Haem đóng vai trò một thành phần cấu tạo của nhiều protein tham gia vào quá trình vận chuyển oxy, chuỗi hô hấp và chuyển hoá thuốc. Tuy vậy, quá trình dị hoá của haem ở tế bào động vật vẫn còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) và biliverdin, chất sau đó được chuyển hoá thành bilirubin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 SINH TỔNG HỢP MỚI (DE NOVO) LIÊN TỤC VÀ CHUYỂN HOÁ NHANH THÀNH BILIRUBIN CỦA HAEM LÀ CẦN THIẾT ĐỐI VỚI CƠ CHẾ BẢO VỆ TẾ BÀO Trần Tiến Tài* TĨM TẮT Mở đầu: Haem đóng vai trò thành phần cấu tạo nhiều protein tham gia vào trình vận chuyển oxy, chuỗi hơ hấp chuyển hố thuốc Tuy vậy, q trình dị hố haem tế bào động vật nhiều điều chưa sáng tỏ Haem giáng hoá thành sắt, carbon monoxit (CO) biliverdin, chất sau chuyển hố thành bilirubin Do việc định lượng bilirubin tương đối phức tạp, dù có quan trọng mặt lâm sàng lâm sàng,quá trình sản xuất vận chuyển sản phẩm nhiều điều chưa làm rõ Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu:Trong nghiên cứu này, sử dụng UnaG, loại protein huỳnh quang gắn bilirubin tìm thấy gần đây, vào việc khảo sát bilirubin nhiều dòng tế bào người Kết quả:Chúng tơi tìm thấy lượng bilirubin đáng kể tạo nhiều dòng tế bào huyết cầu Những kết thu cho thấy có tổng hợp haem mức sở chuyển hoá tiếp tục thành bilirubin Đáng ý, nhiều biến đổi quan trọng ghi nhận với bilirubin tế bào trạng thái tress Kết luận: Do tổn thương tế bào stress bị thúc đẩy phong toả chuyển hoá haem lại cải thiện việc bổ sung biliverdin bilirubin, có khả tổng hợp haem chuyển hoá thành bilirubin theo sau đóng vai trò khơng thể thiếu bảo vệ tế bào khỏi tổn thương Từ khoá: bilirubin, haem, bảo vệ tế bào ABSTRACT CONTINUOUS DE NOVO BIOSYNTHESIS OF HAEM AND ITS RAPID TURNOVER TO BILIRUBIN ARE NECESSARY FOR CYTOPROTECTION AGAINST CELL DAMAGE Tran Tien Tai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 42 - 51 Background: It is well known that haem serves as the prosthetic group of various haemoproteins that function in oxygen transport, respiratory chain, and drug metabolism However, much less is known about the functions of the catabolites of haem in mammalian cells Haem is enzymatically degraded to iron, carbon monoxide (CO), and biliverdin, which is then converted to bilirubin Owing to difficulties in measuring bilirubin, however, the generation and transport of this product remain unclear despite its clinical importance Objectives-Method: We used UnaG, the recently identified bilirubin-binding fluorescent protein, to analyses bilirubin production in a variety of human cell lines Results:We detected a significant amount of bilirubin with many non-blood cell types, which was sensitive to inhibitors of haem metabolism These results suggest that there is a basal level of haem synthesis and its conversion into bilirubin Remarkably, substantial changes were observed in the bilirubin generation when cells were exposed to stress insults Conclusion: Since the stress-induced cell damage was exacerbated by the pharmacological blockade of haem metabolism but was ameliorated by the addition of biliverdin and bilirubin, it is likely that the de novo synthesis of haem and subsequent conversion to bilirubin play indispensable cytoprotective roles against cell damage * Bộ môn Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch học, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: TS.BS Trần Tiến Tài ĐT: 0908610974 Email: trantientai@pnt.edu.vn 42 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Key worlds: bilirubin, haem, against cell damage MỞ ĐẦU Haem cần men trình sinh tổng hợp men cho giáng hoá Ba bước khởi đầu kết thúc tổng hợp hợp haem diễn ty thể Trongphản ứng đầu tiên, 5aminolevulenic acid (ALA) synthase xúc tác ngưng kết glycine succinyl-CoA tạo thành ALA(36,30) Ferrochelatase men tổng hợp cuối cùng, xúc tác cho việc gắn sắt vào protoporphyrin IX (PPIX) để tạo thành haem(29,5) Haem tạo thành vận chuyển khỏi ty thể sử dụng để tạo nên protein hoàn chỉnh Chuỗi chuyển hố haem điều hồ vài bước chịu điều khiển nhịp sinh học, hormones stress oxi hoá(8,15,14) Tuy vậy, liên kết haem đường chuyển hoá khác biết đến Bilirubin sản phẩm cuối giáng hố haem Nó tạo từ phản ứng với haem oxygenase (HO), có tác dụng giáng hoá haem thành biliverdin, sắt carbon monoxide (CO)(3,1) Cuối cùng, biliverdin reductase tế bào chất tạo bilirubin, chất đào thải sau liên hợp với glucoronate gan HO (gồm HO-1 HO-1) đóng vai trò chất điều hồ có tác dụng trì nồng độ haem nội bào Sắt tạo HO tái sử dụng vào protein có chứa sắt(26,10,25) Bilirubin có đặc tính chống oxy hố(24,35) Dạng liên hợp khơng tan nước, gắn vào albumin chuyển vào tế bào gan thông qua nhiều hệ thống vận chuyển(24,35) Sau glucuronin hoá men gan, bilirubin liên hợp tiết vào mật Sự gián đoạn vận chuyển gan mật dẫn đến triệu chứng vàng da nhiều bệnh lý gan(35,7) Mặc dù bilirubin mật bắt nguồn chủ yếu từ hemoglobin tế bào hồng cầu lão hoá qua đường chuyển hoá gan(7), sản xuất vận chuyển bilirubin mơ ngoại vi chưa nhắc đến.Bên cạnh đó, CO liên quan đến bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hố thơng qua chất cảm ứng với stress HO-1(34,13) Vì vậy, cảm ứng HO-1 sinh lý có khả năngbảo tồn mơ trước stress oxy hố, góp phần vào điều hồ đáp ứng viêm in vivo, hoạt động chế tự vệ mô(34,13,19) Tuy nhiên, chế xác phản ứng HO-1 chức bảo vệ chưa rõ Gần đây,protein huỳnh quang tìm thấy lươn UnaG phát gắn với bilirubin tự với lực cao(18) Việc định lượng bilirubin mô huyết trở thành ứng dụng hữu ích UnaG Chúng tơi khảo sát tạo thành bilirubin tế bào người UnaG tìm thấy tất dòng tế bào khảo sát liên tục sản xuất phóng thích bilirubin, thơng qua sinh tổng hợp haem Thêm vào đó, tế bào trì dòng chuyển hố haem, sản xuất phóng thích sản phẩm đầu cuối bilirubin Hoạt động trao đổi chất liên tục haem cần thiết cho bảo vệ tế bào khỏi tress trì cân nội môi chúng PHƯƠNG PHÁP Xây dựng plasmid biểu UnaG Để xây dựng vector vi khuẩn biểu mang UnaG, pcDNA3-flag-UnaG(18) cắt với men BamHI EcoRI, đoạn chèn phân lập gắn vào điểm BamHI EcoRI pET32a(+) Tiếp theo, pET-UnaG chuyển vào BL21 UnaG cảm ứng với 0.3mM isopropyl thiogalactopyranoside (IPTG) tinh hạt ion nickel Nuôi cấy tế bào Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa, ung thư gan HepG2, ung thư biểu mô da A431, ung thư vú MCF7, ung thư gan Alexander (PLC/PRF/5) phôi thận HEK293T nuôi môi trường Eagle’s điều chỉnh theo Dulbecco (DMEM) bổ sung 7% FCS, penicillin (100 đơn vị/ml) streptomycin (100 ug/ml) Tế bào ung thư ruột DLD-1 ung thư máu K562 nuôi RPMI1640 chứa 7% FCS kháng sinh HEK293T chuyển pcDNA3- Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện An Bình năm 2016 43 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 flag UnaG Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ủ 16 Để tạo tế bào chuyển gen ổn định HepG2 HeLa, pcDNA3-flag UnaG(18) (10ug) chuyển với calcium phosphate(31) G148 nồng độ đích 300 ug/ml cho vào mơi trường ni để chọn lọc Sau ngày, dòng tế bào kháng G418 chuyển nuôi vào đĩa 24 giếng với mơi trường chứa G418 300 ug/ml Từng dòng phân lập đánh giá biểu UnaG kính hiển vi huỳnh quang dòng biểu UnaG thu nhận, trộn lẫn để tránh biến thể dòng trì với DMEM chứa 7% FCS kháng sinh Với tế bào chứng, HepG2 chuyển vector pcDNA3.1 phân lập tế bào kháng G418 Haem tế bào đánh giá thị màu sử dụng khảo sát haem Khảo sát huỳnh quang bilirubin Tế bào nuôi với môi trường tổng hợp không bilirubin VP-SFM chứa BSA mg/ml Biểu UnaG tế bào sống quan sát kính hiển vi huỳnh quang Tiếp theo tế bào bị phá màng siêu âm, lượng bilirubin gắn vào UnaG đánh giá huỳnh quang đo với quang phổ kế, sử dụng bước sóng kích thích 480 nm bước sóng phát xạ dò khoảng 500 đến 550 nm(18) Để đo lượng bilirubin môi trường, môi trường ủ với UnaG tái tổ hợp mang his-tag (2ug) 25oC Sau UnaG bị bắt giữ hạt Ni2+ Sau rửa với TBS, UnaG hoà với TBS chứa 300 uM imidazole đo huỳnh quang Vết miễn dịch Dịch tế bào HEK293T làm mẫu chạy SDS-PAGE điện di màng poly(vinylidene difluoride) (PVDF)(25,31) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay Tế bào xử lý với chất tác động 24h trộn với MTT (500 ug/ml) MTT formazan tạo thành hoà với isopropanol Đo hấp thu bước sóng 590 nm đo với 44 máy đọc quang 96 giếng Thí nghiệm tiến hành với 4-6 lần lặp Thống kê Các kết thể dạng trung bình±SD phân tích Student’s t-test khơng ghép cặp Các phân tích thống kê ghi nhận khác biệt mức p