Nghiên cứu với mục tiêu nhằm khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành tế bào thần kinh (neuron) và tế bào sao trên mô hình in vivo. Nghiên cứu thực hiện ghép các tế bào đầu dòng thần kinh vào não chuột.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 Nghiên cứu Y học VAI TRÒ CỦA FOXG1 ĐỐI VỚI SỰ MẤT CÂN BẰNG TRONG QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH NEURON VÀ TẾ BÀO SAO TRONG HỘI CHỨNG WEST Mai Phương Thảo* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng biểu vượt mức protein FoxG1 hình thành tế bào thần kinh (neuron) tế bào mơ hình in vivo Đối tượng – Phương pháp: Mơ tả hàng loạt ca, ghép tế bào đầu dòng thần kinh vào não chuột Kết quả: Biểu vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy hình thành tế bào thần kinh ức chế hình thành tế bào Kết luận: Nghiên cứu góp phần củng cố mối liên quan hội chứng West protein FoxG1 đồng thời phần làm sáng tỏ chế sinh bệnh hội chứng West vốn chưa hiểu biết tường tận Từ khóa: Protein FoxG1, biểu vượt mức, tế bào đầu dòng thần kinh, tế bào thần kinh (neuron), tế bào sao, hội chứng West ABSTRACT THE ROLE OF FOXG1 IN NEUROGENESIS AND GLIOSIS IMBALANCE IN WEST SYNDROME PATHOGENESIS Mai Phuong Thao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - Supplement of No - 2015: 291 - 296 Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the the formation of neurons and astrocytes in vivo Materials – Methods: Case series report using neuronal progenitor transplantation on mouse brain Results: Overexpression of FoxG1 promotes neurogenesis and inhibits gliogenesis Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathogenesis which remains unclear Key words: FoxG1 (forkhead nox protein G1), overexpression, neuronal progenitor, neurons, astrocytes, West syndrome chứng West chưa hiểu biết đầy đủ ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiều giả thiết đặt ra, số đó, có giả Hội chứng West (West syndrome), đặt thiết cho tăng cường mức hoạt theo tên bác sĩ người anh William James động synap thần kinh dẫn đến tình trạng West, hội chứng động kinh gặp trẻ động kinh hình ảnh EEG bất thường Nếu em trẻ nhũ nhi Tần suất mắc bệnh trẻ tình trạng kích thích synap kéo dài dẫn đến sinh vào khoảng 1/2000 đến 1/4000(9) Biểu chậm phát triển tâm thần, vận động trẻ(4) Một lâm sàng hội chứng West gồm có tam chứng: số nghiên cứu gần đưa chứng cho động kinh, bất thường EEG đột ngột, lan tỏa thấy mối liên quan mật thiết hội chứng với hình ảnh sóng cao khơng đồng dạng West lặp đoạn dài nhiễm sắc thể số 14 (hypsarrhythmia) đặc trưng chậm phát triển (14q12), có chứa gen FoxG1(1,12) đóng vai trò quan trí tuệ Tuy nhiên chế bệnh sinh hội * Bộ môn Sinh lý học, ĐH Y Dược TpHCM Tác giả liên lạc: TS.BS Mai Phương Thảo Thần Kinh ĐT: 091832 9999 Email: maithao292@gmail.com 291 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 trọng trình hình thành não thời kì phơi thai Forkhead box protein G1 (FoxG1) protein mã hóa từ gen FoxG1 NST 14 Đây protein kiểm sốt phiên mã có vai trò quan trọng việc hình thành não giai đoạn phơi thai (hình thành não bộ, phân vùng não bộ, kiểm soát phân bào tế bào đầu dòng thần kinh…)(8,10,11) giai đoạn trưởng thành (duy trì tân tạo neuron nhằm phục vụ cho chức thần kinh cao cấp)(5,14) Rối loạn điều hòa hoạt động gen FoxG1 cho có liên quan đến chế bệnh sinh hội chứng West Trong nghiên cứu gần đây, nhóm tác giả việc tăng biểu protein FoxG1 mơ hình ni cấy tế bào đầu dòng thần kinh làm tăng q trình tạo thành neuron ức chế hình thành tế bào sao(2) Sự cân đối số lượng neuron tế bào ảnh hưởng lớn lên hoạt động điện não Do đó, tiến hành nghiên cứu tăng biểu protein FoxG1 mơ hình chuột thực nghiệm cách ghép tế bào đầu dòng thần kinh kích hoạt gen FoxG1 vào não chuột nhằm đánh giá biểu tế bào tảng cho nghiên cứu làm sáng tỏ chế bệnh sinh hội chứng West ĐỐI TƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Động vật thực nghiệm Các dòng chuột CD1 wild-type (wt), EGFP Tau-EGFP dùng nghiên cứu nuôi dưỡng phát triển sở động vật viện SISSA, Trieste-Italy Nuôi cấy tế bào Các tế bào đầu dòng thần kinh tách từ phơi chuột ni cấy dĩa 24 giếng với mật độ 3*105 tế bào / giếng 350 μl môi trường giúp tế bào sinh sản khơng biệt hóa: DMEM-F12, 1X Glutamax (Gibco), 1X N2 supplement (Invitrogen), mg/ml BSA, 0,6% glucose, μg/ml heparin (Stemcell technologies), 20 ng/ml bFGF (Invitrogen), 20 ng/ml EGF 292 (Invitrogen), 1X Penicillin/Streptomycin (Gibco), 10 pg/ml fungizone (Gibco) 2μg/ml doxycycline (Clontech) Lenti virus vector Lenti virus hệ thứ chuẩn bị theo protocol Follenzi Naldini cách biến nạp plasmid khung virus plasmid mang gen cần biểu vào tế bào HEK293T Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường nuôi cấy tế bào ly tâm 100.000g để thu virion hòa tan virion PBS Nồng độ virion định lượng RT-PCR Cấy ghép tế bào Các tế bào sau nuôi cấy thu lại huyền phù với nồng độ 50000 tế bào/μl Lấy μl dịch tế bào tiêm vào thùy thái dương não chuột sơ sinh (1-2 ngày tuổi) Hóa mơ miễn dịch huỳnh quang Mơ não chuột cắt với độ dày 10-22 μm Ủ mẫu mô với dung dịch blocking (1X PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA 0,1% Triton X100) giờ, kháng thể qua đêm nhiệt độ 4oC, kháng thể nhiệt độ phòng Sau đó, mẫu mô nhuộm với dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone) 10 phút nhiệt độ phòng Phân tích xử lý hình ảnh Hình ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang Nikon TI-E vật kính 20 40X sau xử lý phần mềm GIMP 2.6 Image J để phân tích số lượng loại tế bào Phân tích thống kê Các thí nghiệm thực lặp lại lần Kết kiểm định ttest cho có ý nghĩa thống kê trị số p < 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tế bào đầu dòng thần kinh có khả sống sót sau tiêm vào não chuột Chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm đánh giá khả sống sót tế bào đầu dòng Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 Nghiên cứu Y học thần kinh sau cấy vào não vật tiếp nhận Để theo dấu tế bào sau ghép, dùng dòng chuột biểu protein huỳnh quang GFP (green fluorescent protein) Tế bào đầu dòng thần kinh dòng chuột tách từ phôi chuột 12 ngày tuổi nuôi môi trường thuận lợi cho phân bào vòng ngày Đến ngày thứ 7, tế bào ghép vào thùy thái dương não chuột CD1 sơ sinh (chuột 1-2 ngày tuổi) với số lượng 150.000 tế bào/3μl Sau cấy ghép, chuột sơ sinh nuôi sữa mẹ đến trưởng thành Bằng phương pháp hóa mơ miễn dịch huỳnh quang, chúng tơi phát tế bào đầu dòng thần kinh sống sót tháng sau ghép mà hồn tồn khơng cần sử dụng liệu pháp ức chế miễn dịch (Hình 1) đầu dòng thần kinh, nhóm can thiệp FoxG1-GOF nhóm chứng vào vật tiếp nhận Hình Các tế bào đầu dòng thần kinh từ chuột EGFP sau ghép vào não chuột sơ sinh Tín hiệu huỳnh quang nhân màu xanh dương, protein EGFP màu xanh Hình ảnh chụp vật kính 20X 40X Tế bào đầu dòng thần kinh tách từ phơi chuột Tau-EGFP 12 ngày tuổi, sau biến nạp (transform) phức hợp Lenti virus vector mang gen mong muốn Để đảm bảo có tế bào đầu dòng thần kinh tăng cường biểu FoxG1, chúng tơi sử dụng promoter ptα1 - kích hoạt tế bào đầu dòng thần kinh Hơn nữa, để kích hoạt bất hoạt gen FoxG1 vào thời điểm q trình thí nghiệm, sử dụng kĩ thuật TetON (6, 7) Trong kĩ thuật này, FoxG1 không biểu trực tiếp tác động promoter ptα1 mà kích hoạt gián tiếp qua promoter TRE (tetracycline respone element), promoter TRE lại chịu kiểm soát phức hợp ptα1-rtTA Trong mơi trường ni cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất nhóm tetracycline) rtTA kích hoạt TRE từ phiên mã gen FoxG1 ngược lại mơi Thiết kế gen mã hóa FoxG1 Lenti virus vector chuẩn hóa qui trình cấy ghép tế bào đầu dòng thần kinh vào não chuột Từ kết bước đầu, nhận thấy số lượng tế bào thần kinh sống sót thay đổi tùy theo khả đáp ứng chuột nhận ghép Để đánh giá khách quan tính chất số lượng tế bào thần kinh can thiệp gen, cụ thể tăng cường khả biểu FoxG1 (gọi tắt tế bào FoxG1-GOF, với GOF gain of function), chúng tơi tiến hành thí nghiệm cấy ghép sử dụng đồng thời hai loại tế bào Thần Kinh Để tăng cường biểu protein FoxG1 tế bào đầu dòng thần kinh, chúng tơi sử dụng phương pháp chuyển gen vào tế bào Lenti virus vector Lenti virus nhánh virus thuộc hệ Retroviridae công cụ dùng để chuyển gen vào tế bào hiệu quả, chuyển đoạn gen mong muốn vào tế bào phân chia tế bào trưởng thành (các loại virus vector thơng thường khác có khả xâm nhập vào v giai đoạn phân chia)(3) Bộ khung Lenti virus vector hình thành từ chủng Lenti virus thông thường loại bỏ khả tự nhân lên virus sau xâm nhập vào gen Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng tế bào đầu dòng thần kinh từ dòng chuột biểu Tau-EGFP, chứa gen mã hóa cho protein EGFP gắn sau trình tự gen mã hóa cho protein Tau Protein Tau protein biểu tế bào neuron trưởng thành, với dòng chuột đột biến này, tế bào neuron trưởng thành phát tín hiệu huỳnh quang EGFP màu xanh 293 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ Số * 2015 trường khơng có Doxycycline, q trình bị bất hoạt Bên cạnh đó, để phân biệt hai nhóm tế bào ghép vào vật chủ, sử dụng thêm Lenti virus vector có mang gen mã hóa mCherry (protein phát huỳnh quang màu đỏ) vào nhóm tế bào FoxG1-GOF Như vậy, tế bào neuron cấy ghép sống sót não vật chủ, nhóm phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh (EGFP) - nhóm chứng, nhóm tế bào vừa phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh vừa có tín hiệu huỳnh quang đỏ - nhóm FoxG1-GOF Hai nhóm tế bào gây nhiễm với phức hợp lenti virus hình 2, nhóm chứng gây nhiễm với lenti virus chứa gen PLAP (placenta alkaline phosphatase) - gen khơng có hiệu sinh học tế bào thần kinh Hình Các phức hợp lenti virus vector dùng để chuyển đoạn gen mong muốn vào tế bào đầu dòng thần kinh FoxG1-GOF nhóm tăng cường biểu FoxG1 Control nhóm chứng não chuột phân tích vào thời điểm 14 FoxG1 thúc đẩy biệt hóa tế bào đầu ngày sau cấy ghép dòng thần kinh thành neuron Sau biến nạp với nhóm Lenti virus vector, tế bào đầu dòng thần kinh tiếp tục nuối cấy mơi trường kích thích phân bào vòng ngày bổ sung Doxycyclin (nồng độ 2μg/l) nhằm kích hoạt gen FoxG1 Sau đó, tế bào đầu dòng thần kinh hai nhóm trộn lẫn theo tỉ lệ 1:1 tiêm vào thùy thái dương chuột sơ sinh CD1 Mô Chúng nhận thấy tế bào FoxG1-GOF (biểu đồng thời EGFP mCherry) biệt hóa thành neuron nhiều so với nhóm chứng (chỉ biểu EGFP) gấp 1,5 lần (p