Tối ưu hoá phương pháp Tetra-ARMS (tetra primer amplification refractory mutation) nhằm phát hiện đột biến Canton trong các trẻ sơ sinh mắc bệnh thiếu men G6PD tại thành phố Hồ Chí Minh

Thiếu men G6PD là bệnh lý khiếm khuyết enzyme ở tế bào hồng cầu hay gặp nhất ở người với nhiều biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Mục tiêu của đề tài này là tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR trong việc phát hiện đột biến Canton gây bệnh thiếu men G6PD.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học TỐI ƯU HOÁ PHƯƠNG PHÁP TETRA-ARMS (TETRA PRIMER AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION) NHẰM PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN CANTON TRONG CÁC TRẺ SƠ SINH MẮC BỆNH THIẾU MEN G6PD TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Nguyễn Vũ Hoàng Uyên*, Nguyễn Thị Huệ**, Đặng Thị Lan Anh* TÓM TẮT Bối cảnh: Thiếu men G6PD bệnh lý khiếm khuyết enzyme tế bào hồng cầu hay gặp người với nhiều biến chứng nghiêm trọng, đặc biệt trẻ sơ sinh Vì bệnh di truyền, nên việc phát sớm đột biến gây bệnh có ý nghĩa cơng tác phòng ngừa điều trị biến chứng Chính vậy, mục tiêu đề tài tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR việc phát đột biến Canton gây bệnh thiếu men G6PD Phương pháp: Trước tiên thành phần phản ứng Tetra-ARMS PCR tối ưu hóa Sau đó, quy trình Tetra-ARMS chuẩn áp dụng để phân tích kiểu gene đột biến Canton ba mươi mẫu bệnh bao gồm kiểu đồng hợp dị hợp tử (kiểu gene xác định trước xét nghiệm ARMS PCR thông thường) Những mẫu cho kết không trùng kiểu gene hai phương pháp kiểm tra lại kỹ thuật giải trình tự gene Kết quả: Trong số 13,33% mẫu bất đồng kiểu gene hai phương pháp Tetra-ARMS PCR ARMS PCR thông thường, Tetra-ARMS cho thấy xác 100% so với kết giải trình tự, phân tích ARMS lại khơng trùng hợp Kết luận: Phương pháp Tetra-ARMS kỹ thuật đáng tin cậy, xác sử dụng phương pháp phân tử bổ sung bên cạnh phương pháp sinh hoá việc chẩn đoán bệnh thay dùng phương pháp ARMS thơng thường Từ khóa: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, đột biến Canton, so sánh, độ đặc hiệu,độ xác ABSTRACT OPTIMIZING TETRA- ARMS PCR FOR THE DETECTION OF CANTON MUTATION IN GLUCOSE-6PHOSPHATE DEHYDROGENASE DEFICIENCY (G6PD DEFICIENCY) Nguyen Vu Hoang Uyen*, Nguyen Thi Hue, Dang Thi Lan Anh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No - 2015: 297 - 305 Background: Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency is the most common enzyme defect in human erythrocytes with a lot of serious manifestations, especially in newborns Since this is a genetic disease, so early detection of causative mutations is significant for the prevention and treatment of severe symptoms Therefore, the objective of this project is to optimize the Tetra-ARMS PCR method for detecting Canton mutation – one of the point mutations causing G6PD deficiency Methods: The main and primary task of this study is optimizing the key components of Tetra-ARMS PCR The size for genotyping of Canton mutation in G6PD deficiency is thirty samples including homozygote and heterozygote which were genotyped by ARMS PCR assay After all the essential work done, results analysis and * Trường ĐH Quốc Tế, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh ** Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Đặng Thị Lan Anh ĐT: 0932.040.074 Email: dtlananh88@gmail.com 297 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 final DNA sequencing outcomes are two evidences to prove that Tetra-ARMS PCR is surpassing than conventional ARMS PCR It means that both specificity and accuracy of Tetra primer ARMS PCR are higher than ARMS-PCR Results: In 13.33% disagreement of genotype between the two methods, Tetra primer ARMS PCR represented 100% agreement with ADN sequencing results, while conventional ARMS PCR technique contradicted all four discordant samples Conclusion: Tetra primer ARMS PCR method is a reliable and accurate technique and it is suggested that it can be used as a complementary method beside biochemical tests for diagnostic cases instead of conventional ARMS PCR method This suggestion originated with perfect rate of agreement between Tetra-ARMS outcomes with the ones For future research, this study will be useful for later accuracy improvement, sensitivity test and enhancement of Tetra-ARMS PCR Key words: G6PD, Tetra-ARMS, ARMS, Canton mutation, validating, specificity, accuracy cầu, điều kiện bên ngồi dẫn đến kết GIỚI THIỆU dương tính giả âm tính giả(11,15) Hơn Thiếu men G6PD xem nữa, xét nghiệm khó để phát bệnh lý khiếm khuyết enzyme hồng người mang gen bệnh (người nữ dị hợp cầu hay gặp với 500 triệu người mắc bệnh tử) người mà bị ảnh hưởng toàn giới, chiếm khoảng 7,5% dân số tượng bất hoạt nhiễm sắc thể giới tính X Vì giới(9) Bệnh thiếu men G6PD có biểu vậy, để ngăn ngừa biến chứng nặng (suy nặng nề trẻ sơ sinh, chủ yếu gây thận, bại não, chậm phát triển tâm thần, vàng da sơ sinh thiếu máu tan máu cấp, chí tử vong) từ bệnh phát tán mạn tính, chậm phát triển tâm thần vận động bệnh quần thể, phương pháp chẩn tử vong đốn phân tử đơn giản tốn với độ Thơng thường, bệnh thiếu men G6PD xác cao để phát thiếu men G6PD phát nhiều vùng dịch tễ không ngừng phát triển Theo sốt rét Việt Nam nước có tỉ lệ bệnh sốt nghiên cứu trước đây, bệnh thiếu men G6PD rét cao, nên bệnh thiếu men G6PD tương đối xảy đột biến gen G6PD làm phổ biến đất nước ta với tỉ lệ bệnh từ 0,5 thay đổi cấu trúc enzyme G6PD Cho tới nay, 31%(13) cho nhóm dân tộc phía Bắc 1,9 có 184 đột biến gene phát hiện(4) 4,4%(3) nhóm dân tộc phía Nam Chính đa phần đột biến điểm nằm lí mà việc sàng lọc sơ sinh cho bệnh lý vùng mã hóa gene G6PD, dẫn đến làm vô thiết yếu nhằm ngăn chặn thay đổi amino acid protein(2,10) Vì biểu bệnh nguy hiểm xảy trẻ vậy, thông qua việc phát đột biến sơ sinh Từ năm 2002, phủ Việt Nam này, nhà khoa học sàng lọc thực "Chương trình sàng lọc sơ sinh" thiếu men G6PD với độ xác cao Tại số bệnh viện sản khoa lớn, hầu hết Việt Nam, theo kết từ nghiên cứu phương pháp sinh hoá Nhưng năm 2007 cho thấy đột biến nghĩa thuộc phương pháp nhanh, dễ phân lớp II-Canton xảy với tần suất cao ứng dụng khơng đòi hỏi trang thiết bị đắt bệnh nhân thiếu G6PD: 26,3%(3) tiền, độ xác chúng lại khơng cao, thành phố Lâm Đồng 26,67% thành phố bị ảnh hưởng từ nhiều yếu tố hồng Hồ Chí Minh(6) cầu lưới, tế bào bạch cầu, tuổi hồng 298 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Hình 1: Để tăng cường độ đặc hiệu cho mồi, nucleotid khơng liên kết vị trí số từ đầu 3’ tích hợp hai mồi bên Sự có mặt đột biến thể sản phẩm DNA khuếch đại với kích thước khác biết trước(5) sàng lọc 300 bệnh nhân(7) phương Chính vậy, Canton trở thành đối tượng pháp ARMS PCR thông thường Đây nghiên cứu Đột biến Canton nằm phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện exon 12 gen G6PD dạng đột biến nghiên cứu nước phát triển; điểm thay nucleotid G vị trí 1376 thành T nhiên, tính chuyên biệt chưa cao hai cDNA, làm cho acid amin Arginin vị trí mồi chuyên biệt cho hai alen cần xác định 459 phân tử protein bị biến đổi thành (12) khác nucleotide đầu 3’, Leucin Đột biến chứng xác suất mồi bắt cặp sai nucleotide minh đột biến gây bệnh cao(1) Một nhược điểm khác phương quần thể người Kinh- Việt Nam qua 299 Nghiên cứu Y học pháp để phát mẫu cần phải thực hai phản ứng PCR hai eppendorf riêng biệt: để phát alen bệnh để phát alen lành; điều làm tăng chi phí, thời gian thực hiện, tăng nguy sai sót phương pháp Ngược lại, phương pháp giải trình tự DNA coi phương pháp đáng tin cậy xác để phát đột biến, phương pháp tốn đòi hỏi nhiều trình tự điện di, với nhiều thiết bị phức tạp Do đó, kỹ thuật khơng thể áp dụng rộng rãi số lượng lớn cá thể Ngồi ra, có số kỹ thuật khác phát triển phân tích dựa enzyme cắt giới hạn (RFLP) hay phân tích đường cong nóng chảy (HRM) lại yêu cầu nhiều thời gian để tối ưu hóa, đòi hỏi thiết bị hóa chất đắt tiền, không phù hợp với nước phát triển(1,14) Tetra-primer amplification refractory mutation system (Tetra-ARMS T-ARMS) kết hợp Tetra-ARMS kỹ thuật ARMS thông thường(5,16) Đây phương pháp đáp ứng tiêu chí đặt (giá thành thấp, khơng phức tạp, khơng đòi hỏi thiết bị đắt tiền đảm bảo độ xác cao) Kỹ thuật bao gồm phản ứng PCR theo sau phân tích điện di Phản ứng PCR vận hành eppendorf nhỏ sử dụng đồng thời cặp mồi đặc hiệu: mồi (mồi bên trong) thiết kế đặc hiệu cho khu vực đa hình, lại (mồi bên ngồi) để làm tham chiếu chuẩn phản ứng PCR T-ARMS PCR có cải tiến với hai mồi bên thêm nucleotide không liên kết đặt nucleotide số đầu 3’ (Hình 1) Trong năm gần đây, phương pháp sử dụng nhà khoa học giới vào việc xác định đột biến điểm cách sử dụng phản ứng PCR để phát hai alen, mà không cần dùng enzyme hạn chế Đặc biệt hơn, phương pháp 300 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 phân biệt xác kiểu gene đồng hợp hay dị hợp tử Tetra-ARMS PCR giúp giảm số lượng phản ứng chi phí có phản ứng PCR thực cho mẫu Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp Tetra-ARMS PCR để phát đột biến Canton, sau so sánh độ đặc hiệu độ nhạy phương pháp với ARMS truyền thống Kết phương pháp điều kiện tiên để phát triển xét nghiệm phân tử với độ đặc hiệu cao chi phí hiệu cho việc xác định kiểu gene gây bệnh đột biến bệnh thiếu men G6PD quy mô lớn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng phương pháp thu thập mẫu Đối tượng nghiên cứu quần thể người Kinh bị thiếu men G6PD Mẫu máu khô từ em bé sơ sinh bệnh viện Phụ Sản Từ Dũthành phố Hồ Chí Minh thu thập kiểm tra mức độ hoạt động enzyme biểu lâm sàng đặc trưng tuyển chọn bác sĩ bệnh viện Tất mẫu thu thập có phiếu đồng thuận từ bố mẹ em tham gia lưu trữ lại tất thông tin liệu lâm sàng Tách chiết DNA gene DNA gen tách kit QIAamp DNA Mini Kit hãng Qiagene với số chỗ điều chỉnh để lượng DNA tách chiết từ máu khô cao Tối ưu hóa thành phần quy trình nhiệt cho Tetra-ARMS PCR Để tầm soát đột biến Canton, bốn mồi đặc biệt thiết kế phần mềm Primer1(16) để khuếch đại phân đoạn gen G6PD có kích thước từ 200-800bp Mồi xi mồi ngược bên dùng để phát alen đột biến, mồi xi mồi ngược bên ngồi dùng cho alen không bệnh, đồng thời làm khuôn cho hai mồi bên sản xuất sản phẩm PCR có chứa đột biến (Hình 2) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Hình 2: Vị trí bốn mồi gen G6PD Trong trình nghiên cứu, điều kiện: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ DNA điều chỉnh nhằm tối ưu hoá phản ứng để đảm bảo chất lượng sản phẩm cho bước chạy PCR 30 mẫu Phản ứng PCR thực hệ thống máy Eppendorf® PCR (6325ZH804133) Thành phần cho phản ứng PCR bao gồm: 2,5ul mồi xi ngược bên ngồi 10uM – 0,5ul mồi xuôi bên 10uM - 1ul mồi ngược bên 10uM - 12,5ul TopTaq Master Mix 2x (của hãng Thermo Scientific) - khoảng 150ng DNA thêm nước cho đủ 25ul Chu trình nhiệt phản ứng PCR sau: bước biến tính 95oC cho phút; theo sau 40 chu kỳ gồm bước: 95oC 30 giây, nhiệt độ bắt cặp (Ta) 30 giây, 72oC phút; bước kéo dài cuối 72oC 10 phút Bảng thể nhiệt độ bắt cặp (Ta) phản ứng khuếch đại Bảng Trình tự cặp mồi nhiệt độ bắt cặp (Ta) dùng để khuếch đại phân đoạn gen G6PD đồng thời để phục vụ cho việc giải trình tự Tên Primer Outer Forward Outer Reverse Inner Forward Inner Reverse Trình tự primers (5’-3’) 5’- ATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC-3’ 5’- GTAGGTGCCCTCATACTGGAAC-3’ 5’- GTCCCCTCAGCGACGAGCTTCT-3’ 5’- GGTGAAAATACGCCAGGCCTTAC-3’ Chiều dài sản phẩm PCR Chứng nội: 750 bp Alen G: 530 bp Alen T: 265 bp Tm o 69,7 C o 70,0 C o 72,0 C o 68,1 C Ta o 64 C Hình 3: Sản phẩm PCR phân tích gel vạch biểu thị cho kiểu gen dị hợp tử (GT), vạch cho kiểu gen đồng hợp tử (GG TT) 301 Nghiên cứu Y học Sau đó, sản phẩm PCR kiểm tra điện di 1,5% agarose gel có chứa Ethidium Bromide kích thước sản phẩm PCR mong muốn 750bp cho đoạn tham chiếu chuẩn, 530bp cho đoạn khuếch đại có alen G 265bp cho đoạn khuếch đại có alen T đọc tia tử ngoại Kết đọc có băng chứng nội hiển thị Sự diện vạch gel cho thấy kiểu gen dị hợp tử (GT) vạch cho thấy kiểu gen đồng hợp tử (GG TT) (Hình 3) Đánh giá hiệu hai phương pháp Để so sánh độ đặc hiệu độ xác ARMS thơng thường Tetra-ARMS, quy trình PCR tối ưu hố áp dụng cho TetraARMS 30 mẫu G6PD bệnh, sau kết kiểu gen mẫu Tetra-ARMS đem so sánh với mẫu thực phương pháp ARMS(8) Những mẫu không trùng khớp kiểu gen đem giải trình tự DNA để kết luận độ xác hai phương pháp Dùng hai mồi ngồi xi ngược bốn mồi Tetra-ARMS để phục vụ cho việc giải trình tự gen (Outer forward outer reverse, với kích thước sản phẩm 750bp) Phản ứng giải trình tự sử dụng Kit “ABI prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction” tiến hành hệ thống 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, France) Kết trình giải trình tự phân tích phần mềm SeqScape v2.5 Trình tự ba phân đoạn gen so sánh với trình tự gen G6PD Ensemble (số Accession No.ENSG00000160211) để xác định đột biến Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Hình 4: Kết xác định kiểu gen số mẫu phương pháp Tetra-ARMS Vạch vạch chứng nội 750bp Vạch giữa(530bp) vạch (265bp) hai vạch biểu thị cho alen G alen T đột biến Canton Hình cho thấy kết xác định kiểu gen số mẫu tiêu biểu hai phương pháp Các vạch điện di rõ nét, kích thước, khơng có sản phẩm phụ khơng đặc hiệu Điều chứng tỏ cặp mồi sử dụng đặc hiệu điều kiện phản ứng PCR tối ưu hóa Bảng 2: Bảng thống kê số mẫu giống/khác tần số mẫu không khớp tổng số ARMS PCR Tetra-ARMS PCR Kết trùng khớp Kết không trùng khớp YG GG 14 14 26/30 4/30 YT 11 11 TT GT 86,67% 13,33% Sau phân tích có mẫu khác 26 mẫu giống kiểu gen hai phương pháp Như 13,33% mẫu khác kiểu gen tổng số 30 mẫu bệnh (Bảng 2) Đánh giá hiệu Tetra-ARMS PCR Xác định kiểu gen Bốn mẫu Tetra-ARMS cho thấy kết khác với ARMS giải trình tự để kiểm tra kiểu gen xác rút kết luận cuối ARMS PCR hiển thị bốn mẫu có kiểu gen dị hợp tử (GT), đó, kết T-ARMS PCR đọc gel đồng hợp tử (GG) cho bốn mẫu Quy trình Tetra-ARMS PCR tối ưu hoá áp dụng 30 mẫu bệnh G6PD, dùng mẫu biết kiểu gen YG, YT GT làm đối chứng dương để xác định alen đột biến Canton Hình sắc ký trình tự DNA rõ ràng, khơng bị nhiễu khẳng định kết hoàn toàn phù hợp với kết Tetra-ARMS Chỉ có đỉnh màu đen đại diện cho nucleotide G xuất vị trí điểm đột biến hiển thị KẾT QUẢ 302 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 hình Điều có nghĩa có nucleotide G có mặt vị trí đó, có kiểu gen GG Do đó, kết T-ARMS PCR xác 100% với kết giải trình tự DNA (hình 4) Hình 4: Kết giải trình tự Ngồi ra, độ nhạy độ đặc hiệu hai phương pháp tính tốn theo thống kê mẫu có mang alen bệnh, không mang alen bệnh tổng số loại Mặc dù ARMS thơng thường Tetra-ARMS có số độ nhạy (1,0), độ đặc hiệu ARMS đạt 0,778 T-ARMS lại tiếp tục đạt số tối đa 1,0 (bảng 3) Như chắn độ đặc hiệu phương pháp Tetra-ARMS cao so với ARMS truyền thống đủ độ tin cậy để phát triển xa tương lai Bảng 3: Bảng thống kê mẫu bệnh/không bệnh, tổng số loại, số nhạy đặc hiệu ARMS Tetra-ARMS THẢO LUẬN Với mục tiêu tầm soát đột biến Canton xuất gen G6PD quần thể người KinhViệt Nam, nghiên cứu này, Nghiên cứu Y học thực bệnh nhân thiếu men G6PD mà không tiến hành nhóm chứng (những người khỏe mạnh) Nguyên nhân việc theo nhiều nghiên cứu trước đột biến gen nguyên nhân gây bệnh thiếu men G6PD, việc khảo sát nhóm bệnh làm tăng xác suất bắt gặp đột biến so với nhóm đối chứng Nhằm góp phần hồn chỉnh sở liệu đột biến G6PD quần thể người Kinh thành phố Hồ Chí Minh phát triển phương pháp chẩn đoán bệnh hiệu mà tiết kiệm nhanh chóng so với phương pháp truyền thống khác, nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hố quy trình PCR Tetra-ARMS xác thực độ đặc hiệu tính xác kỹ thuật đột biến Canton (G1376T) Nghiên cứu tiến hành để điều tra độ đặc hiệu độ xác phương pháp Tetra-ARMS-PCR so với ARMS PCR thông thường dựa kết kiểm lại giải trình tự DNA - phương pháp tiêu chuẩn việc xác định đột biến Trong số 30 mẫu biết kiểu gen ARMS từ nghiên cứu trước đó(8), có bốn mẫu có kết mâu thuẫn ARMS thường Tetra-ARMS quan sát Tất kết không khớp mang kiểu gen dị hợp tử phát ARMS PCR, phương pháp truyền thống khơng chẩn đốn cách xác dù số bốn mẫu so sánh với sắc ký đồ trình tự DNA, kết phải kiểu gen đồng hợp tử Nguyên tắc phản ứng ARMS-PCR dựa tính đặc hiệu mồi phản ứng PCR Để xác định đột biến điểm, cần phải thiết kế mồi Trong mồi sử dụng chung cho mẫu bình thường mẫu có đột biến, mồi xi mồi ngược Hai mồi lại có trình tự giống nhau, trừ vị trí nucleotide đầu tận 3’ Mồi bình thường có trình tự nucleotide đầu tận 3’ bổ sung với trình tự DNA người bình thường Mỗi đột biến có nucleotide đầu tận 3’ bổ sung 303 Nghiên cứu Y học với trình tự DNA người có loại đột biến điểm Theo ngun tắc này, mồi bình thường khuếch đại đoạn DNA người bình thường mà khơng khuếch đại đoạn DNA người có đột biến; ngược lại mồi đột biến khuếch đại đoạn DNA người có đột biến mà khơng khuếch đại đoạn DNA người bình thường Như vậy, phương pháp thành công thiết kế mồi đặc hiệu hồn tồn với DNA đích đầu 3’ Do đó, kết xác định kiểu gen có sai sót chắn mồi đột biến khơng hồn tồn hoạt động hiệu cho alen đột biến Mặc dù ARMS PCR hiệu chỉnh thêm nucleotide gần đầu 3’ mồi tốn thời gian khơng đảm bảo phân biệt xác kiểu gene đồng hợp hay dị hợp tử Nhìn từ kết thực tế, ARMS PCR cho thấy bốn kiểu gen dị hợp tử tất chúng phải đồng hợp tử Điều cho thấy độ đặc hiệu ARMS thấp so với Tetra-ARMS – kỹ thuật xác định xác bốn kiểu đồng hợp tử từ bốn mẫu không khớp kết Rõ ràng phương pháp ARMS thơng thường có độ xác độ tin cậy thấp so với Tetra-ARMS, đặc biệt xác minh trường hợp có kiểu gen đồng hợp Như vậy, nhận thấy phương pháp Tetra-ARMS có vuợt trội so với phương pháp ARMS thông thường Trong phạm vi nghiên cứu đề tài 30 trẻ sơ sinh, so sánh với kết ARMS kiểm tra lại giải trình tự gen trực tiếp kết hồn tồn trùng khớp xác Đó minh chứng rõ ràng cho độ tin cậy phương pháp TetraARMS Vì mà Tetra-ARMS ngày áp dụng rộng rãi không lab mà thực tế lâm sàng, khơng xác định đột biến điểm gây thiếu men G6PD mà bệnh β - thalassemia, xác định tính đa hình HLA, apoprotein E bệnh Alzeimer Từ đó, phương hướng chúng tơi nghiên cứu thiết kế cặp 304 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 mồi tương ứng với vị trí đột biến điểm khác gen G6PD gây thiếu men enzyme G6PD Với thời gian ngắn để đạt kết quả, thuận lợi cho bệnh nhân người nhà có nhu cầu xác định đột biến gây bệnh, sàng lọc trước sinh, chẩn đoán sàng lọc sau sinh, tư vấn di truyền, tư vấn tiền hôn nhân Đồng thời, nghiên cứu tương lai, tiến hành thực cỡ mẫu lớn - kiểm tra số lượng lớn mẫu cơng việc cần thiết để tìm mối liên quan đột biến điểm khác với bệnh thiếu men G6PD Việt Nam phát triển tiềm Tetra-ARMS PCR để trở thành phương pháp chẩn đoán sử dụng rộng rãi tương lai KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong nghiên cứu này, tối ưu hóa thành cơng quy trình cho Tetra-ARMS PCR để tầm soát đột biến Canton - dạng đột biến điểm thay nucleotide G vị trí 1376 thành T cDNA - mẫu DNA bệnh nhân thiếu men G6PD Việt Nam Phương pháp vừa tiết kiệm hiệu khơng tiết kiệm thời gian hoá chất, mà kết đánh giá phương pháp từ nghiên cứu giúp cho cải tiến sau So với phương pháp khác, đặc biệt ARMS PCR, T-ARMS PCR kỹ thuật tiết kiệm thời gian, linh hoạt khâu chuẩn bị PCR hiệu chi phí Căn vào kết nghiên cứu này, nên nghĩ đến việc phát triển Tetra-ARMS chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền, tư vấn tiền hôn nhân Áp dụng phương pháp Tetra-ARMS - PCR sàng lọc trẻ sơ sinh để phát bệnh sớm, từ có biện pháp dự phòng thích hợp, đặc biệt trẻ nữ Nếu đơn đo hoạt tính enzyme G6PD, dễ dàng bỏ sót trường hợp nữ dị hợp có hoạt tính enzyme G6PD giới hạn bình thường Cảm ơn: Chúng xin chân thành cảm ơn bác sĩ bệnh nhân bệnh viện Từ Dũ tham gia nghiên cứu Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG - HCM đề tài mã số T2014-16-BT Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Mason PJ, Bautista JM and Gilsanz F, (2007) G6PD deficiency: the genotype-phenotype association Blood Rev 21(5): p 267-83 Matsuoka H et al (2007) Seven different glucose-6-phosphate dehydrogenase variants including a new variant distributed in Lam Dong Province in southern Vietnam Acta Med Okayama 61(4): p 213-9 Minucci A et al (2012) Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations database: review of the "old" and update of the new mutations Blood Cells Mol Dis 48(3): p 154-65 Newton CR et al (1989) Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res 17(7): p 2503-16 Nguyen Thi Hue et al (2013) Common mutations in G6PD of Vietnamese-Kinh deficient patients African Journal of Biotechnology 12(12): p 1318-1325 Nguyen Thi Hue et al (2013) The Canton mutation in G6PD deficient Vietnamese Wulfenia Journal 20(11): p 229-249 Nguyen Thi Hue et al (2013) The Viangchan-G6PD Mutation in Vietnamese-Kinh Int J Hum Genet 13(2): p 85-92 Noori-Daloii MR and Daneshpajooh M, (2008) Molecular basis of G6PD deficiency: current status and its perpective Acta Medica Iranica 46(3): p 167-182 Peters AL and Van Noorden CJ, (2009) Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and malaria: cytochemical detection of heterozygous G6PD deficiency in women J Histochem Cytochem 57(11): p 1003-11 Nghiên cứu Y học 10 11 12 13 14 15 16 Tagarelli A et al (2006) Reliability of quantitative and qualitative tests to identify heterozygotes carrying severe or mild G6PD deficiency Clin Biochem 39(2): p 183-6 Verle P et al (2000) Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in northern Vietnam Trop Med Int Health 5(3): p 203-6 Weiying J, Guolong Y, and Peng L (2006) Structure and function of glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency variants in Chinese population Hum Genet 119: p 463-487 Wittwer CT (2009) High‐resolution DNA melting analysis: advancements and limitations Human mutation 30(6): p 857859 Wolf BH et al (1987) Detection of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in erythrocytes: a spectrophotometric assay and a fluorescent spot test compared with a cytochemical method Clin Chim Acta 168(2): p 129-36 Ye S, Humphries S and Green F, (1992) Allele specific amplification by tetra-primer PCR Nucleic Acids Res 20(5): p 1152 Ye S et al (2001) An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms Nucleic Acids Res 29(17): p E88-8 Ngày nhận báo: 25/05/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 09/06/2015 Ngày báo đăng: 05/09/2015 305 ... gây bệnh đột biến bệnh thiếu men G6PD quy mô lớn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng phương pháp thu thập mẫu Đối tượng nghiên cứu quần thể người Kinh bị thiếu men G6PD Mẫu máu khô từ em bé sơ sinh. .. Kinh thành phố Hồ Chí Minh phát triển phương pháp chẩn đoán bệnh hiệu mà tiết kiệm nhanh chóng so với phương pháp truyền thống khác, nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hoá quy trình PCR Tetra-ARMS. .. tơi tối ưu hóa thành cơng quy trình cho Tetra-ARMS PCR để tầm soát đột biến Canton - dạng đột biến điểm thay nucleotide G vị trí 1376 thành T cDNA - mẫu DNA bệnh nhân thiếu men G6PD Việt Nam Phương