Khảo sát chỉ tiêu Arsen vô cơ, Coliform tổng số và Escherichia coli của các mẫu nước đóng chai trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh

Số lượng các hãng nước đóng chai trên thị trường gia tăng nhanh chóng, kéo theo đó là sự khó khăn trong việc kiểm soát về chất lượng của các cơ quan chức năng, gây hoang mang cho người tiêu dùng. Định lượng arsen vô cơ và đánh giá chỉ tiêu coliform tổng số, E. coli của một số mẫu nước đóng chai trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 KHẢO SÁT CHỈ TIÊU ARSEN VÔ CƠ, COLIFORM TỔNG SỐ VÀ ESCHERICHIA COLI CỦA CÁC MẪU NƯỚC ĐÓNG CHAI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Lê Thị Hà*, Ngơ Kiến Đức* TĨMTẮT Mở đầu: Số lượng hãng nước đóng chai thị trường gia tăng nhanh chóng, kéo theo khó khăn việc kiểm soát chất lượng quan chức năng, gây hoang mang cho người tiêu dùng Thực đề tài "Khảo sát tiêu Arsen vô cơ, coliform Escherichia coli (E coli) mẫu nước đóng chai địa bàn TP Hồ Chí Minh " giúp có nhìn sơ chất lượng nước đóng chai lưu hành thị trường TP Hồ Chí Minh Mục tiêu: Định lượng arsen vơ đánh giá tiêu coliform tổng số, E coli số mẫu nước đóng chai địa bàn TP Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu: Kết thử nghiệm chất lượng nước uống đóng chai đánh giá qua tiêu chuẩn quy định QCVN 06-1:2010/BYT Đánh giá cảm quan mẫu nước thông qua tiêu pH Định lượng arsen vô mẫu thử phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử kỹ thuật lò graphit (GFAAS), tiến hành qua hai bước: thẩm định quy trình định lượng, sau tiến hành xác định nồng độ arsen mẫu thử nghiệm Phát đếm vi khuẩn coliform E coli mẫu nước đóng chai phương pháp dùng màng lọc, phát vi khuẩn coliform thử nghiệm oxidase xác định vi khuẩn E coli phản ứng indol Kết quả: Về tiêu pH, có 43,3% mẫu có pH < 6,5 Về tiêu arsen vơ cơ, quy trình phân tích thẩm định đạt yêu cầu thu kết sau: khoảng áp dụng định lượng (đường chuẩn): 0,5 – 30,0 µg/l, giới hạn phát hiện: 0,0003 µg/l; giới hạn định lượng: 0,0009 µg/l; độ đúng: tỷ lệ % thu hồi nằm khoảng 85 – 115%, RSD% ≤ 10%; độ lặp lại: RSD% ≤ 10% Tất mẫu thử nghiệm có nồng độ arsen nằm giới hạn cho phép (≤ 10 µg/l) Phương pháp dùng màng lọc áp dụng đạt kết tốt với tỷ lệ thu hồi cao > 80% Về tiêu coliform, 23,33% mẫu không phát vi khuẩn, 26,66% mẫu phát vi khuẩn coliform, 50% mẫu nhiễm coliform 6,67% khơng đạt tiêu coliform tổng số Không phát E coli mẫu Kết luận: Tất mẫu đạt tiêu arsen vô E coli nước Trong 6,67% mẫu thử nghiệm khơng đạt tiêu coliform tổng số Từ khóa: arsen, coliform, E coli, GFAAS, nước uống đóng chai ABSTRACT EVALUATION OF INORGANIC ARSENIC, TOTAL COLIFORM BACTERIA AND THE PRESENCE OF ESCHERICHIA COLI IN BOTTLED WATER SAMPLES IN HO CHI MINH CITY AREA Le Thi Ha, Ngo Kien Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 116 – 124 Background - Objective: In the present, the amount of bottled drinking water brands consecutively increase Moreover, the quality control of the authorities for these products was still limited that makes the * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Ngô Kiến Đức ĐT: 0903055357 116 Email: ngokienduc@gmail.com Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học consumers confused Based on this situation, our study was performed to evaluate primarily the quality of bottled water samples in Ho Chi Minh city Method: They were evaluated quality index according QCVN 06-1:2010/BYT Their pH index were tested The concentration of inorganic arsenic was quantified by graphite furnace atomic absorption spectroscopy method, which had been validated before The detection and enumeration of total coliform and Escherichia coli (E coli) were conducted by membrane filtration method The presence of coliform and E coli were respectively tested using oxidase reagent and indol reagent Results: There were 13 bottled drinking water samples possessed pH < 6.5 The validation of the arsenic analysis process showed following these results: linearity ranged from 0.5 – 30.0 µg/l; limit of detection was 0.0003 µg/l; limit of quantification was 0.0009 µg/l; recovery was approximately 85 – 115%; the RSD% of repeatability was less than or equal 10% All of samples contained arsenic in permissible limit (≤ 10 µg/l) Membrane filtration method possessed a high recovery rate (> 80%) On the other hand, there were 23.33% samples without the presence of bacteria, 26.66% samples (with the presence of other bacteria and without coliform, 50% samples with the presence of coliform, therein 6.67% samples exceeded permissible limit of total coliform None of samples presented E coli Conclusion: All of bottled water samples possessed permissible limit of the amount of arsenic and E coli There were 6.67% samples exceeded limit of total coliform Key words: arsen, coliform, E coli, GFAAS, bottled water có tn thủ quy trình đảm bảo chất lượng MỞĐẦU hay bị thả nổi, ảnh hưởng đến sức khỏe người Trong năm trở lại đây, thị trường tiêu dùng nước uống đóng chai Việt Nam phát triển Đề tài thực với mong muốn với đa dạng sản phẩm Tuy nhiên kèm cung cấp thông tin sơ chất lượng số theo bùng nổ vấn đề chất mẫu nước đóng chai lưu hành địa lượng, vệ sinh khiến quan chức bàn thành phố Hồ Chí Minh, giúp cho người khó khăn kiểm sốt gây tiêu dùng nhận thức sản phẩm hoang mang cho người tiêu dùng nước uống sử dụng Hiện nay, thị trường tràn lan nhãn ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU hiệu nước uống đóng bình, đóng chai dán nhãn tinh khiết, nước suối thiên nhiên 30 mẫu nước đóng chai thu thập chủ Tuy nhiên, sở sản xuất yếu khu vực quanh bệnh viện bến xe có đầu tư nghiêm túc quy trình địa bàn TP Hồ Chí Minh sản xuất để đảm bảo chất lượng an toàn vệ Nguyên vật liệu sinh cho sản phẩm Đồng thời khó để kiểm Hóa chất sốt chất lượng quan quản lý nhà nước - Cồn 96o chưa đủ nhân lực điều kiện để giám sát - Nước muối sinh lý NaCl 0,9% theo dõi cách thường xuyên hiệu - Dung dịch acid nitric đậm đặc – Merck Mặc dù nhiều sở mang mẫu nước xét nghiệm đạt tiểu chuẩn An Toàn Vệ - Nước trao đổi ion (suất điện trở ≥16 MΩ.cm) Sinh Thực Phẩm tiêu lý hóa, - DD chuẩn: H3AsO4 HNO3 0,5 M vấn đề đặt liệu sau đăng ký nồng độ 1000 mg/l – Merck chất lượng vào hoạt động, việc sản xuất - DD cải biến nền: Palladium nitrat bảo quản sản phẩm nước đóng chai sau Pd(NO3)2 10 µg/ml Chuyên Đề Dược 117 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Dụng cụ - trang thiết bị Bảng1: Dụng cụ - trang thiết bị Dụng cụ Tủ Laminar Tủ LAMINAR Máy UV-VIS Nồi hấp Tủ ấm Máy lắc ủ nhiệt Máy đo pH Tủ sấy Tủ sấy Màng lọc Máy hút chân không Máy vortex Máy quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS) Lò graphit Bộ bơm mẫu tự động Bếp cách thủy Bình khí argon Cân phân tích Hãng ESCO ESCO GENEQUANT HIRAYAMA SHELLAB STUART CRISON PANASONIC MEMMERT SARTORIUS STEDIM VACUMBRAND STUART SHIMADZU SHIMADZU Shimadzu MEMMERT Số hiệu AHC – 4A1 Streamline - Class II Biological Safety Cabinet 1300 HV-110 USA RI28-2 S1500 SARTORIUS BP 221S (chính xác tới 0,1mg) Thiết bị khác Lấy mẫu để đo arsen vô - Máy lọc nước trao đổi ion - Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc có mỏ… Tất dụng cụ thủy tinh dùng phân tích arsen mẫu ngâm vào dung dịch acid nitric 10% 24 giờ, tráng lần nước trao đổi ion, sấy khô trước dùng Môi trường nuôi cấy vi sinh vật - Môi trường thạch đậu nành TSA -Môi trường lactose heptadecylsulfat – TM Media với natri - Môi trường tryptophan Thuốc thử - Thuốc thử Kovac’s - Giấy tẩm thuốc thử oxidase - Công ty Nam Khoa PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đánh giá pH Đo pH máy đo pH CRISON Lab Vi sinh công nghệ - Khoa Dược Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 118 MOV 212 Germany 100 lít UFB 500 Cellulose nitrat 11403 47 ACN MZ-2C-NT SA8 AA-6300 GFA-EX7i ASC-6000 WB29 Lấy mẫu vơ bình thủy tinh bosilicat rửa trước HNO3 10 % (v/v) tráng nước Thêm 20 ml HCl vô 1000 ml mẫu nước (Nếu pH mẫu lớn thêm HCl pH < 2) Định lượng arsen phương pháp GFAAS (tiến hành Trung tâm kiểm nghiệm thuốc – mỹ phẩm - thực phẩm TP Hồ Chí Minh) Mẫu thử Các mẫu thử (250 ml) cô đến cắn cốc có mỏ bếp cách thủy Thêm xác ml PdCl2 10 µg/ml ml HNO3 0,5% vào cốc đựng mẫu đến cắn Hòa tan cắn Mẫu trắng DD HNO3 0,5% pha từ dd HNO3 đậm đặc nước trao đổi ion Mẫu chuẩn DD arsen chuẩn (10 mg/l): hút xác ml dd arsen 1000 mg/l cho vào bình định mức 100 ml Pha loãng HNO3 0,5% đến vạch DD arsen chuẩn (100 µg/l): hút xác ml Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 dd chuẩn arsen cho vào bình định mức 100 ml Pha lỗng HNO3 0,5% đến vạch Các thơng số máy chương trình nhiệt độ tối ưu Bảng 2: Điều kiện đo arsen mẫu nước kỹ thuật GFAAS Điều kiện Cuvet graphit Loại đèn Cường độ đèn (mA) Bước sóng (nm) Độ rộng khe sáng (nm) Nồng độ acid nitric (%) Chất cải biến Thể tích mẫu (µl) Thể tích dd (µl) Thơng số Ống graphit phủ pyrolytic BGC-D2 12 193,7 0,7 0,5 Pd(NO3)2 10 µg/ml 10 Bảng 3: Chương trình nhiệt độ phân tích arsen Giai đoạn Sấy mẫu Tro hóa Ngun tử hóa Làm lò Nhiệt độ o ( C) 150 250 600 600 600 2200 2500 Thời gian Tốc độ dòng (giây) (l/phút) 20 0,10 10 0,10 10 1,00 10 1,00 0,00 0,00 1,00 Thẩm định quy trình định lượng arsen nước phương pháp GFAAS(3) Khảo sát tính tuyến tính Chuẩn bị dãy dd mẫu chuẩn với mức nồng độ Bảng Bảng 4: Pha dd chuẩn xây dựng đường tuyến tính DD arsen 100 µg/l (ml) PdCl2 10 mg/l (ml) HNO3 0,5% Nồng độ (µg/l) 0,5 20 0,5 5 10 20 20 20 20 20 vừa đủ 100 ml 10 20 30 20 30 Lập đường chuẩn có dạng: ŷ = a.x + b khảo sát mức độ tuyến tính nồng độ độ hấp thu arsen Yêu cầu: nồng độ arsen độ hấp thu tương quan tuyến tính r ≥ 0,995 Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy trắc nghiệm F kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy Chun Đề Dược Nghiên cứu Y học Khảo sát độ lặp lại Áp dụng quy trình định lượng với hai mẫu thử, mẫu thử chuẩn bị cốc dd đo Mỗi cốc tiến hành đo lần Yêu cầu : RSD ≤ 10% Khảo sát độ Tạo mẫu thử thêm chuẩn có mức nồng độ khác với nồng độ chất chuẩn thêm vào µg/l, 12 µg/l, 16 µg/l Mỗi mức nồng độ tiến hành với mẫu thử Mỗi mẫu thử tiến hành đo lần Yêu cầu : phương pháp chấp nhận đạt độ tỷ lệ thu hồi (%) nằm khoảng 85,0 - 115,0% (µg/l) RSD ≤ 10% Tỷ lệ thu hồi (%) = Giới hạn phát (LOD) SD: Độ lệch chuẩn đường hồi quy Giới hạn định lượng (LOQ) SD: Độ lệch chuẩn đường hồi quy Định lượng arsen mẫu khảo sát Mỗi mẫu tiến hành đo 02 lần Kết quả: nồng độ arsen tính theo cơng thức: C: nồng độ arsen mẫu đo tính theo đường chuẩn (µg/l) Phương pháp màng lọc đếm coliform tổng số phát E coli Môi trường (1) Môi trường lactose với heptadecylsulfat (2) Thạch Trypton đậu nành (TSA) (3) Môi trường chứa tryptophan Chuẩn bị mẫu(5) Đối với mẫu thể tích nhỏ (500 ml, 1500 ml): đựng chai thành phẩm Đối với mẫu thể tích lớn (5 lít, 7,5 lít, 19 lít): lấy 500ml mẫu từ chai thành phẩm vào bình chứa mẫu thủy tinh dung tích 119 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 500ml hấp tiệt trùng Tiến hành lọc sau lấy mẫu Bước Thử nghiệm áp dụng phương pháp màng lọc thông qua tỷ lệ thu hồi E coli màng lọc Đặt màng đĩa agar lactose ủ 37 C (21 ± 3) Môi trường nuôi cấy Lactose với Natri heptadecylsulfat Bước Thiết kế thí nghiệm Chuyển khóm E coli phân lập vào mơi trường NaCl 0,9% Pha lỗng mẫu NaCl 0,9% Chọn độ pha lỗng có lượng vi khuẩn khoảng 103 vi khuẩn/ml (phương pháp định lượng gián tiếp vi sinh vật phương pháp đo mật độ quang) tiến hành khảo sát - Mẫu 1: nước RO hấp vô trùng 121 °C 15 phút Lọc 250 ml mẫu phương pháp dùng màng lọc đường kính ɸ =47 mm, cỡ lỗ 0,45 µm (mẫu trắng) - Mẫu 2: cấy vào 02 đĩa petri đĩa 100 µl Dùng que trải trải vi khuẩn mặt thạch - Mẫu 3: hút 100 µl vào 250 ml mẫu trắng Lọc 250 ml mẫu lần phương pháp dùng màng lọc Tiến hành 02 lần - Mẫu 4: hút 100 µl vào 250 ml mẫu trắng Chia 250 ml mẫu thành hai phần dùng lọc 02 lần (mỗi lần khoảng 100-150 ml) 01 màng lọc phương pháp dùng màng lọc Tiến hành 02 lần Ủ đĩa petri (36 ± 2) °C 18-24 Tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc đĩa petri Ủ xác định Kiểm tra đếm tất khuẩn lạc dương tính với lactose, khơng quan tâm đến kích thước Bước Cấy tiếp tất khuẩn lạc đặc trưng (hoặc tối thiểu 10 khuẩn lạc) thu lên môi trường thạch TSA, ủ (36 ± 2) C 18-23 tiến hành thử oxidase: dùng que cấy gỗ cấy phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy lọc tẩm thuốc thử oxidase Màu xanh đậm xuất 10 giây phản ứng dương tính Bước Tiến hành tiếp với khóm cho thử nghiệm oxidase âm tính: cấy qua mơi trường chứa tryptophan ống nghiệm ủ 44 C 18-24 kiểm tra sinh indol cách thêm 0,2-0,3 ml thuốc thử Kovac’s Mẫu đỏ thẫm bề mặt môi trường xác định sinh indol Đọc kết Các khuẩn lạc có phản ứng oxidase âm tính vi khuẩn coliform Các khuẩn lạc có phản ứng oxidase âm tính phản ứng indol dương tính E coli Đánh giá tỷ lệ thu hồi vi khuẩn màng, tính tỷ lệ số khóm mọc màng so với số khóm vi khuẩn mọc đĩa petri Tiến hành thử nghiệm xác định mẫu khảo sát Lọc Dùng nước cất vô trùng thấm ướt giấy lọc Lọc áp suất giảm 250 ml mẫu qua màng lọc Hình 1: Thử nghiệm oxidase với lọc thủy tinh xốp 120 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Phân tích hồi quy t0 = 715598,0635 > t0,05 = 2,7764  Hệ số a có ý nghĩa thống kê |t0| = 6507,2034 > t0,05 = 2,7764  Hệ số b có ý nghĩa thống kê F = 5,1208 ×1011 > F0,05 =7,7086  Bác bỏ giả thuyết H0: Phương trình hồi quy có ý nghĩa Kết luận Vậy phương trình ŷ = 0,0032x - 0,0004 thích hợp Giới hạn phát (LOD) Hình 2: Thử nghiệm sinh indol Giới hạn định lượng (LOQ) KẾTQUẢ Chỉ tiêu pH: pH: Có 43,3% (n=13) mẫu nước có pH nằm ngồi khoảng 6,5-8,5 (theo TCVN 6096:2004(2) khuyến cáo WHO(6)) Định lượng arsen vô Kết thẩm định quy trình phân tích arsen phương pháp GFAAS Xây dựng đường chuẩn: Đường biểu diễn phụ thuộc độ hấp thu vào nồng độ arsen trình bày hình Khảo sát độ xác Tiến hành 02 mẫu thử M-1 S-6 Bảng 5: Kết khảo sát độ lặp lại Mẫu Độ hấp thu Nồng độ (µg/l) Kết thống kê M-1 0,0091 2,9908 = 3,2258 0,0105 3,4294 SD = 0,1887 RSD % = 5,85 0,0099 3,2415 0,0094 3,0848 0,0096 3,1475 0,0106 3,4607 S-6 0,0114 3,7113 = 3,8158 0,0114 3,7113 SD = 0,1004 RSD % = 2,63 0,0119 3,8680 0,0119 3,8680 0,0116 3,7740 0,0122 3,9619 Kết luận Kết bảng cho thấy phương pháp thử có độ lặp lại đạt u cầu quy trình phân tích (RSD (%) < 10%) Khảo sát độ Hình 3: Đồ thị biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ arsen Chuyên Đề Dược Tiến hành đánh giá độ phương pháp 02 mẫu M-1 S-6 121 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 6: Kết khảo sát độ Mẫu Nồng độ As mẫu (µg/l) Lượng As thêm vào (µg/l) 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,2258 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 3,8158 8,0000 8,0000 8,0000 12,0000 12,0000 12,0000 16,0000 16,0000 16,0000 8,0000 8,0000 8,0000 12,0000 12,0000 12,0000 16,0000 16,0000 16,0000 M-1 S-6 Tỷ lệ thu hồi (%) 105,1377 110,2277 103,5715 91,7585 92,8026 91,2360 93,2920 94,6626 97,2076 102,0694 108,7269 111,0756 90,2354 93,6296 92,3238 104,8759 102,1353 103,7016 RSD (%) 3,27 Kết đếm coliform tổng E coli - Tất mẫu khảo sát khơng có diện E coli 0,87 - Trong 30 mẫu khảo sát, có mẫu (23,33%) khơng mọc khóm vi khuẩn 2,09 - Trong 15 mẫu có coliform, có 13 mẫu đạt (< 250 CFU/250 ml) 02 mẫu không đạt tiêu (> 500 CFU/250 ml) coliform tổng số 1,86 BÀNLUẬN Chỉ tiêu pH 1,33 Kết bảng cho thấy phương pháp thử có đạt u cầu quy trình phân tích với: Tỷ lệ thu hồi khoảng 85,0-115,0%, RSD (%) < 10% Định lượng arsen vô mẫu thử Thử nghiệm tiến hành 30 mẫu thử Đo lặp lại 02 lần mẫu thử Tất mẫu thử có nồng độ arsen nằm giới hạn cho phép (