Nội kiểm xét nghiệm là một điều kiện không thể thiếu trong việc đánh giá chất lượng xét nghiệm nói chung và chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng. Hiện tại vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV chưa có trên thị trường. Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế.
Trang 1ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA VẬT LIỆU NỘI KIỂM HIV TỰ PHA CHẾ
TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH
Mai Nguyệt Thu Huyền * , Đặng Thị Minh Hà * Nguyễn Thị Bích Vân * , Công Thị Mai Linh * , Nguyễn Công Thành *, Nguyễn Mạnh Hoàng * , Khuất Thị Anh Đào * , Nguyễn Hữu Lân *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Nội kiểm xét nghiệm là một điều kiện không thể thiếu trong việc đánh giá chất lượng xét
nghiệm nói chung và chất lượng xét nghiệm khẳng định HIV nói riêng Hiện tại vật liệu nội kiểm sinh phẩm HIV chưa có trên thị trường
Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế
Phương pháp: Thu thập các mẫu huyết thanh HIV dương tính với cả 3 sinh phẩm liên tiếp: Murex Ag/Ab,
Determine HIV1/2, SD Bioline 3.0 Trộn đều các mẫu huyết thanh trên lại với nhau và phân ra thành các tube
nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết thanh và lưu ở -20 độ C trong 3 tháng
Mẫu huyết tương âm tính được lấy từ các dây của các túi máu dùng truyền cho bệnh nhân Trộn đều các mẫu huyết tương này lại với nhau sau đó chia ra thành các tube nhỏ, mỗi tube chứa 200 µl huyết tương và lưu
-20 độ C trong 3 tháng
Kết quả: Từ 1/11/2017/đến 5/11/2018, có 7 lô huyết thanh/huyết tương dùng cho nội kiểm tự pha chế, gồm
51 mẫu huyết thanh dương tính và 51 mẫu huyết tương âm tính Tất cả các mẫu này đều có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100% đối với các sinh phẩm Murex Ag/Ab, Determine HIV1/2 và SD Bioline 3.0 Theo dõi trong vòng 3 tháng các optical density (OD) của chứng dương dao động từ 1,589-3,891 và các OD của chứng âm 0,049-0,088 ( OD cut off: 0,196-0,229) Không có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả
Kết luận: Chúng tôi đã pha chế thành công vật liệu nội kiểm HIV với độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, Vật liệu
này vẫn ổn định trong 3 tháng ở âm 20 o C và rã đông một lần
Từ khóa: HIV, nội kiểm, optical density
ABSTRACT
EVALUATION OF THE STABILITY OF THE IN-HOUSE INTERNAL QUALITY CONTROL MATERIAL
FOR HIV TESTING AT PHẠM NGỌC THẠCH HOSPITAL
Mai Nguyet Thu Huyen, Dang Thi Minh Ha, Nguyen Thi Bich Van, Cong Thi Mai Linh, Nguyen Cong Thanh, Nguyen Manh Hoang, Khuat Thi Anh Dao, Nguyen Huu Lan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019:253-258
Background: Internal control is an indispensable method in evaluating the quality of laboratory tests in
general and of HIV-confirming tests in particular The internal quality material control kit for HIV test is not yet
available in the market
Objective: To evaluate the sensitivity, the specificity and the stability of the in-house internal quality
material control kit for HIV test
Method: HIV-positive serum samples confirmed by all three sequential confirming tests including
Murex Ag/Ab HIV, Determine HIV ½ and SD Bioline 3.0 were collected They were well-mixed together
*Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
Tác giả liên lạc: TS.BS Mai Nguyệt Thu Huyền ĐT: 0902944701 Email: maihuyen1967@yahoo.com
Trang 2and divided into 200 µl aliquots that were then frozen at -20 o C for 3 months Negative plasma samples were
collected from the strings of blood transfusion bags and then divided into 200 µl aliquots that were then
frozen at -20°C for 3 months
Results: From November 1, 2017 to November 5, 2018, seven batches were made, including 51 HIV-
positive serum samples and 51 HIV-negative plasma samples They all showed 100% sensitivity and 100% specificity for Murex Ag / Ab, Determine HIV1/2 and SD Bioline 3.0 tests Follow up within 3 months, ODs of positive control samples range from 1,589-3,891 and ODs of negative control samples range from 0.049-0.088 (ODs cut off: 0.196-0.229) There are no samples that show false positive or false negative results
Conclusion: We have successfully prepared the in-house internal quality material control for HIV test with
100% sensitivity and specificity, this material is still stable within 3 months at -20 o C and thawed once
Keywords: HIV, Internal Control, optical density
ĐẶT VẤN ĐỀ
Để đạt mục tiêu kết thúc đại dịch AIDS vào
năm 2030, chúng ta phải đạt được mục tiêu
90-90-90 Đó là:
90% số người nhiễm HIV được biết tình
trạng nhiễm HIV của mình; 90% số người chẩn
đoán nhiễm HIV được điều trị ARV liên tục;
và 90% số người được điều trị ARV kiểm soát
được tải lượng vi-rút ở mức thấp và ổn định,
tức là tải lượng vi-rút HIV ở mức thấp dưới
ngưỡng phát hiện(2)
Để đạt đươc mục tiêu 90 đầu tiên, bên cạnh
việc gia tăng mở rộng hệ thống mạng lưới xét
nghiệm phát hiện nhiễm HIV tại cộng đồng
bằng các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, mạng
lưới các phòng xét nghiệm khẳng định HIV tại
tuyến huyện thực hiện bằng ba test nhanh cũng
phải được phát triển
Các phòng xét nghiệm thực hiện xét nghiệm
khẳng định HIV cần phải bảo đảm chất lượng
xét nghiệm bằng cách thực hiện nội kiểm và
tham gia thực hiện ngoại kiểm theo Quyết định
2429/QĐ-BYT của bộ y tế về đánh giá chất lượng
phòng xét nghiệm y học(3)
Hiện tại, xét nghiệm ngoại kiểm được viện
Pasteur TP Hồ Chí Minh tổ chức thực hiện mỗi
6 tháng Tuy nhiên, xét nghiệm nôi kiểm HIV
bộ kít nội kiểm gồm các mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu huyết tương âm tính từ các nguyên liệu hiện có
Mục tiêu
Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu và tính ổn định của vật liệu nội kiểm HIV tự pha chế
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Thực nghiệm y học
Đối tượng
Mẫu chứng dương: Gồm huyết thanh của bệnh nhân đã được khẳng định dương tính với HIV bằng 3 test chẩn đoán HIV được Bộ Y tế công nhận(4)
Mẫu chứng âm: Huyết thanh từ các dây trong túi máu để truyền máu cho bệnh nhân(1)
Phương pháp
Quy trình pha chế huyết thanh nội kiểm dương tính
Thu thập các mẫu huyết thanh dương tính với HIV ở cả 3 sinh phẩm Murex Ag/Ab HIV1/2 (có OD >= 1 trở lên), Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0 Sau khi lưu các mẫu dương tính theo quy định, dùng pipette hút toàn bộ huyết thanh dương tính còn lại cho vào các tube lớn 10ml đã được đánh đấu "chứng dương " (ống A) Trộn đều tất cả các mẫu dương trong ống A, sau đó
Trang 3mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ
Thu thập các dây của các túi máu dùng
truyền cho bệnh nhân ( túi máu dùng truyền cho
bệnh nhân chắc chắn đã được xác định
HIV,HbsAg, và HCV âm tính) Dùng pipette hút
toàn bộ máu trong dây truyền máu cho vào các
tube effpendorf 2ml đã đánh dấu "chứng âm",
quay ly tâm 3000 rpm/ 5 phút để tách huyết
tương Dùng pipette hút dung dịch nổi (huyết
tương) cho vào ống 10ml (ống B - "Chứng âm")
Trộn đều huyết tương trong ống B và hút 200 µl
cho vào mỗi tube effpendorf Lưu các tube này ở
-20°C trong 3 tháng Ghi ngày pha chế Mỗi tuần
lấy một tube làm nội kiểm Thời gian từ lúc thu
thập mẫu đến lúc trữ đông là 24 giờ
Quy trình thực hiện
Chọn ngẫu nhiên một mẫu HIV dương và
một mẫu HIV âm trong cùng một lô pha chế
Thực hiện xét nghiệm với cả 3 test HIV cho mỗi
mẫu Lặp lại test 5 lần cho mỗi mẫu trong 5 ngày
để đánh giá độ lặp lại
Mỗi tuần, thử mẫu nội kiểm dương và nội
kiểm âm của mỗi lô với ba sinh phẩm Murex
Ag/Ab HIV 1/2, Determine HIV1/2 và SD Bioline
3.0 Ghi nhận kết quả âm tính/ dương tính theo
hướng dẫn của nhà sản xuất
Mỗi tube sau khi rã đông chỉ dùng 1 lần
Phân tích kết quả
Dùng phần mềm Excel
Để theo dõi độ ổn định của vật liệu nôi kiểm
tự pha chế, do lượng huyết thanh có hạn, nên
chúng tôi pha chế 3 lô 5,6,7 mỗi lô 12 tube (từ
mẫu 16-51) và lưu âm 20 độ C sử dụng trong 3
tháng để theo dõi tính biến thiên của OD theo
thời gian Tất cả các kết quả OD của chứng
dương và chứng âm được nhập vào 2 cột Excel
riêng theo thứ tự thời gian của các lần thực hiện
Sau đó vẽ biểu đồ bằng excel tính giá trị OD
trung bình, OD max và OD min và so sánh với
giá trị OD cut off max và min để xác định giá trị chẩn đoán
Bảng 1: Độ nhạy và độ đặc hiệu được tính theo bảng
2x2
Sinh phẩm xét nghiệm Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính
Độ nhạy = A/(A+B)X 100%
Độ đặc hiệu = D/(C+D)X 100%
KẾT QUẢ
Từ ngày 01/11/2017/đến ngày 05/11/2018, chúng tôi đã pha chế được 7 lô mẫu nội kiểm, gồm 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính và 51 mẫu huyết tương HIV âm tính:
Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định
Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20
độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex Ag/Ab HIV
Bảng 2: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm
20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Murex Ag/Ab HIV
Murex Ag/Ab HIV Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính
Độ nhạy: 100%
Độ đặc hiệu: 100%
OD trung bình: 0,063 (Hình 1)
OD min=0,049
OD max= 0,088
Giá trị OD cut off: 0,196-0,229
OD trung bình= 3,1 (Hình 2)
OD min=1,589
OD max= 3,891
Giá trị OD cut off: 0,196 – 0,229
Trang 4BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT TƯƠNG ÂM
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
SỐ LẦN NỘI KIỂM
Theo dõi độ ổn định OD (lần 16-51)
Hình 1: Biểu đồ biến thiên của OD mẫu huyết tương HIV âm tính theo thời gian
BIỂU ĐỒ MẪU HUYẾT THANH DƯƠNG
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
SỐ LẦN NỘI KIỂM
Trang 5Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm 20
độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine
HIV1/2
Bảng 3: Mẫu huyết thanh/ huyết tương lưu trữ ở âm
20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng Determine
HIV1/2
Determine HIV1/2
Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính
Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100%
Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm 20
độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0
Bảng 4: Mẫu huyết thanh/huyết tương lưu trữ ở âm
20 độ C trong 3 tháng, thực hiện bằng SD Bioline 3.0
SD Bioline 3.0 Mẫu huyết thanh/ huyết tương Dương tính Âm tính
Độ nhạy: 100% Độ đặc hiệu: 100%
Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế
Bảng 5: Độ lặp lại của sinh phẩm MurexAg/Ab HIV trong cùng một lô pha chế
Mẫu OD/CO
Lần 1
OD/CO Lần 2
OD/CO Lần 3
OD/CO Lần 4
OD/CO
Dương 14.441 13.500 14.029 14.354 13.315 0.5 13.92 3.6
BÀN LUẬN
51 mẫu huyết tương âm tính HIV từ túi máu
và 51 mẫu huyết thanh HIV dương tính được
pha chế từ các mẫu huyết thanh HIV dương tính
của bệnh nhân được lưu trữ ở -20 độ C trong
thời gian tối đa 3 tháng có kết quả độ nhạy và độ
đặc hiệu đạt 100% ở cả 3 sinh phẩm murex,
Determine HIV1/2 và SD bioline 3.0 Điều này
cho thấy bộ huyết thanh này rất ổn định với
nhiệt độ và thời gian lưu trữ
Cả 3 sinh phẩm Murex, Determine HIV1/2
và SD bioline 3.0 đều được Bộ Y Tế công nhận và
khuyến cáo dùng trong xét nghiệm khẳng định
HIV(4) Khoa xét nghiệm của chúng tôi đã dùng 3
sinh phẩm này tham gia ngoại kiểm HIV từ 2007
cho đến nay; mỗi năm thực hiện 02 đợt ngoại
kiểm, tổng cộng 24 lần ngoại kiểm đều có kết
quả đạt độ chính xác 100% Điều này cho thấy
việc sử dụng 03 sinh phẩm này để pha chế vật
liệu nội kiểm là rất đáng tin cậy
Đối với mẫu chứng âm, chúng tôi đã dùng
máu có trong dây truyền máu của túi máu để
pha chế mẫu chứng âm Đây là mẫu máu đã
được loại trừ nhiễm HIV bằng công nghệ NAT
(Nucleic Acid Testing) nên kết quả HIV âm tính
của mẫu là rất đáng tin cậy(1)
Sinh phẩm Murex hoạt động theo kỹ thuật ELISA nên để đánh giá tính ổn định của sản phẩm, chúng tôi dựa vào sự thay đổi của OD
Do lượng huyết thanh/huyết tương có hạn, chúng tôi chỉ pha chế lượng mẫu đủ dùng trong
3 tháng vì vậy chỉ đánh giá tính ổn định của sản phẩm trong thời gian 3 tháng, lưu trữ ở âm 20 độ
C và chỉ rã đông 1 lần
Đối với 3 lô 5,6,7 (lưu trữ 3 tháng) kết quả cho thấy giá trị OD của các mẫu khá ổn định như 4 lô đầu tiên (thời gian lưu trữ trong vòng 1 tháng), tuy OD có thay đổi nhưng tính đến thời hạn 3 tháng kể từ ngày pha chế các giá trị OD
vẫn đạt yêu cầu chẩn đoán (Hình 1, 2) và không
có mẫu nào cho kết quả dương tính giả hay âm tính giả
Việc tự pha chế bộ mẫu nội kiểm mang lại rất nhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm trong việc bảo đảm chất lượng xét nghiệm khi mà bộ kít nội kiểm chưa có trên thị trường Hơn nữa, quy trình pha chế bộ mẫu nội kiểm từ các mẫu huyết thanh sẵn có rất dễ thực hiện và có thể nhân rộng ở các phòng xét nghiệm khẳng định HIV, giúp tiết kiệm chi phí hoạt động của phòng xét nghiệm và giảm giá thành của test Tuy nhiên để vật liệu nội kiểm được ổn định cần lưu
ý chia thể tích huyết thanh hay huyết tương đủ
Trang 6cho một lần sử dụng (tránh rã đông và tái đông
nhiếu lần) và lưu trử âm 20 độ C đến thời gian 3
tháng vẫn còn sử dụng tốt
Trong nghiên cứu này còn hạn chế do lượng
mẫu ít, nên chúng tôi chỉ có thể theo dõi vật liệu
nội kiểm tự pha chế ở âm 20 độ C trong vòng 3
tháng Hy vọng trong tương lai với số lượng
mẫu thu thập nhiều hơn có thể theo dõi tính ổn
định của vật liệu nội kiểm ở nhiều nhiệt độ khác
nhau và thời gian lâu hơn
KẾT LUẬN
Lần đầu tiên chúng tôi đã pha chế thành
công vật liệu nội kiểm xét nghiệm khẳng định
HIV bằng các vật liệu có sẳn với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%; và vẫn ổn định trong 3 tháng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2013) Hướng dẫn hoạt động truyền máu Thông tư số
26/2013/TT-BYT
2 Bộ Y tế (2016) Mục tiêu 90-90-90 trong phòng chống HIV-AIDS
3 Bộ Y tế (2017) Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học Quyết định số 2429/QĐ-BYT
4 Bộ Ytế (2018) Cung cấp danh mục sinh phẩm chẩn đoán HIV Công
văn 117/AIDS-GSXN
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/01/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019