Xây dựng quy trình chiết xuất piperin bằng dung môI ethenol từ hạt hồ tiêu (Piper nigri L.).

Bài viết nghiên cứu về chiết xuất hoạt chất piperin bằng bằng dung môI ethenol từ hạt hồ tiêu (Piper nigri L.). Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xây dựng được quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu tối ưu bằng dung môi ethanol.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT PIPERIN BẰNG DUNG MƠI ETHANOL TỪ HẠT HỒ TIÊU (PIPER NIGRI L.) Phạm Thị Mai Hiên*; Nguyễn Minh Chính*; Đỗ Văn Bình* Đào Văn Đơn*; Nguyễn Thị Thanh Hương TĨM TẮT Quy trình chiết xuất piperin hồ tiêu dung môi ethanol đƣợc khảo sát xây dựng Điều kiện chiết xuất tối ƣu dung môi ethanol: phƣơng pháp chiết siêu âm, kÝch th-íc tiểu phân 0 0,35 mm, cồn ethylic 96 , tỷ lệ cồn ethylic - dƣợc liệu (3:1), nhiệt độ 40 , chiết lần, lần chiết Hiệu suất chiết piperin quy trình 96,6% * Từ khóa: Hồ tiêu; Piperin; Chiết xuất PROCESS OF EXTRACTION OF PIPERINE BY ETHANOL FROM PIPER NIGRI L Summary Ultrasound method for extraction of piperine from pepper was established Conditions of ultrasound extraction: particle size at 0.35 mm, using ethanol 96% as the extraction solvent with ratio of 1:3 (herbal/solvent); 03 times of extraction, 60 per time, temperature at 40 C, remove solvent at 40 C her high temperature under low pressure Efficiency of piperine extraction reached 96.6% * Key words: Piper nigri L.; Piperine; Extraction ĐẶT VẤN ĐỀ Hồ tiêu (Piper nigri L.) đƣợc trồng rộng rãi năm gần đây, sản phẩm hồ tiêu đáp ứng nhu cầu thị trƣờng nƣớc mà đƣợc xuất nhiều nƣớc giới [1, 4] Từ 2002, Việt Nam vƣơn lên trở thành nƣớc dẫn đầu, đến chiếm nửa khối lƣợng hồ tiêu xuất toàn giới [4] Hồ tiêu hạt đƣợc sử dụng làm gia vị ngành thực phẩm Hoạt chất piperin chiết xuất từ hạt hồ tiêu đƣợc sử dụng phổ biến ngành dƣợc phẩm với nhiều hoạt tính sinh học tốt [1, 5] Đã có số cơng trình nghiên cứu cơng bố quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu [3] Tuy nhiên, quy trình sử dụng dung mơi khơng an tồn, gây độc thể Do đó, cần có nghiên cứu chiết xuất hoạt chất dung môi an toàn, rẻ tiền để đạt hiệu cao dung môi ethanol đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu * Hc vin Quõn y Ngi phn hi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) Ngy nhn bi: 14/10/2014; Ngy phn bin đánh giá báo: 19/01/2014 Ngày báo đăng: 11/02/2014 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu * Nguyên liệu: Hạt tiêu đen (Piper nigri L.) đƣợc thu mua Hà Đông lƣu mẫu Khoa Dƣợc liệu, Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dƣợc, Học viện Quân y * Hoá chất: - Hoá chất: chuẩn piperin (98,1%) Sigma-aldrich MeOH, ACN đạt tiêu chuẩn HPLC EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích * Dụng cụ - thiết bị: - Hệ thống HPLC WATERS 2695D, detector PDA, kênh dung môi - Máy cất quay chân không Tokyo Rikakikai model N-100 (Nhật) - Thiết bị siêu âm gia nhiệt memmert GmbH+ Co KG D- 91126 Schwabach FRG (Đức) - Bình chiết dụng cụ thủy tinh khác Tiến hành thí nghiệm Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dƣợc, Học viện Quân y Phƣơng pháp nghiên cứu * Xây dựng quy trình chiết xuất: - Khảo sát lựa chọn phƣơng pháp chiết xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt chiết siêu âm gia nhiệt + Chiết siêu âm: chiết 50 g bột hồ tiêu với 150 ml ethanol 960 nhiệt độ 400C Sau giờ, gạn lấy dịch chiết Chiết tiếp tục bã dƣợc liệu với ethanol lần (150 ml x lần) + Chiết Shoxlet: chiết 50 g bột hồ tiêu với 200 ml ethanol 960 Sau giờ, gạn lấy dịch chiết + Chiết ngấm kiệt: cho 50 g bột hồ tiêu vào bình ngầm kiệt, thêm ethanol 960 ngập dƣợc liệu - cm Sau 24 giờ, rút từ từ dịch chiết, đồng thời bổ sung dung môi vào bình ngấm kiệt Tiến hành chiết tới thu đƣợc 300 ml dịch chiết - Khảo sát yếu tố: kích thƣớc tiểu phân, nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu; số lần chiết xuất; nhiệt độ thời gian chiết xuất - Dịch chiết ethanol đƣợc cô chân không nhiệt độ 400C tới cắn - Chỉ tiêu đánh giá: lƣợng piperin chiết đƣợc (hàm lƣợng piperin cắn ethanol x khối lƣợng cắn)/lƣợng piperin có mẫu nguyên liệu * Định lượng piperin HPLC: - Theo dƣợc điển Trung Quốc (2010) [2] - Xử lý mẫu hồ tiêu: cân xác 0,25 g bột hồ tiêu (bột khơ mịn) cho vào bình cầu 100 ml, thêm 80 ml EtOH, chiết siêu âm 30 phút, thêm EtOH vừa đủ tới vạch, trộn Lọc qua màng lọc 0,45 µm trƣớc phân tích HPLC - Xử lý mẫu sản phẩm chiết xuất piperin: cân xác 50 mg mẫu cho vào bình định mức 50 ml, thêm MeOH vừa đủ tới vạch, trộn Lấy xác ml dung dịch này, pha lỗng với MeOH thành 25 ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm trƣớc phân tích HPLC - Điều kiện HPLC: cột sắc ký: Gemini C18 (4,6 x 250 mm; µm); detector UV: 343 nm; pha động: MeOH-nƣớc (77:23, v/v); tốc độ dòng: ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Đánh giá hàm lƣợng piperin mẫu nghiên cứu (hồ tiêu) HPLC theo phƣơng pháp dƣợc điển Trung Quốc Tiến hành phân tích mẫu Kết cho thấy: hàm lƣợng piperin mẫu nghiên cứu 3,41 ± 0,05% (n = 5) Đây sở để tính hiệu suất chiết quy trình suất chiết phƣơng pháp không khác biệt (p > 0,1) Phƣơng pháp chiết Shoxlet cần tạp chất so với chiết siêu âm Tuy nhiên, phƣơng pháp chiết Shoxlet cần thời gian dài, triển khai quy mơ phòng thí nghiệm, khó có khả triển khai quy mơ cơng nghiệp Trong phƣơng pháp chiết siêu âm có thời gian chiết ngắn, dễ dàng triển khai quy mô công nghiệp Do vậy, phƣơng pháp đƣợc lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Kết lựa chọn phƣơng pháp chiết Kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới hiệu suất chiết Kết định lƣợng piperin nguyên liệu hồ tiêu Tiến hành khảo sát phƣơng pháp chiết xuất: chiết siêu âm, chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt nhƣ mô tả phần phƣơng pháp Lƣợng mẫu chiết 50 g bột hồ tiêu khô Bảng 1: Kết chiết xuất piperin theo phƣơng pháp chiết khác (n = 5) SẢN PHẨM THÔ (g) HÀM LƢỢNG PIPERIN (%) HIỆU SUẤT (%) Siêu âm (1) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4 Shoxlet (2) 3,09 ± 0,18 53,6 ± 3,6 96,8 ± 1,4 Ngấm kiệt (3) 2,81 ± 0,30 48,9 ± 4,9 79,8 ± 1,0 PHƢƠNG PHÁP CHIẾT THỐNG KÊ p1-2 > 0,1 p1-3 < 0,05 Phƣơng pháp ngấm kiệt cho hiệu suất chiết 79,8%, thấp nhiều so với phƣơng pháp chiết siêu âm chiết Shoxlet (p < 0,05) Trong đó, tạp chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp chiết siêu âm Do đó, phƣơng pháp không đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu Phƣơng pháp chiết siêu âm phƣơng pháp chiết Shoxlet có hiệu suất chiết cao (> 96%), gần nhƣ chiết đƣợc hết hoạt chất piperin khỏi mẫu hồ tiêu Hiệu - Kích thước tiểu phân: Nghiền hồ tiêu khơ thành bột kích cỡ khác chiết siêu âm theo quy trình khảo sát Xác định khối lƣợng cắn hàm lƣợng piperin sản phẩm thơ chiết đƣợc Bảng 2: Ảnh hƣởng kích thƣớc tiểu phân tới hiệu suất chiết (n = 5) KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN SẢN PHẨM THƠ (g) HÀM LƢỢNG PIPERIN (%) HIỆU SUẤT (%) 0,8 mm (1) 2,58 ± 0,14 53,4 ± 2,5 80,6 ± 1,2 0,35 mm (2) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4 0,18 mm (3) 3,88 ± 0,09 42,8 ± 1,5 97,3 ± 1,6 THỐNG KÊ p1-2 < 0,05 p2-3 > 0,1 Khi sử dụng phƣơng pháp chiết siêu âm để chiết xuất piperin từ hồ tiêu, kích thƣớc tiểu phân 0,8 mm, chiết đƣợc 80,6% piperin có hồ tiêu, khơng chiết hết đƣợc hoạt chất Khi giảm kích thƣớc xuống 0,35 mm, chiết xuất đƣợc gần nhƣ hồn tồn piperin có mẫu với hiệu suất chiết 96,6% Khi giảm kích thƣớc tiểu phân xuống 0,18 mm, hiệu suất chiết không tăng lên so với TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 3-2014 kích thƣớc tiểu phân 0,35 mm (p > 0,1) Mặt khác, tạp chất lại nhiều Do đó, kích thƣớc tiểu phân 0,35 thích hợp để chiết xuất piperin hồ tiêu SẢN PHẨM THÔ (g) 300C (1) 2,71 ± 0,15 53,6 ± 2,3 85,1 ± 1,7 400C (2) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4 p2-1 < 0,05 500C (3) 3,40 ± 0,17 47,4 ± 3,6 600C (4) 3,50 ± 0,17 44,3 ± 1,7 - Tỷ lệ dược liệu/dung môi: Cân 50 g dƣợc liệu đƣợc chiết xuất siêu âm dung môi EtOH với tỷ lệ khác Chiết lần, gộp dịch chiết, bốc tạo cắn định lƣợng piperin Bảng 3: Ảnh hƣởng tỷ lệ dƣợc liệu - dung môi tới hiệu suất chiết (n = 5) HÀM TỶ LỆ DƢỢC SẢN LƢỢNG LIỆU/DUNG PHẨM PIPERIN MÔI THÔ (g) (%) HIỆU SUẤT (%) THỐNG KÊ 1:2 (1) 3,07 ± 0,26 50,9 ± 3,8 91,3 ± 1,9 1:3 (2) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± p2-1 < 0,05 1,4 p2-3 > 0,1 1:4 (2) 3,32 ± 0,23 50,3 ± 3,2 97,6 ± 1,1 Tỷ lệ dƣợc liệu/dung môi (1:2) cho hiệu suất chiết thấp (91,3%) Khi tỷ lệ dung môi tăng, hiệu suất chiết tăng lên Ở tỷ lệ dƣợc liệu/dung môi (1:3), hiệu suất chiết 96,6%, tƣơng tự nhƣ hiệu suất chiết tỷ lệ dƣợc liệu/dung môi (1:4) (p > 0,1) Độ tinh khiết sản phẩm chiết xuất đƣợc tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu không khác biệt (p > 0,1) Nhƣ vậy, tỷ lệ dƣợc liệu/dung mơi (1:3) thích hợp cho chiết xuất piperin - Nhiệt độ chiết xuất: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất chiết nhiệt độ khác Bảng 4: Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất chiết (n = 5) 10 HÀM LƢỢNG HIỆU PIPERIN SUẤT (%) (%) NHIỆT ĐỘ 94,1 ± 1,0 THỐNG KÊ p2-3 < 0,05 p2-4 < 0,05 91,0 ± 1,8 Khi tăng nhiệt độ chiết lên 30 - 600C, hiệu suất chiết thay đổi khoảng từ 85,1 - > 96,6% Ở 400C, hiệu suất chiết cao (96,6%) Khi tăng tới nhiệt độ 600C, hiệu suất chiết giảm 91,0%; nhiệt độ này, phần piperin bị phân hủy Do vậy, nhiệt độ chiết thích hợp 400C - Số lần chiết xuất: Tiến hành chiết xuất dƣợc liệu với số lần chiết khác nhau: lần, lần, lần lần Bảng 5: Ảnh hƣởng số lần chiết tới hiệu suất chiết (n = 5) SỐ LẦN CHIẾT SẢN PHẨM THÔ (g) HÀM LƢỢNG PIPERIN (%) HIỆU SUẤT (%) lần (1) 2,24 ± 0,12 50,7 ± 2,1 66,5 ± 1,4 lần (2) 3,10 ± 0,27 50,7 ± 4,3 91,6 ± 1,7 p3-1 < 0,05 lần (3) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4 p3-4 > 0,1 lần (4) 3,30 ± 0,08 50,0 ± 0,9 96,8 ± 1,4 THỐNG KÊ p3-2 < 0,05 Khi tăng số lần chiết xuất piperin từ lần lên lần, hiệu suất chiết tăng theo tƣơng ứng 72 - 96% Hiệu suất chiết lần 96,8% so với chiết lần 96,6%; khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,1) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 Do đó, chiết xuất lần phù hợp, tăng lần chiết không tăng đƣợc hoạt chất - Thời gian chiết: Tiến hành khảo sát thời gian lần chiết siêu âm: 0,5 giờ, 1,5 Đánh giá hiệu suất chiết với thời gian khác Bảng 6: Ảnh hƣởng thời gian chiết tới hiệu suất chiết (n = 5) THỜI GIAN CHIẾT SẢN PHẨM THÔ (g) HÀM LƢỢNG PIPERIN (%) HIỆU SUẤT (%) 0,5 (1) 2,47 ± 0,21 50,0 ± 3,8 72,1 ± 1,2 (2) 3,28 ± 0,25 50,5 ± 3,8 96,6 ± 1,4 (3) 3,29 ± 0,22 50,9 ± 3,3 97,8 ± 0,9 THỐNG KÊ p2-1 < 0,05 p2-3 > 0,1 Chiết siêu âm 0,5 có hiệu suất chiết thấp Khi tăng thời gian lên giờ, hiệu suất chiết cao hẳn so với 0,5 (p < 0,05) Thời gian chiết 1,5 cho hiệu suất tƣơng tự (p > 0,1) TÀI LIỆU THAM KHẢO Viện Dược liệu Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 2006 Dược điển Trung quốc 2010 Nguyễn Thị Chiên Ly Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học hạt tiêu đen (Piper nigrum L.) huyện Đ¾k Đoa, tỉnh Gia Lai Khóa luận Tốt nghiệp Đại học, Đại học Đà Nẵng 2012 Lê Thị Thùy Linh Thực trạng xuất hồ tiêu giải pháp tăng kim ngạch xuất hồ tiêu Việt Nam Khóa luận Tốt nghiệp Đại học Đại học Ngoại thƣơng 2010 Bhradwaj R.K, Glaeser H, Becquemont L, Klotz U, Gupta S.K, Fromm M.F Piperine, a mayjor constituent of black pepper, inhibits human P-glycoprotein and CYP3A4 J Pharmacol Exp Ther 2002, 302 (2), pp.645-665 Reimmel Kwame Adosraku, James Oppong Kyekyeku, Isaac Yaw Attah Characterization and HPLC quantification of piperine isolated from pipper guineense (Fam Piperaceae) International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2013, (1), pp.252-256 KẾT LUẬN Đã xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất piperin từ hồ tiêu tối ƣu dung môi ethanol gồm: phƣơng pháp chiết siêu âm, tiểu phân 0,35 mm, cồn ethylic 960, tỷ lệ cồn/dƣợc liệu (3:1), nhiệt độ 400, chiết lần, lần chiết 11 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014 12 ... pháp chiết siêu âm để chiết xuất piperin từ hồ tiêu, kích thƣớc tiểu phân 0,8 mm, chiết đƣợc 80,6% piperin có hồ tiêu, khơng chiết hết đƣợc hoạt chất Khi giảm kích thƣớc xuống 0,35 mm, chiết xuất. .. phƣơng pháp chiết xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt chiết siêu âm gia nhiệt + Chiết siêu âm: chiết 50 g bột hồ tiêu với 150 ml ethanol 960 nhiệt độ 400C Sau giờ, gạn lấy dịch chiết Chiết tiếp... liệu /dung môi: Cân 50 g dƣợc liệu đƣợc chiết xuất siêu âm dung môi EtOH với tỷ lệ khác Chiết lần, gộp dịch chiết, bốc tạo cắn định lƣợng piperin Bảng 3: Ảnh hƣởng tỷ lệ dƣợc liệu - dung môi tới