Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành các gai thần kinh (dendritic spine) ở tế bào thần kinh (neuron) trên mô hình nuôi cấy tế bào.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 FOXG1 THÚC ĐẨY SỰ HÌNH THÀNH CÁC GAI THẦN KINH Ở NƠRON – MỘT CƠ CHẾ TIỀM NĂNG TRONG SINH LÝ BỆNH CỦA HỘI CHỨNG WEST Mai Phương Thảo*, Đỗ Đức Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng biểu vượt mức protein FoxG1 hình thành gai thần kinh (dendritic spine) tế bào thần kinh (neuron) mơ hình ni cấy tế bào Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, nuôi cấy tế bào thần kinh não chuột Kết quả: Biểu vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy hình thành gai thần kinh sợi đuôi gai tế bào thần kinh Kết luận: Nghiên cứu góp phần củng cố mối liên quan hội chứng West protein FoxG1 đồng thời phần làm sáng tỏ chế sinh bệnh hội chứng West vốn chưa hiểu biết tường tận Từ Khóa: Protein FoxG1, biểu vượt mức, tế bào thần kinh (neuron), sợi thần kinh (neurite), sợi trục (axon), đuôi gai (dendrite), gai thần kinh (dendritic spine), hội chứng West ABSTRACT FOXG1 PROMOTES THE FORMATION OF DENDRITIC SPINES – A POTENTIAL MECHANISM FOR WEST SYNDROME PATHOPHYSYOLOGY Mai Phuong Thao, Do Duc Minh* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 24 - 28 Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the formation of dendritic spines in vitro Materials – Methods: Case series report using mouse neuronal culture Results: Overexpression of FoxG1 promotesthe formation of dendritic spine Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathophysiology which remains unclear Key words: FoxG1 (forkhead box protein G1), overexpression, neuron, neurite, axon, dendrite, dendritic spine, West syndrome sinh hội chứng West protein FoxG1, cụ ĐẶT VẤN ĐỀ thể tăng cường biểu protein Các gai thần kinh (dendritic spine) phần FoxG1, nơron thần kinh có khuynh hướng màng tế bào lồi sợi gai thần kinh, hình thành nhiều sợi thần kinh (neurite) hơn, nơi tiếp hợp xi náp thần kinh, mà chủ đặc biệt sợi gai (dendrite) Forkhead yếu xi náp kích thích (excitatory synapses) box protein G1 (FoxG1) protein mã hóa vùng vỏ đại não(15) Các gai thần kinh từ gen FOXG1 nhánh dài nhiễm sắc thể 14 hình thành biến nhanh chóng, (14q12) Đây protein kiểm sốt phiên mã có thơng thường, chúng tăng cường hình vai trò quan trọng việc hình thành não thành khu vực có hoạt động điện mạnh giai đoạn phơi thai (hình thành não bộ, với vai trò hỗ trợ tín hiệu điện phân vùng não bộ, kiểm sốt phân bào trình dẫn truyền thần kinh(16) Gần đây, tế bào đầu dòng thần kinh…)(10,11) phát mối liên quan chế bệnh * Bộ sinh Sinh lý học, ĐH Y Dược TPHCM ** Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS Đỗ Đức Minh, ĐT: 0932999989, Email: mdt14284@yahoo.com 24 Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 giai đoạn trưởng thành (duy trì tân tạo neuron nhằm phục vụ cho chức thần kinh cao cấp)(6,14) Hội chứng West (West syndrome), đặt theo tên bác sĩ người anh William James West, mội hội chứng động kinh gặp trẻ em trẻ nhũ nhi Tần suất mắc bệnh trẻ sinh vào khoảng 1/2000 đến 1/4000(8) Biểu lâm sàng hội chứng West gồm có tam chứng: động kinh, bất thường EEG đột ngột, lan tỏa với hình ảnh sóng cao khơng đồng dạng (hypsarrhythmia) đặc trưng chậm phát triển trí tuệ Các biểu lâm sàng giải thích tình trạng tăng hoạt động điện mức não bộ(3, 5) Như mô tả trên, gai thần kinh tăng cường hình thành khu vực hoạt động điện mạnh, vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm khảo sát thay đổi mật độ gai thần kinh sợi đuôi gai tế bào thần kinh chúng tăng cường biểu protein FoxG1 ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Động vật thực nghiệm Dòng chuột CD1 wild-type (wt) dùng nghiên cứu nuôi dưỡng phát triển sở động vật viện SISSA, TriesteItaly Nuôi cấy tế bào thần kinh Mô não chuột 16.5 ngày tuổi cắt nhỏ vòng 5-8 phút dung dịch lạnh chứa 1X PBS-0,6% glucose-0,1% DNaseI Các mẫu sau ủ với dung dịch trypsin nồng độ 1mg/ml phút Dung dịch trypsin trung hòa FBS 10%, mẫu mô lớn lắng xuống đáy ống nghiệm sau phút tách bỏ, phần tế bào dung dịch phía thu đếm số lượng Cuối tế bào nuôi cấy môi trường dành riêng cho nơron: 1:1 Neurobasal A, 1X Glutamax (Gibco), 1X yếu tố B27 (Invitrogen), 0,5mM glutamine, 25μM β-Mercaptoethanol, 1X Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml fungizone (Gibco) với mật độ ban đầu 3*105 tế Thần kinh Nghiên cứu Y học bào/giếng đĩa nuôi cấy 24 giếng Môi trường nuôi cấy thay 3,5 ngày Lenti virus vector Lenti virus hệ thứ chuẩn bị theo protocol Follenzi Naldini cách biến nạp plasmid khung virus plasmid mang gen cần biểu vào tế bào HEK293T(7) Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu virion hòa tan virion PBS Nồng độ virion định lượng RT-PCR(13) Miễn dịch huỳnh quang Tế bào nuôi cấy cố định dung dịch paraformaldehyt 4% 20 phút Sau đó, tế bào ủ với dung dịch blocking (1X PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA 0.1% Triton X100) giờ, kháng thể ủ qua đêm nhiệt độ 4oC, kháng thể ủ nhiệt độ phòng Cuối cùng, tế bào nhuộm với dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone) 10 phút nhiệt độ phòng Phân tích xử lý hình ảnh Hình ảnh chụp kính hiển vi Confocal Leica vật kính 63X sau xử lý phần mềm GIMP 2.6 Image J để phân tích Các gai thần kinh đếm số lượng chia cho diện tích bề mặt sợi gai để thu thông số mật độ gai thần kinh điện tích sợi gai Phân tích thống kê Các thí nghiệm thực lặp lại lần Kết kiểm định ttest cho có ý nghĩa thống kê trị số p < 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FoxG1 thúc đẩy hình thành gai thần kinh nơron Để đánh giá tác động FoxG1 hình thành gai thần kinh, chúng tơi phân lập tế bào thần kinh từ phôi chuột 16,5 ngày tuổi sau gây nhiễm tế bào với 25 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 phức hợp vector lenti virus hình Mỗi vector virus dùng để gây nhiễm với hệ số (MOI=8, MOI: Multiplicity of infection), nghĩa dùng virion để gây nhiễm tế bào Để kích hoạt bất hoạt gen FoxG1 vào thời điểm q trình thí nghiệm, chúng tơi sử dụng kĩ thuật TetON(2) Trong kĩ thuật này, FoxG1 không biểu trực tiếp tác động promoter ptα1 mà kích hoạt gián tiếp qua promoter TRE (tetracycline respone element), promoter TRE lại chịu kiểm sốt phức hợp ptα1-rtTA Trong mơi trường ni cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất nhóm tetracycline) rtTA kích hoạt TRE từ phiên mã gen FoxG1 ngược lại mơi trường khơng có Doxycycline, trình bị bất hoạt Các tế bào chia làm nhóm, nhóm gây nhiễm với vector giúp tăng biểu protein FoxG1 (phức hợp a-b1) nhóm chứng gây nhiễm với vector biểu protein PLAP (phức hợp a-b2); protein khơng có hoạt tính sinh học tế bào thần kinh nơron tế bào tăng cường hoạt động điện(9) Hình 2: Tóm tắt quy trình thực nghiên cứu Cuối tế bào nhuộm miễn dịch huỳnh quang với Map2 (nhằm đánh giá cấu trúc sợi đuôi gai) PSD95 (đánh giá gai thần kinh) (hình 3) Hình 3: Kết miễn dịch huỳnh quang sợi đuôi gai (MAP2) gai thần kinh (PSD95) Hình 1: Các vector lenti virus dùng nghiên cứu Sau gây nhiễm, tế bào nuôi cấy biệt hóa vòng ngày mà khơng có doxycyclin (các gen tăng biểu protein FoxG1 PLAP chưa kích hoạt) Sau ngày, 2μg/ml Doxycyclin thêm vào mơi trường ni cấy nhằm kích hoạt sản xuất protein FoxG1 PLAP tế bào Đến ngày thứ 10 (5 ngày sau thêm Doxycyclin), tế bào nhóm FoxG1 PLAP lại chia làm nhóm với nhóm chứng nhóm kích thích gây khử cực cách thêm vào mơi trường ni cấy 50mM KCl vòng 12 (hình 2) Mục đích việc khử cực nhằm đánh giá khả hình thành gai thần kinh 26 Vì hình ảnh thu từ kính hiển vi confocal hình ảnh chiều, đồng thời cấu trúc sợi đuôi gai khác nhau, nên chúng tơi lựa chọn phân tích mật độ gai thần kinh đơn vị diện tích gai Từ hình ảnh thu sau chụp với kính hiển vi confocal, chúng tơi đếm số lượng gai thần kinh sợi đuôi gai, diện tích sợi gai tính phần mềm ImageJ Như mơ tả trước đó, ta khử cực nơron dung dịch kali clorua, mật độ gai thần kinh tăng lên 1,66 lần Điều đặc biệt tế bào tăng cường biểu FoxG1 đơn thuần, mật độ gai thần kinh tăng lên 2,63 lần so với tế bào chứng, kết hợp kali clorua tăng biểu protein FoxG1, mật độ gai thần kinh tăng lên đến 3,34 Chuyên Đề Nội Khoa II Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học lần (mật độ gai thần kinh nhóm chứng trung bình 0,17±0,03/μm2) (hình 4) Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành gai thần kinh KẾT LUẬN Các nơron thần kinh biểu vượt mức protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh chứng gián tiếp cho thấy tăng cường hoạt động điện nơron Từ cho thấy protein FoxG1 nguyên nhân tiềm sinh lý bệnh hội chứng West TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 4: Biểu đồ so sánh mật độ gai thần kinh diện tích gai thí nghiệm (so với nhóm chứng khơng khử cực kali clorua không tăng cường biểu FoxG1) BÀN LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, kết luận việc tăng cường biểu FoxG1 tế bào thần kinh thúc đẩy hình thành gai thần kinh nhiều so với tế bào thần kinh thông thường Kết chứng gián tiếp cho thấy tăng cường hoạt động điện nơ ron thần kinh tăng biểu protein FoxG1 từ cho thấy mối liên quan tình trạng lặp đoạn nhiễm sắc thể số 14 mang gene FOXG1 hội chứng West Cơ chế phân tử việc thúc đẩy hình thành gai thần kinh FoxG1 kiến nghị hình 5, FoxG1 ức chế protein pSmad (pSmad2,3), protein pSmad cần thiết cho hình thành protein Mdm2 để lần ức chế PSD95 protein quan trọng việc hình thành trì ổn định gai thần kinh(1,4, 12) Bước đào sâu đường tín hiệu nhằm hiểu biết rõ vai trò phân tử FoxG1 hôi chứng West Thần kinh 10 11 Araki S, Eitel JA, Batuello CN, Bijangi-Vishehsaraei K, Xie XJ, Danielpour D, Pollok KE, Boothman DA, Mayo LD (2010) TGF-beta1-induced expression of human Mdm2 correlates with late-stage metastatic breast cancer J Clin Invest, 120(1):290–302 Brancaccio M, Pivetta C, Granzotto M, Filippis C, Mallamaci A (2010) Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis Stem Cells Dayt Ohio, 28(7):1206–1218 Chugani HT, Shields WD, Shewmon DA, Olson DM, Phelps ME, Peacock WJ (1990) Infantile spasms: I PET identifies focal cortical dysgenesis in cryptogenic cases for surgical treatment Ann Neurol, 27(4):406–413 Colledge M, Snyder EM, Crozier RA, Soderling JA, Jin Y, Langeberg LK, Lu H, Bear MF, Scott JD (2003) Ubiquitination regulates PSD-95 degradation and AMPA receptor surface expression Neuron, 40(3):595–607 Desguerre I, Pinton F, Nabbout R, Moutard ML, N’Guyen S, Marsac C, Ponsot G, Dulac O (2003) Infantile spasms with basal ganglia MRI hypersignal may reveal mitochondrial disorder due to T8993G MT DNA mutation Neuropediatrics, 34(5):265–269 Fasano CA, Phoenix TN, Kokovay E, Lowry N, Elkabetz Y, Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009) Bmi-1 cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell selfrenewal in the forebrain Genes Dev, 23(5):561–574 Follenzi A, Naldini L (2002) HIV-based vectors Preparation and use Methods Mol Med, 69:259–274 Hrachovy RA, Frost JD (1989) Infantile spasms Pediatr Clin North Am, 36(2):311–329 Kim TK, Hemberg M, Gray JM, et al (2010) Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers Nature, 465(7295):182–187 Martynoga B, Morrison H, Price DJ, Mason JO (2005) Foxg1 is required for specification of ventral telencephalon and regionspecific regulation of dorsal telencephalic precursor proliferation and apoptosis Dev Biol, 283(1):113–127 Muzio L, Mallamaci A (2005) Foxg1 confines Cajal-Retzius neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the dorsomedial pallium J Neurosci Off J Soc Neurosci, 25(17):4435–4441 27 Nghiên cứu Y học 12 13 14 28 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Rodriguez C, Huang LJ, Son JK, McKee A, Xiao Z, Lodish HF (2001) Functional cloning of the proto-oncogene brain factor-1 (BF-1) as a Smad-binding antagonist of transforming growth factor-beta signaling J Biol Chem, 276(32):30224–30230 Sastry L, Johnson T, Hobson MJ, Smucker B, Cornetta K (2002) Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods Gene Ther, 9(17):1155–1162 Shen L, Nam HS, Song P, Moore H, Anderson SA (2006) FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in the postnatal hippocampus and contextual memory deficits Hippocampus, 16(10):875–890 15 16 Spruston N (2008) Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration Nat Rev Neurosci, 9(3):206–221 Yuste R (2013) Electrical compartmentalization in dendritic spines Annu Rev Neurosci, 36:429–449 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 Chuyên Đề Nội Khoa II ... (mật độ gai thần kinh nhóm chứng trung bình 0,17±0,03/μm2) (hình 4) Hình 5: Cơ chế phân tử giả thiết để giải thích tượng FoxG1 thúc đẩy hình thành gai thần kinh KẾT LUẬN Các nơron thần kinh biểu... mang gene FOXG1 hội chứng West Cơ chế phân tử việc thúc đẩy hình thành gai thần kinh FoxG1 kiến nghị hình 5, FoxG1 ức chế protein pSmad (pSmad2,3), protein pSmad cần thiết cho hình thành protein... protein FoxG1 hình thành nhiều gai thần kinh chứng gián tiếp cho thấy tăng cường hoạt động điện nơron Từ cho thấy protein FoxG1 nguyên nhân tiềm sinh lý bệnh hội chứng West TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình