Nghiên cứu chiết xuất naringin từ cùi bưởi ( citrus grandis l)

Phương pháp định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi .... Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu cùi bưởi 16 Bảng 3.5.. Để cung cấp naringin nguyên liệu đầu vào cho qu

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH QUỐC TUẤN

Mã sinh viên: 1201674

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN

TỪ CÙI BƯỞI (Citrus grandis L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH QUỐC TUẤN

Mã sinh viên: 1201674 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN

TỪ CÙI BƯỞI (Citrus grandis L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn

Hân, tổ Chiết xuất- bộ môn Công nghiệp dược- Trường đại học Dược Hà Nội đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn DS Trần Trọng Biên và tập thể cán bộ, giảng viên

của bộ môn Công nghiệp dược Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ

và tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài này

Trong quá trình học tập, triền khai làm đề tài và những gì đạt được hôm nay,

em xin cảm ơn công lao giảng dạy và hướng dẫn của thầy cô giáo trường đại học

Dược Hà Nội

Và em cũng cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn bên

em, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu, hoàn thành đề tài tại Trường đại học Dược Hà Nội này

Dù đã có nhiều cố gắng, song đề tài còn có thể có những thiếu sót Kính mong nhận được sự chia sẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô giáo

Em xin trân trọng cảm ơn

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Trịnh Quốc Tuấn

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về cây Bưởi 2

1.1.1 Tên gọi, vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Bộ phận dùng, trồng trọt -thu hái 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Công dụng 3

1.2 Đại cương về hoạt chất naringin 3

1.2.1 Công thức, tên khoa học 3

1.2.2 Tính chất vật lý 4

1.2.3 Tính chất hóa học 4

1.2.4 Tác dụng dược lý 5

1.3 Một số nghiên cứu về chiết xuất naringin 5

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 2.1 Nguyên vật liệu 8

2.1.1 Nguyên liệu 8

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 8

2.2 Nội dung nghiên cứu 9

2.3 Phương pháp nghiên cứu 9

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm 9

2.3.2 Phương pháp định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi 9

2.3.3 Phương pháp định lượng naringin 10

2.3.4 Phương pháp chiết xuất 13

2.3.5.Xác định cấu trúc sản phẩm 13

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 14

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ naringin 14

3.2 Kết quả định tính và định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu 15

3.2.1 Kết quả định tính citroflavoid trong nguyên liệu 15

3.2.2 Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu 16

3.3 Kết quả nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid từ cùi bưởi 17

3.3.1 Lựa chọn dung môi chiết xuất 17

3.3.2.Lựa chọn phương pháp chiết xuất 18

3.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình chiết xuất 19

3.4 Quy trình chiết xuất và tinh chế naringin từ cùi bưởi 24

3.5.1 Tiến hành chiết xuất 24

3.5.2 Tinh chế naringin từ sản phẩm chiết xuất 25

3.5 Xác định cấu trúc sản phẩm 26

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN……… 30

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO………33

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

DĐVN IV Dược Điển Việt Nam IV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ naringin (µg/ml) 14 Bảng 3.2 Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu cùi bưởi 16

Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của thể tích dung môi ngâm nguyên liệu 20

Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của pH tới quá trình kết tinh sản phẩm 24

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian ngâm tới khối lượng sản phẩm và

hiệu suất chiết

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam Các cây thuộc chi này phần lớn

là các cây ăn quả cung cấp các chất dinh dưỡng như vitamin C, acid citric

[3] Ngoài ra, vỏ quả Citrus còn là nguyên liệu cho dược học cổ truyền với

các vị thuốc dân gian quen thuộc như: chỉ thực, chỉ xác, trần bì, thanh bì Ngày nay, nhiều nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng minh tác

dụng chữa bệnh của các flavonoid có trong vỏ quả Citrus Các nghiên cứu đã

tìm thấy sự có mặt của hơn 60 flavonoid trong vỏ của các loài trên, trong đó

có naringin [11] Naringin là một flavonoid tìm thấy hàm lượng cao trong vỏ quả loài bưởi với tác dụng như chống lão hóa, làm giảm cholesterol, ngăn ngừa cao huyết áp, giảm tai biến tim mạch, làm lành vết loét dạ dày, phòng chống ung thư và làm đẹp da [15], [20], [21]

Hiện nay, nước ta vẫn phải nhập khẩu nhiều thuốc mà thành phần có chứa naringin với giá cao Với công nghệ trong nước hiện nay thì hoàn toàn có khả năng sản xuất được những thuốc đó từ nguồn nguyên liệu có sẵn Như vậy, nếu khai thác tốt nguồn nguyên liệu này, sẽ phục vụ tốt được nhu cầu trong nước về thuốc có chứa hoạt chất naringin Để cung cấp naringin nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất thuốc đó, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên

cứu chiết xuất naringin từ cùi bưởi (Citrus grandis L.)” với mục tiêu:

1- Chiết xuất naringin từ cùi bưởi Citrus grandis L

2- Tinh chế, nhận dạng naringin có trong cùi bưởi

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về cây Bưởi

1.1.1 Tên gọi, vị trí phân loại

Citrus grandis (L.) Osbeck

Tên gọi khác: Citrus maxima ( Burm.) và Citrus decumana L

Họ Cam (Rutacea), Chi Citrus [2], [3], [4]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Bưởi là loại cây ăn quả Cây nhỡ cao từ 5-15 m, gai nhỏ mọc ở kẽ lá Lá

có hình trứng hoặc bầu dục đấy tròn hoặc hình tim, mép lá nguyên hoặc xẻ thùy nông, lấm tấm nhiều túi tinh dầu, cuống là có hình cánh tim ngược, rộng

cỡ 7 cm

Hoa mọc đơn độc ở nách lá hoặc từng chùm vài bông hoa, hoa mẫu 5, cánh hoa trắng, nhị 25- 30, bầu noãn có 11-16 noãn Quả mọng hình cầu hay hình lê, đường kính 10-30 cm, màu vàng xanh nhiều túi tinh dầu, vỏ dày 1- 4

cm, múi to màu hồng hoặc vàng nhạt Hạt vàng nhạt hoặc trắng, dẹt và có 1 phôi

Bưởi được trồng ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, các nước vùng Địa Trung Hải Ở Việt Nam bưởi được trồng ở hầu hết các tỉnh Những nơi nổi tiếng bưởi ngon: Đoan Hùng (Phú Thọ), Mê Linh (Vĩnh Phúc), Phúc Trạch, Hương Khê (Hà Tĩnh), Thanh Trà (Huế), Biên Hòa (Đồng Nai), Diễn (Hà Nội) [3], [4]

1.1.3 Bộ phận dùng, trồng trọt -thu hái

Hầu hết các bộ phận của cây bưởi ( quả, hoa, lá) đều có nhiều ứng dụng trong thực phẩm, y học Trong đề tài này sẽ tiến hành nhiên cứu với cùi bưởi ( phần trắng của vỏ bưởi) – chứa lượng lớn hoạt chất naringin

Bưởi được nhân giống bằng hạt, ghép mắt và chiết cành Ở Đông Nam Á

và Việt Nam chủ yếu là phương pháp chiết cành [4]

1.1.4 Thành phần hóa học

Trong phần ăn được (các tép bưởi) có chứa: nước (89%), protein(0,5%), lipid (0,4%), đường (9,3%), vitamin B1 (0,07%), viatmin B2 (0,01%) và vitamin C (44%)

Vỏ có chứa tinh dầu 15%, pectin và các hợp chất flavonoid (4,67%) Trong

đó naringin có hàm lượng cao Flavonoid : Naringin (2,39%), hesperidin (0,03%), neohesperindin (0,03%), diosmin (0,01%),rutin (0,02%)

Hạt có chứa pectin Hoa có chứa tinh dầu (0,01%)

Tinh dầu vỏ quả bưởi là chất lỏng màu vàng nhạt, mùi thơm, có hằng số:

d30: 0,8417, aD30: +103,62o, nD30: 1,4702 Thành phần chính là limonen (90

%), terpenalcol (2,5%), sesquiterpenalcol (3%)

Tinh dầu vỏ bưởi Việt Nam có thành phần chính là limonen (41,45 - 84,62

%), myrcen (8,28 - 50,66%) Các thành phần terpenalcol và aldehyd tồn tại ở hàm lượng rất thấp (<1%)

Hoa bưởi Việt Nam điều chế bằng phương pháp cất kéo hơi nước có thành phần chính là nerolidol (30,91 - 40,04%), farnesol (14,30 - 23,47%), linalol (9,22 - 23,76%) [4]

1.2 Đại cương về hoạt chất naringin

1.2.1 Công thức, tên khoa học

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của naringin

 Tên khoa học: glucopyranosyl)oxy)-2,3- dihydro-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on

1.2.3 Tính chất hóa học

 Tính acid yếu: Trong dung dịch kiềm loãng, naringin tạo muối phenolat

tan trong nước

 Phản ứng cyanidin: Phản ứng khử nhóm carbonyl của nhân ɣ-pyron tạo

anthocyan có màu

 Phản ứng với muối diazo: Phản ứng của hydro linh động với muối

diazo tạo sản phẩm azoic màu đỏ

 Phản ứng tạo phức: Phản ứng tạo phức chelat với muối kim loại nặng

của nhóm carbonyl ở C4 và hydroxy ở C5

O O

H3C

HO OH OHHO

HO

 Dễ bị oxy hóa: dễ bị oxy hóa bởi các tác nhân khử do có chứa 2 nhóm

–OH gắn với nhân thơm [1]

1.2.4 Tác dụng dược lý

 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng naringin có tác dụng làm giảm cholesterol, làm giảm LDL oxidation và có thể giúp ngăn ngừa tăng cholesterol máu, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch

 Chống oxy hóa, chống ung thư ác tính

 Ức chế virus Sindbis neurovirulent

 Được sử dụng trong điều trị các tổn thương dạ dày

1.3 Một số nghiên cứu về chiết xuất naringin

Vỏ bưởi được chiết bằng ethanol 96% theo phương pháp ngấm kiệt , dịch chiết bao gồm cả chất phân cực và ít phân cực, sau đó được cô tới cao đặc và loại tạp chất béo và chất ít phân cực bằng ether hoặc xăng vài lần, sau đó sản phẩm điều chỉnh pH trong môi trường nước acid chlohydric tới pH = 1 - 2, kết tinh lại trong dung môi ethanol, sấy và kiểm nghiệm thành phẩm Hiệu suất 2,3% Với quy trình này thì có sử dụng tới ether hoặc xăng là dung môi hữu cơ độc với môi trường nên gặp vấn đề kiểm soát dung môi hữu cơ khi

áp dụng qui mô lớn [6], [7 ], [14]

Với quy trình chiết xuất bằng nước nóng Nguyên liệu sau khi chia nhỏ tới kích thước xác định, được ngâm với nước nóng, chiết 2 lần mỗi lần trong 30 phút, vắt và ép dịch chiết qua vải lọc, dịch chiết được gộp lại sau đó đem cô tới dịch Hòa tan dịch thu được với ethanol 96% để sản phẩm pectin, dịch còn lại đem cô tới cắn, sau đó hòa tan trong dung môi ethanol 96% - nước (1: 3), sản phẩm sau đó kết tinh đem lọc và sấy khô Hiệu suất 1,7% Quy trình này dung môi rẻ tiền, không độc hại nhưng có nhược điểm là dịch chiết rất nhớt, rất khó lọc để thu sản phẩm pectin, bên cạnh đó để bay hơi hết dung môi nước cần có lượng nhiệt lớn khá tốn kém [7], [9], [12]

Với phương pháp chiết bằng methanol Nguyên liệu đã chia nhỏ tới kích thước xác định được ngâm trong methanol sau đó thu lấy dịch chiết Dịch chiết được cô tới cắn sệt, sau đó đem hòa tan trong nước nóng, đun cách thủy

15 phút , lắc với diclomethan gạn lấy lớp nước, cuối cùng để lạnh kết tinh, lọc

và thu sản phẩm Hiệu suất 2,4% Quy trình này cho sản phẩm sạch,hiệu suất cao, tuy nhiên trong quy trình sử dụng nhiều dung môi độc hại, dễ cháy nổ, khả năng bay hơi rất cao nên khó áp dụng trong quy mô lớn, chủ yếu sử dụng trong quy mô phòng thí nghiệm [23]

Quy trình chiết vỏ bưởi bằng dung môi kiềm Nguyên liệu sau khi xử lý, được ngâm với vôi sữa (CaO trong nước), hoạt chất có tính acid yếu nên dễ tan trong kiềm Thu dịch chiết điều chỉnh về pH tới 2 bằng acid chlohydric, khi pH acid thì hoạt chất sẽ nằm dạng phân tử khó tan nên dễ kết tinh Sau đó sản phẩm được lọc và tiếp tục hòa tan trong dung dịch ethanol 96% ( tỷ lệ ethanol: nước= 1: 3) để kết tinh và thu sản phẩm.Hiệu suất 0,6% Quy trình này, có ưu điểm không dung dung môi hữu cơ độc hại, dung môi rẻ tiền, tuy nhiên quy trình này cho hiệu suất chiết rất thấp [5], [13]

Một số sản phẩm chứa naringin trên thị trường kết hợp với vitamin C và hesperidin như: Swanson Naringin 500 mg, Hi-Potency Vitamin C &

Bioflavonoids Complex, NOW Citrus Bioflavonoid, Vitamin C and Bioflavonoid Hypoallergenic Dietary Supplement… Các sản phẩm trong 1 viên chứa ≤ 150 mg naringin

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Vỏ Bưởi được thu gom tại khu vực Bắc Từ Liêm - Hà Nội, vào tháng 12

Vỏ quả Bưởi sau khi mua về được loại bỏ mốc, bỏ phần chứa tinh dầu (vỏ ngoài), sấy ở nhiệt độ 60 – 70℃ trong 24 giờ, xay thành bột thô Đóng túi kín bảo quản ở điều kiện phòng để nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nơi sản xuất Tiêu chuẩn

2 Acid acetic Trung Quốc Tinh khiết hóa học

3 Nước cất Việt Nam DĐVN IV

4 Dung dịch sắt (III) chlorid Trung Quốc Tinh khiết hóa học

5 Ethanol 96% Việt Nam DĐVN IV

6 Aceton Việt Nam DĐVN IV

7 Acid chlohydric Trung Quốc Tinh khiết hóa học

8 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết hóa học

9 Than hoạt Trung Quốc Tinh khiết hóa học

10 Chloroform Trung Quốc Tinh khiết hóa học

11 Acid sunfuric đậm đặc Trung Quốc Tinh khiết hóa học

12 Natri hidroxyd Trung Quốc Tinh khiết hóa học

 Thiết bị:

 Cân phân tích Sartorius TE 214S (Anh)

 Máy xác định hàm ẩm Sartorius, MA – 45 (Anh)

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Máy quang phổ UV-VIS Hitachi (Nhật Bản)

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy

 Máy cô quay chân không Buchi (Thụy Sĩ)

 Máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 nicolet

 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Avance 500 - Bruker

 Máy soi UV Speccord 40 (Đức)

 Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ)

 Các dụng cụ phòng thí nghiệm khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quy trình chiết xuất citroflavoid từ cùi bưởi: dung môi chiết xuất, phương pháp chiết xuất, thể tích dung môi chiết, thời gian chiết, số lần chiết, pH của dung dịch kết tinh

 Xây dựng quy trình chiết naringin từ cùi bưởi mẻ 100 g

 Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm

Xác định bằng máy xác định hàm ẩm

Chuẩn bị khoảng 1 g mẫu thử xác định hàm ẩm

2.3.2 Phương pháp định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi

Định tính naringin trong nguyên liệu cùi bưởi sơ bộ bằng phản ứng hóa học

và sắc ký lớp mỏng

 Phản ứng hóa học:

Tiến hành: cân 1 g nguyên liệu, đun cách thủy với 5 ml ethanol 96% trong

15 phút, lọc dịch chiết chia vào 5 ống nghiệm để làm các phản ứng sau

 Phản ứng cyanidin: thêm ít bột Mg vào, sau đó tiếp tục thêm 2 ml acid HCl 5% vào Quan sát hiện tượng

 Phản ứng với FeCl3: cho thêm vào ống nghiệm vài giọt FeCl3 Quan sát hiện tượng

 Phán ứng H2SO4 đậm đặc: thêm vào ống nhiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc Quan sát hiện tượng

 Phản ứng với NaOH: thêm vào ống nghiệm vài giọt NaOH 1N Quan sát hiện tượng [2], [22]

 Sắc ký lớp mỏng:

 Pha động: n-butanol: acid acetic: nước = 4: 1: 5 (tl/tl)

 Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 F254 hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút

 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch chuẩn naringin có nồng độ khoảng 0,2 mg/ml pha trong ethanol 96%

 Dung dịch mẫu thử: lấy khoảng 0,5 g mẫu thử đun với 4ml ethanol 96% trong 15 phút, lọc, thu được dung dịch chấm sắc ký

 Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 µl dịch chiết dịch chiết mỗi mẫu Tiến hành triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra khi chạy 8cm, để khô Soi bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm [5], [8], [16]

2.3.3 Phương pháp định lượng naringin

Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS, xác định sơ bộ hàm lượng citroflavonoid có trong mẫu thử [8]

 Nguyên tắc:

Naringin hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 283-284 nm [2]

Do vậy, có thể xác định hàm lượng của citroflavonoid toàn phần trong

nguyên liệu và sản phẩm tính theo chất chuẩn naringin bằng phương pháp đo quang phổ UV-VIS

 Tiến hành:

 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 15 mg naringin đối chiếu vào bình định mức 25

ml, thêm khoảng 15 ml ethanol 96% hòa tan, sau đó bổ sung ethanol 96% vừa đủ tới vạch thu được dung dịch chuẩn gốc

Từ dung dịch chuẩn gốc pha dung dịch có nồng độ tương ứng 8, 10, 12,

16, 20, 24 (µg/ml) xây dựng đường chuẩn Đo độ hấp thụ tại bước sóng 283

nm, mẫu trắng là ethanol 96%

 Chuẩn bị mẫu thử

* Chuẩn bị mẫu thử chiết từ nguyên liệu cùi bưởi

Cân 2,5 g bột nguyên liệu cho vào giấy lọc, gấp lại, rồi cho vào bình

Soxhlet Chiết với n-hexan trong 3 giờ, lấy túi lọc nguyên liệu ra để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ phòng rồi cho vào bình Shoxlet chiết tiếp với ethanol

96% trong 3 giờ Dịch chiết thu được chuyển vào bình cất quay và đem cô dưới áp suất giảm đến cắn Hòa cắn trong 50 ml ethanol 96% rồi chuyển sang bình định mức 100 ml Rửa bình cầu 2-3 lần, mỗi lần khoảng 10 ml ethanol 96%, sau đó thêm vừa đủ ethanol 96% tới vạch Hút chính xác khoảng 1ml dịch thu được cho vào bình định mức 50 ml Thêm ethanol 96% vừa đủ tới vạch và lắc đều thu được dung dịch thử Đo độ hấp thụ tại bước sóng 283 nm, mẫu trắng là ethannol 96%

* Chuẩn bị mẫu thử từ sản phẩm của quá trình chiết xuất

Cân chính xác 1 lượng sản phẩm tương đương khoảng 15 mg naringin vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml ethanol 96% để hòa tan, sau

đó thêm ethanol 96% vừa đủ tới vạch Hút chính xác khoảng 2 ml dung dịch

thu được vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ tới vạch, lắc đều Đo độ hấp thụ tại bước sóng 283 nm, mẫu trắng ethanol 96%

X%: hàm lượng phần trăm citroflavonoid toàn phần trong mẫu thử

CT: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml) a: hàm lượng naringin chuẩn (%)

b: hàm ẩm của mẫu thử (%)

mT: khối lượng mẫu thử (g)

VT: thể tích của dung dịch thử (ml)

AT: mật độ quang của dung dịch thử và chuẩn

fT: hệ số pha loãng của dung dịch thử và chuẩn

 Hiệu suất chiết citroflavonoid toàn phần

Trong đó:

C: nồng độ mẫu thử tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml) a: hàm lượng chuẩn naringin (%)

V: thể tích dung dịch mẫu thử (ml)

f: độ pha loãng mẫu thử

m: khối lượng vỏ bưởi đem chiết (g)

c: hàm ẩm nguyên liệu khi đem chiết (%)

X: hàm lượng citroflavonoid toàn phần (%)

2.3.4 Phương pháp chiết xuất

Cân khoảng 50 g nguyên liệu, cho vào bình chiết, thêm dung môi Sau thời gian thu dịch chiết, sau đó cô thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn trong 50 ml ethanol 96%, lọc Dịch lọc ethanol tiếp tục cô đến cắn, hòa tan cắn trong 30 ml nước nóng, lọc, thêm 10 ml ethanol 96% Để kết tinh lạnh, lọc, sấy được sản phẩm

2.3.5 Xác định cấu trúc sản phẩm

 Phản ứng định tính hóa học: xác định sự có mặt của flavonoid trong sản phẩm thu được sau khi chiết xuất (tương tự phần định tính trong nguyên liệu 2.3.1)

 Sắc ký lớp mỏng: xác định sơ bộ tính tinh khiết của flavonoid thu được, kết luận sơ bộ về flavonoid có thể là naringin hay không so với vết chuẩn naringin về Rf (tương tự phần định tính nguyên liệu 2.3.1)

 Đo phổ UV-VIS, IR, NMR để chứng minh cấu trúc naringin

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ naringin

-Chuẩn bị nồng độ chuẩn naringin như mục 2.3.3 Kết quả quét phổ UV-VIS:

Hình 3.1 Phổ UV- VIS naringin chuẩn nồng độ 11,71 (µg/ml)

trong ethanol 96%

Nhận xét: Quét phổ naringin chuẩn thấy có 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng 283,0 nm và 320,0 nm Chọn bước sóng 283,0 nm để đo mật độ quang cho bước sau

-Xác định sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ naringin: Tiến hành

pha các dung dịch chuẩn như mục 2.3.3 Kết quả mật độ quang ở mỗi nồng

độ được ghi ở bảng 3.1

ảng3.1 Mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ naringin (µg/ml)

Nồng độ naringin (µg/ml) 7,32 9,37 11,71 14,64 18,30 23,42

Mật độ quang 0,218 0,290 0,338 0,444 0,576 0,732

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối liên quan giữa mật độ quang và nồng độ

naringin

Phương trình biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ naringin: y = 0,3218x - 0,0215 (trong đó : y là mật độ quang, x là nồng độ dung dịch naringin (µg/ml))

Nhận thấy phương trình có R2 = 0,9972 (R2 > 0,99) Nên có sự tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ naringin trong khoảng 7,32-23,42 µg/ml

3.2 Kết quả định tính và định lƣợng citroflavonoid trong nguyên liệu

3.2.1 Kết quả định tính citroflavoid trong nguyên liệu

-Định tính citroflavonoid bằng phản ứng hóa học: chuẩn bị 5 mẫu dịch chiết nguyên liệu bằng dung môi ethanol 96% Tiến hành như mục 2.3.2 Kết quả:

A: Dịch chiết nguyên liệu B: Phản ứng với NaOH C: Phản ứng với cyanidin D: Phản ứng với FeCl3

E: Phản ứng với H2SO4

Hình 3.3 Kết quả định tính hóa học nguyên liệu cùi bưởi

y = 0,0322x - 0,0215 R² = 0,9972

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Bên B: Vết naringin chuẩn trong ethanol

Hệ dung môi khai triển: n-butanol: acid acetic: nước = 4: 1: 5

Soi dưới đèn tử ngoại bước song 254 nm

Hình 3.4 Sắc ký đồ của dịch chiết nguyên liệu

Qua sắc ký đồ thấy có xuất hiện vết dịch chiết nguyên liệu có Rf bằng với

Rf của vết naringin chuẩn Kết luận: Trong nguyên liệu có chứa naringin và các flavonoid khác Gọi chung là nhóm citroflavonoid

3.2.2 Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu

Chuẩn bị 4 mẫu nguyên liệu định lượng citroflavonoid, tiến hành như mục 2.3.4, kết quả thu được trình bày dưới bảng sau:

ảng 3.2 Kết quả định lượng citroflavonoid trong nguyên liệu cùi bưởi

Thông số Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Khối lượng nguyên liệu (g) 2,5176 2,4526 2,4931 2,5023 Mật độ quang 0,640 0,529 0,626 0,631 Hàm lượng citroflavonoid (%) 4,14 3,94 4,09 4,11

Từ kết quả của bảng trên, tính được hàm lượng trung bình citrofalvonoid toàn phần có trong nguyên liệu là: 4,07%

3.3 Kết quả nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid từ cùi bưởi

3.3.1 Lựa chọn dung môi chiết xuất

Lựa chọn dung môi chiết xuất là lựa chọn đầu tiên để chiết xuất nguyên liệu Dung môi phải đáp ứng được các yêu cầu về khả năng hòa tan dược chất, tính chọn lọc, dễ thu hồi dung môi, tính an toàn dung môi, hiệu suất chiết, rẻ tiền Đối với các dung môi chiết xuất naringin từ cùi bưởi, dung môi methanol khá độc nên chủ yếu sử dụng trong phòng thí nghiệm Nước nóng là một dung môi rẻ tiền, ít độc nhưng lại dung môi này lại khó bay hơi, quá trình chiết xuất cần thiết bị gia nhiệt, dịch chiết rất nhớt Dung môi kiềm thì ít độc,

rẻ tiền nhưng hiệu suất không cao

Trong đề tài này, sẽ nghiên cứu 2 dung môi ethanol và aceton để lựa chọn được dung môi tối ưu nhất Khảo sát 2 dung môi aceton, ethanol96% và các dung môi có tỷ lệ aceton: ethanol 96% lần lượt là 75:25, 50:50, 25:75 Sau đó tiến hành như quy trình mục 2.3.4, ngâm 1 lần ×24 giờ ×300 ml Kết quả thu được trình bày bảng sau

ảng 3.3 Kết quả ảnh hưởng của dung môi chiết xuất

Dung môi Aceton

Tỷ lệ dung môi aceton:

EtOH 96%

75:25

Tỷ lệ dung môi aceton:

EtOH 96%

50:50

Tỷ lệ dung môi aceton:

EtOH 96%

25:75

Ethanol 96%

Khối lượng sản

phẩm (g) 0,37 0,33 0,32 0,21 0,32 Hàm lượng (%) 93,60 94,40 93,17 90,40 91,38 Hiệu suất ( %) 19,26 17,27 16,60 10,42 16,08

Nhận xét: Khối lượng sản phẩm của dung môi aceton là cao nhất và hiệu suất chiết cũng cao nhất Hàm lượng không có sự khác biệt giữa các mẫu Khi tiến hành chiết xuất nhận thấy dung môi aceton dễ bay hơi hơn dung môi ethanol 96% nên quá trình thu hồi dung môi không tốn nhiều năng lượng Đặc biệt, quá trình tinh chế loại tạp cắn chiết aceton chỉ sử dụng các dung môi đơn giản như ethanol 96% và nước Trong khi đó đối với cắn chiết ethanol phải sử dụng ether dầu hỏa để loại tạp Nhược điểm của dung môi aceton là bay hơi nhanh nên khi chiết cần thiết bị kín đế không thất thoát dung môi Vì thế, chọn dung môi aceton làm dung môi ngâm cho các khảo sát sau

3.3.2 Lựa chọn phương pháp chiết xuất

Phương pháp ngâm và phương pháp ngấm kiệt là 2 phương pháp hay được sử dụng nhiều nhất Với mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng về thuận tiện, chi phí, hiệu suất

Trong đề tài này, sẽ nghiên cứu 2 phương pháp chiết ngâm và ngấm kiệt

để chọn được phương pháp chiết xuất tối ưu Chuẩn bị nguyên liệu cho 2 mẫu, tiến hành như mục 2.3.4 Phương pháp ngâm 2 lần ×24 giờ×200 ml, phương pháp ngấm kiệt ngâm trong 24 giờ rút khoảng 300 ml dịch chiết trong

4 giờ

Kết quả khảo sát phương pháp chiết xuất được trình bày bảng sau:

ảng 3.4 Ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất

Phương pháp Phương pháp ngâm Phương pháp ngấm kiệt