Nội kiểm xét nghiệm là một điều kiện không thể thiếu trong việc đánh giá chất lượng xét nghiệm nói chung và chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng. Hiện tại vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV chưa có trên thị trường. Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA VẬT LIỆU NỘI KIỂM HIV TỰ PHA CHẾ TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH Mai Nguyệt Thu Huyền*, Đặng Thị Minh Hà* Nguyễn Thị Bích Vân*, Công Thị Mai Linh*, Nguyễn Công Thành*, Nguyễn Mạnh Hồng*, Khuất Thị Anh Đào*, Nguyễn Hữu Lân* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Nội kiểm xét nghiệm điều kiện thiếu việc đánh giá chất lượng xét nghiệm nói chung chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng Hiện vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV chưa có thị trường Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu tính ổn định vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế Phương pháp: Thu thập mẫu huyết HIV dương tính với sinh phẩm liên tiếp: Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2, SD Bioline 3.0 Trộn mẫu huyết lại với phân thành tube nhỏ, tube chứa 200 µl huyết lưu -20 độ C tháng Mẫu huyết tương âm tính lấy từ dây túi máu dùng truyền cho bệnh nhân Trộn mẫu huyết tương lại với sau chia thành tube nhỏ, tube chứa 200 µl huyết tương lưu 20 độ C tháng Kết quả: Từ 1/11/2017/đến 5/11/2018, có lơ huyết thanh/huyết tương dùng cho nội kiểm tự pha chế, gồm 51 mẫu huyết dương tính 51 mẫu huyết tương âm tính Tất mẫu có độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100% sinh phẩm Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2 SD Bioline 3.0 Theo dõi vòng tháng optical density (OD) chứng dương dao động từ 1,589-3,891 OD chứng âm 0,049-0,088 ( OD cut off: 0,196-0,229) Không có mẫu cho kết dương tính giả hay âm tính giả Kết luận: Chúng tơi pha chế thành công vật liệu nội kiểm HIV với độ nhạy độ đặc hiệu 100%, Vật liệu ổn định tháng âm 20oC rã đông lần Từ khóa: HIV, nội kiểm, optical density ABSTRACT EVALUATION OF THE STABILITY OF THE IN-HOUSE INTERNAL QUALITY CONTROL MATERIAL FOR HIV TESTING AT PHẠM NGỌC THẠCH HOSPITAL Mai Nguyet Thu Huyen, Dang Thi Minh Ha, Nguyen Thi Bich Van, Cong Thi Mai Linh, Nguyen Cong Thanh, Nguyen Manh Hoang, Khuat Thi Anh Dao, Nguyen Huu Lan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019: 253-258 Background: Internal control is an indispensable method in evaluating the quality of laboratory tests in general and of HIV-confirming tests in particular The internal quality material control kit for HIV test is not yet available in the market Objective: To evaluate the sensitivity, the specificity and the stability of the in-house internal quality material control kit for HIV test Method: HIV-positive serum samples confirmed by all three sequential confirming tests including Murex Ag/Ab HIV, Determine HIV ½ and SD Bioline 3.0 were collected They were well-mixed together *Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS.BS Mai Nguyệt Thu Huyền ĐT: 0902944701 Email: maihuyen1967@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 253 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 and divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20oC for months Negative plasma samples were collected from the strings of blood transfusion bags and then divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20°C for months Results: From November 1, 2017 to November 5, 2018, seven batches were made, including 51 HIVpositive serum samples and 51 HIV-negative plasma samples They all showed 100% sensitivity and 100% specificity for Murex Ag / Ab, Determine HIV1/2 and SD Bioline 3.0 tests Follow up within months, ODs of positive control samples range from 1,589-3,891 and ODs of negative control samples range from 0.049-0.088 (ODs cut off: 0.196-0.229) There are no samples that show false positive or false negative results Conclusion: We have successfully prepared the in-house internal quality material control for HIV test with 100% sensitivity and specificity, this material is still stable within months at -20oC and thawed once Keywords: HIV, Internal Control, optical density ĐẶT VẤN ĐỀ Để đạt mục tiêu kết thúc đại dịch AIDS vào năm 2030, phải đạt mục tiêu 9090-90 Đó là: 90% số người nhiễm HIV biết tình trạng nhiễm HIV mình; 90% số người chẩn đốn nhiễm HIV điều trị ARV liên tục; 90% số người điều trị ARV kiểm soát tải lượng vi-rút mức thấp ổn định, tức tải lượng vi-rút HIV mức thấp ngưỡng phát hiện(2) Để đạt đươc mục tiêu 90 đầu tiên, bên cạnh việc gia tăng mở rộng hệ thống mạng lưới xét nghiệm phát nhiễm HIV cộng đồng xét nghiệm chẩn đốn nhanh, mạng lưới phòng xét nghiệm khẳng định HIV tuyến huyện thực ba test nhanh phải phát triển Các phòng xét nghiệm thực xét nghiệm khẳng định HIV cần phải bảo đảm chất lượng xét nghiệm cách thực nội kiểm tham gia thực ngoại kiểm theo Quyết định 2429/QĐ-BYT y tế đánh giá chất lượng phòng xét nghiệm y học(3) Hiện tại, xét nghiệm ngoại kiểm viện Pasteur TP Hồ Chí Minh tổ chức thực tháng Tuy nhiên, xét nghiệm nôi kiểm HIV chưa thực kít nội kiểm HIV chưa có thị trường Do đó, để bảo đảm chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV theo Quyết định 2429/QĐ-BYT, tiến hành tự pha chế 254 kít nội kiểm gồm mẫu huyết dương tính mẫu huyết tương âm tính từ ngun liệu có Mục tiêu Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu tính ổn định vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Thực nghiệm y học Đối tượng Mẫu chứng dương: Gồm huyết bệnh nhân khẳng định dương tính với HIV test chẩn đoán HIV Bộ Y tế công nhận(4) Mẫu chứng âm: Huyết từ dây túi máu để truyền máu cho bệnh nhân(1) Phương pháp Quy trình pha chế huyết nội kiểm dương tính Thu thập mẫu huyết dương tính với HIV sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV1/2 (có OD >= trở lên), Determine HIV1/2 SD bioline 3.0 Sau lưu mẫu dương tính theo quy định, dùng pipette hút toàn huyết dương tính lại cho vào tube lớn 10ml đánh đấu "chứng dương " (ống A) Trộn tất mẫu dương ống A, sau hút 200 µl huyết ống A cho vào tube effpendorf Lưu tube -20°C tháng Ghi ngày pha chế Mỗi tuần lấy tube để làm nội kiểm Thời gian từ lúc thu thập Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 mẫu đến lúc trữ đông 24 Thu thập dây túi máu dùng truyền cho bệnh nhân ( túi máu dùng truyền cho bệnh nhân chắn xác định HIV,HbsAg, HCV âm tính) Dùng pipette hút tồn máu dây truyền máu cho vào tube effpendorf 2ml đánh dấu "chứng âm", quay ly tâm 3000 rpm/ phút để tách huyết tương Dùng pipette hút dung dịch (huyết tương) cho vào ống 10ml (ống B - "Chứng âm") Trộn huyết tương ống B hút 200 µl cho vào tube effpendorf Lưu tube -20°C tháng Ghi ngày pha chế Mỗi tuần lấy tube làm nội kiểm Thời gian từ lúc thu thập mẫu đến lúc trữ đông 24 Quy trình thực Chọn ngẫu nhiên mẫu HIV dương mẫu HIV âm lô pha chế Thực xét nghiệm với test HIV cho mẫu Lặp lại test lần cho mẫu ngày để đánh giá độ lặp lại Mỗi tuần, thử mẫu nội kiểm dương nội kiểm âm lô với ba sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV 1/2, Determine HIV1/2 SD Bioline 3.0 Ghi nhận kết âm tính/ dương tính theo hướng dẫn nhà sản xuất Mỗi tube sau rã đơng dùng lần Phân tích kết Dùng phần mềm Excel Để theo dõi độ ổn định vật liệu nôi kiểm tự pha chế, lượng huyết có hạn, nên chúng tơi pha chế lơ 5,6,7 lô 12 tube (từ mẫu 16-51) lưu âm 20 độ C sử dụng tháng để theo dõi tính biến thiên OD theo thời gian Tất kết OD chứng dương chứng âm nhập vào cột Excel riêng theo thứ tự thời gian lần thực Sau vẽ biểu đồ excel tính giá trị OD trung bình, OD max OD so sánh với Nghiên cứu Y học giá trị OD cut off max để xác định giá trị chẩn đoán Bảng 1: Độ nhạy độ đặc hiệu tính theo bảng 2x2 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Tổng cộng Sinh phẩm xét nghiệm Dương tính Âm tính A C B D A+B C+D Độ nhạy = A/(A+B)X 100% Độ đặc hiệu = D/(C+D)X 100% KẾT QUẢ Từ ngày 01/11/2017/đến ngày 05/11/2018, pha chế lô mẫu nội kiểm, gồm 51 mẫu huyết HIV dương tính 51 mẫu huyết tương HIV âm tính: Độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực Murex Ag/Ab HIV Bảng 2: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực Murex Ag/Ab HIV Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Tổng cộng Murex Ag/Ab HIV Dương tính Âm tính 51 0 51 51 51 Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100% OD trung bình: 0,063 (Hình 1) OD min=0,049 OD max= 0,088 Giá trị OD cut off: 0,196-0,229 OD trung bình= 3,1 (Hình 2) OD min=1,589 OD max= 3,891 Giá trị OD cut off: 0,196 – 0,229 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 255 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT TƯƠNG ÂM 0,1 0,09 0,08 0,07 OD 0,06 0,05 OD MẪU THỬ 0,04 0,03 0,02 0,01 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 SỐ LẦN NỘI KIỂM Theo dõi độ ổn định OD (lần 16-51) Hình 1: Biểu đồ biến thiên OD mẫu huyết tương HIV âm tính theo thời gian BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT THANH DƯƠNG 4,5 3,5 OD 2,5 OD MẪU THỬ 1,5 0,5 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 SỐ LẦN NỘI KIỂM Theo dõi độ ổn định OD (lần16-51) Hình 2: Biểu đồ biến thiên OD mẫu huyết HIV dương tính theo thời gian 256 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực Determine HIV1/2 Bảng 3: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực Determine HIV1/2 Determine HIV1/2 Dương tính Âm tính 51 0 51 51 51 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Tổng cộng Nghiên cứu Y học Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100% Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực SD Bioline 3.0 Bảng 4: Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ âm 20 độ C tháng, thực SD Bioline 3.0 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính Tổng cộng SD Bioline 3.0 Dương tính Âm tính 51 0 51 51 51 Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100% Độ lặp lại sinh phẩm MurexAg/Ab HIV lô pha chế Bảng 5: Độ lặp lại sinh phẩm MurexAg/Ab HIV lô pha chế Mẫu Dương Âm OD/CO Lần 14.441 0.242 OD/CO Lần 13.500 0.252 OD/CO Lần 14.029 0.252 BÀN LUẬN 51 mẫu huyết tương âm tính HIV từ túi máu 51 mẫu huyết HIV dương tính pha chế từ mẫu huyết HIV dương tính bệnh nhân lưu trữ -20 độ C thời gian tối đa tháng có kết độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100% sinh phẩm murex, Determine HIV1/2 SD bioline 3.0 Điều cho thấy huyết ổn định với nhiệt độ thời gian lưu trữ Cả sinh phẩm Murex, Determine HIV1/2 SD bioline 3.0 Bộ Y Tế công nhận khuyến cáo dùng xét nghiệm khẳng định HIV(4) Khoa xét nghiệm dùng sinh phẩm tham gia ngoại kiểm HIV từ 2007 nay; năm thực 02 đợt ngoại kiểm, tổng cộng 24 lần ngoại kiểm có kết đạt độ xác 100% Điều cho thấy việc sử dụng 03 sinh phẩm để pha chế vật liệu nội kiểm đáng tin cậy Đối với mẫu chứng âm, dùng máu có dây truyền máu túi máu để pha chế mẫu chứng âm Đây mẫu máu loại trừ nhiễm HIV công nghệ NAT (Nucleic Acid Testing) nên kết HIV âm tính mẫu đáng tin cậy(1) OD/CO Lần 14.354 0.237 OD/CO Lần 13.315 0.266 SD Mean CV% 0.5 0.01 13.92 0.27 3.6 4.0 Sinh phẩm Murex hoạt động theo kỹ thuật ELISA nên để đánh giá tính ổn định sản phẩm, dựa vào thay đổi OD Do lượng huyết thanh/huyết tương có hạn, chúng tơi pha chế lượng mẫu đủ dùng tháng đánh giá tính ổn định sản phẩm thời gian tháng, lưu trữ âm 20 độ C rã đông lần Đối với lô 5,6,7 (lưu trữ tháng) kết cho thấy giá trị OD mẫu ổn định lô (thời gian lưu trữ vòng tháng), OD có thay đổi tính đến thời hạn tháng kể từ ngày pha chế giá trị OD đạt yêu cầu chẩn đốn (Hình 1, 2) khơng có mẫu cho kết dương tính giả hay âm tính giả Việc tự pha chế mẫu nội kiểm mang lại nhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm việc bảo đảm chất lượng xét nghiệm mà kít nội kiểm chưa có thị trường Hơn nữa, quy trình pha chế mẫu nội kiểm từ mẫu huyết sẵn có dễ thực nhân rộng phòng xét nghiệm khẳng định HIV, giúp tiết kiệm chi phí hoạt động phòng xét nghiệm giảm giá thành test Tuy nhiên để vật liệu nội kiểm ổn định cần lưu ý chia thể tích huyết hay huyết tương đủ Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 257 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 cho lần sử dụng (tránh rã đông tái đông nhiếu lần) lưu trử âm 20 độ C đến thời gian tháng sử dụng tốt HIV vật liệu có sẳn với độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100%; ổn định tháng TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nghiên cứu hạn chế lượng mẫu ít, nên chúng tơi theo dõi vật liệu nội kiểm tự pha chế âm 20 độ C vòng tháng Hy vọng tương lai với số lượng mẫu thu thập nhiều theo dõi tính ổn định vật liệu nội kiểm nhiều nhiệt độ khác thời gian lâu Ngày nhận báo: 02/01/2019 KẾT LUẬN Ngày phản biện nhận xét báo: 25/01/2019 Lần pha chế thành công vật liệu nội kiểm xét nghiệm khẳng định Ngày báo đăng: 20/04/2019 258 Bộ Y tế (2013) Hướng dẫn hoạt động truyền máu Thông tư số 26/2013/TT-BYT Bộ Y tế (2016) Mục tiêu 90-90-90 phòng chống HIV-AIDS Bộ Y tế (2017) Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học Quyết định số 2429/QĐ-BYT Bộ Ytế (2018) Cung cấp danh mục sinh phẩm chẩn đốn HIV Cơng văn 117/AIDS-GSXN Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch ... nghiệm nôi kiểm HIV chưa thực kít nội kiểm HIV chưa có thị trường Do đó, để bảo đảm chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV theo Quyết định 2429/QĐ-BYT, tiến hành tự pha chế 254 kít nội kiểm gồm mẫu... giả Việc tự pha chế mẫu nội kiểm mang lại nhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm việc bảo đảm chất lượng xét nghiệm mà kít nội kiểm chưa có thị trường Hơn nữa, quy trình pha chế mẫu nội kiểm từ mẫu... bảo đảm chất lượng xét nghiệm cách thực nội kiểm tham gia thực ngoại kiểm theo Quyết định 2429/QĐ-BYT y tế đánh giá chất lượng phòng xét nghiệm y học(3) Hiện tại, xét nghiệm ngoại kiểm viện Pasteur