởi (đã làm ẩm) EtOH 70% Siêu âm/1 0 t = 55 C Tỷ lệ 10/1 Gạn lọc lấy dịch Bã dược liệu Siêu âm/1 0 t = 55 C Dịch chiết EtOH 70% Tỷ lệ 10/1 Gạn lọc lấy dịch Bã dược liệu Siêu âm/1 0 t = 55 C Dịch chiết EtOH 70% Tỷ lệ 10/1 Gạn lọc lấy dịch Bã dược liệu Dịch chiết Thu hồi dung môi Cao 1:1 Lắng 24 giờ/nhiệt độ phòng Lọc, rửa tủa EtOH 96% Sấy 50 C Sản phẩm thơ Hình 1: Sơ đồ quy trình chiết xuất naringin KẾT LUẬN dung mơi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/dược liệu (10/1), nhiệt độ chiết 550C, chiết Đã xây dựng quy trình chiết xuất lần, lần chiết Hiệu suất chiết naringin từ cùi Bưởi tối ưu dung môi naringin quy trình 85,6% độ tinh ethanol gồm: phương pháp chiết siêu âm, khiết naringin đạt 94,1% 25 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược điển Trung Quốc 2010 Phạm Thị Hảo Nghiên cứu chiết xuất, phân lập số flavonoid từ vỏ số lồi Citrus Khóa luận Tốt nghiệp Đại học Đại học Dược Hà Nội, 2010 Võ Văn Lẹo, Lê Thị Minh Châu, Ngô Văn Thu, Trần Hùng Khảo sát flavonoid từ vỏ Bưởi Tạp chí Dược học 2011, số Trần Xuân Linh Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tác dụng chống oxy hóa favonoid cùi Bưởi Luận văn Thạc sỹ Dược học Học viện Quân y 2003 Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật, 2006 S Gorinstein, D Huang, H Leontowicz, M Leontowicz, K Yamamoto Determination of naringin and hesperidin in citrus fruit by high-performance liquid chromatography The antioxidant protential of citrus fruit Acta Chromatographica 2006, 17 pp.108-124 Paiwan Buachan, Linda Chularojmontri and Suvara K Wattanapitayakul Selected activities of citrus maxima Merr Fruits on human endothelial cells: enhancing cell migration and delaying cellular aging Nutrients 2014, 6, pp.1618-1634 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 ... chiết xuất naringin KẾT LUẬN dung môi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/ dược liệu (10/1), nhiệt độ chiết 550C, chiết Đã xây dựng quy trình chiết xuất lần, lần chiết Hiệu suất chiết naringin từ cùi Bưởi. .. tiếp tục nghiên cứu Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết xuất Tiến hành chiết xuất naringin cùi Bưởi theo quy trình gồm thông số sau: bột cùi Bưởi: 15 g cho lần chiết; dung môi chiết: ... dựng quy trình chiết xuất: - Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt chiết siêu âm gia nhiệt + Chiết siêu âm: 50 g bột cùi Bưởi chiết với 200 ml ethanol 960 nhiệt