Nguyên nhân gây bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH là do đột biến đồng hợp trên gen MUTYH. Protein MUTYH là enzyme DNA glycosylase có vai trò quan trọng trong hệ thống sửa chữa cắt bỏ các base. Các nghiên cứu trên quần thể người Châu Âu xác định 2 đột biến p.Y179C và p.G396D là đột biến gen MUTYH phổ biến nhất. Hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu về kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân MAP tại Việt Nam.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học BÁO CÁO TRƯỜNG HỢP BỆNH NHÂN MẮC BỆNH ĐA POLYP LIÊN QUAN ĐẾN GEN MUTYH Nguyễn Hữu Huy*, Bùi Chí Viết**, Huỳnh Nguyễn Minh Quân**, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Trung Tín**, Nguyễn Hồng Bắc**, Nguyễn Thị Băng Sương** TĨM TẮT Mở đầu: Nguyên nhân gây bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH đột biến đồng hợp gen MUTYH Protein MUTYH enzyme DNA glycosylase có vai trò quan trọng hệ thống sửa chữa cắt bỏ base Các nghiên cứu quần thể người Châu Âu xác định đột biến p.Y179C p.G396D đột biến gen MUTYH phổ biến Hiện chưa có nghiên cứu kiểu gen kiểu hình bệnh nhân MAP Việt Nam Mục tiêu: Phát đột biến dự đoán ảnh hưởng đột biến lên protein Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Chúng báo cáo trường hợp bệnh nhân nam, 58 tuổi, bị ung thư đại trực tràng Chúng tiến hành giải trình tự tìm đột biến gen APC, MUTYH sử dụng công cụ sinh tin học để dự đoán tác động đột biến Kết quả: Đã phát đột biến c.934-2A>G, c.1014G>C c.1453G>A gen MUTYH phân tích tác động đột biến lên chức protein Kết luận: Nghiên cứu báo cáo trường hợp mắc bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH tìm đột biến gen MUTYH Từ khoá: Bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH, giải trình tự ABSTRACT REPORT A MUTYH-ASSOCIATED POLYPOSIS (MAP) CASE Nguyen Huu Huy, Bui Chi Viet, Huynh Nguyen Minh Quan, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Nguyen Hoang Bac, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 183 - 188 Introduction: MUTYH-associated polyposis (MAP) is caused by biallelic germline mutations of the MUTYH gene The MUTYH protein is an adenine-specific DNA glycosylase involved in the base excision repair (BER) system Most previous studies based on European Caucasian patients reported p.Y179C and p.G396D as the most frequent germline mutations of MYH However, insufficient information on genotypic and phenotypic characteristics of MAP in Vietnamese patients is available at present Objective: Detect specific mutations and predict potential effects of these mutations on protein Materials and Methods: We report a 58-year-old male patient with colorectal cancer Mutations detected using sequence analysis of the APC and MUTYH genes Bioinformatic software was used to predict effects of the mutation Results: We successfully detected c.934-2A>G, c.1014G>C and c.1453G>A mutations on MUTYH gene and analysed effects of these mutations on MUTYH protein * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Conclusion: We reported for the first time a MUTYH-associated polyposis (MAP) and found mutations on MUTYH gene in a Vietnamese patient Keywords: MUTYH-associated polyposis (MAP), sequencing (p.Gly396Asp) exon 13 Đây đột biến sai ĐẶT VẤN ĐỀ nghĩa chiếm đến 90% đột biến gen MUTYH Vào năm 2002, Al Tassan tìm thấy đột quần thể người Châu Âu(10) Tuy nhiên biến soma G>T gen APC u tuyến đột biến khơng tìm thấy bệnh nhân đa polyp đại trực tràng Hàn Quốc(8), Nhật Bản(12) Điều cho thấy khơng có đột biến dòng mầm gen APC Sau đột biến sáng lập (founder nhóm nghiên cứu tìm đột biến dòng mầm mutation) đặc trưng quần thể người Châu Âu gen sửa chữa cắt bỏ base MUTYH nguyên Hiện Việt Nam, chưa có đề tài nhân gây bệnh đặt tên bệnh bệnh đa nghiên cứu gen MUTYH bệnh polyp liên quan đến gen MUTYH (MUTYHlý đột biến gen Vì chúng tơi tiến associated polyposis - MAP, OMIM #608456) (2) hành nghiên cứu đột biến gen MUTYH Biểu lâm sàng bệnh có từ 10 đến vài bệnh nhân mắc bệnh đa polyp đại trực tràng với trăm polyp đại trực tràng, không mong muốn phát đột biến gen MUTYH điều trị nguy mắc ung thư đại trực tràng gây bệnh người Việt Nam Chúng xin báo 43 - 100%(8) Tuy nhiên triệu chứng bệnh cáo trường hợp bệnh nhân mắc bệnh đa giống với bệnh đa polyp tuyến gia đình đột polyp liên quan đến gen MUTYH biến dòng mầm gen APC nên bệnh nhân bị đa ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU polyp đại trực tràng cần kiểm tra đột biến dòng mầm gen APC MUTYH (13) Đối tượng nghiên cứu Gen MUTYH (mutY Homolog (E.coli)) nằm nhiễm sắc thể số vị trí 1p34.3-p32.1, dài 11,2 kb có 16 exon Đây gen mã hóa cho enzyme glycosylase MUTYH có chức cắt bỏ base Adenine, bước hệ thống sửa chữa cắt bỏ base giúp ngăn chặn đột biến đảo chuyển G:C>T:A Nhiều nghiên cứu chứng minh đột biến dòng mầm làm suy giảm chức gen MUTYH làm tích lũy đột biến soma gen Kras APC dẫn đến ung thư đại trực tràng(10) Trên giới, có nhiều nghiên cứu đột biến gen MUTYH Ước tính có 303 đột biến gen MUTYH ghi nhận sở liệu Leiden Open Variations Database (http://www.LOVD.nl) Các đột biến gen MUTYH chủ yếu đột biến sai nghĩa dẫn đến thay đổi acid amin thành acid amin khác, gặp đột biến thêm cặp nucleotide đột biến vô nghĩa Hai đột biến phổ biến c.536A>G (p.Tyr179Cys) exon c.1187G>A 184 Bệnh nhân nam, 58 tuổi, nhập viện ung thư đại trực tràng đa polyp với 50 polyp phát Bệnh nhân phẫu thuật cắt bỏ đại trực tràng, đồng thời lấy mẫu máu để phân tích gen APC gen MUTYH Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA genome từ mẫu máu Mẫu máu xử lý chống đông EDTA, tách chiết 24 Quy trình tách chiết DNA genome từ 200 μl máu ngoại vi tiến hành theo QiAgen Kit Đo nồng độ độ tinh DNA tách chiết, mẫu có tỷ lệ giá trị mật độ quang bước sóng 260/280 nm đạt từ 1,8 đến 2,0 dùng để tiến hành phản ứng PCR giải trình tự gen Kĩ thuật giải trình tự gen Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại toàn 15 exon gen APC 29 cặp mồi 16 exon gen MUTYH cặp mồi Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 - Các thành phần phản ứng bao gồm: Mồi xuôi 0,2 μM, Mồi ngược 0,2 μM, đệm PCR 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, TakaraTaq 0,5U, DNA genome mẫu μl tổng thể tích 15 μl Nghiên cứu Y học thành nucleotide Guanine (G) vị trí c.934-2, dẫn đến làm vị trí cắt bỏ intron 10 - Chu trình nhiệt: Biến tính 98oC phút, sau 30 chu kỳ gồm 98oC 10 giây; 58oC 30 giây; 72oC phút, giai đoạn kết thúc gồm 72oC phút Tinh sản phẩm PCR giải trình tự đoạn sản phẩm khuếch đại Phân tích kết giải trình tự dự đốn tác động đột biến Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 so sánh với trình tự gen MUTYH lấy từ Genbank Phần mềm Pymol sử dụng để mô protein MUTYH bị đột biến Hình 2- Protein MUTYH bình thường protein MUTYH đột biến IVS10-2A>G Đột biến 2: c.1014G>C KẾT QUẢ Khi giải trình tự gen APC gen MUTYH bệnh nhân khơng có đột biến gen APC chúng tơi lại phát bệnh nhân có đến đột biến gen MUTYH trình bày sau Đột biến 1: c.934-2A>G Hình 3: Đột biến c.1014G>C Đột biến 3: c.1453G>A Hình Đột biến c.1453G>A Hình 1: Đột biến c.934-2A>G Nhận xét: Tại vị trí c So sánh với trình tự tham chiếu từ GenBank, chúng tơi phát intron 10 có đột biến splicing thay nucleotide Adenine (A) Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Sau phát đột biến bệnh nhân, sử dụng phần mềm sinh tin học để phân tích tác động đột biến lên chức protein Cấu trúc domain NUDIX protein MUTYH lấy từ http://www.rcsb.org Chúng sử dụng phần 185 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 mềm Pymol để so sánh protein MUTYH bình thường protein đột biến p.Ala485Thr Hình 5: So sánh cấu trúc 3D protein A: Protein MUTYH (bình thường) B: Protein MUTYH (đột biến p.Ala485Thr) liên quan trực tiếp đến trình splicing mRNA Khi xuất đột biến vùng intron 10 nằm exon 10 exon 11 không cắt bỏ mà tồn mRNA nên tạo mã kết thúc sớm làm protein MUTYH bị cắt ngắn (p.Glu313SerfsX8) làm vị trị gắn protein APE1 PCNA đồng thời không trình tự tín hiệu định vị vào nhân (a nuclear localization signal - NLS), protein MUTYH vào nhân để thực vực sửa chữa DNA bị hư hỏng dẫn đến tích lũy đột biến đảo chuyển G:C>T:A gen Kras, APC gây ung thư(14) Về đột biến c.1014G>C Protein MUTYH enzyme DNA glycosylase có vai trò quan trọng hệ thống sửa chữa cắt bỏ base giúp ngăn chặn đột biến gốc oxy hóa tự do, xạ ion hóa Các đột biến gen MUTYH gây ảnh hưởng đến chức protein MUTYH làm tích lũy đột biến gen gây ung thư đại trực tràng tăng nguy mắc nhiều loại ung thư khác(10) Đột biến c.1014 G>C xác định đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms – SNPs) gen MUTYH Đột biến thay đổi codon GTG thành CTG, làm thay đổi amino acid gGlutamine thành Histidine vị trí 338 protein MUTYH (p.Gln338His) thường biết đến với tên SNP Q324H (rs3219489) nghiên cứu lâm sàng Nhật Bản cho thấy SNP Q324H làm gia tăng nguy ung thư đại trực tràng(7,15) Nghiên cứu in vitro cho thấy SNP Q324H làm suy giảm 36% hoạt tính sửa sai protein MUTYH(1) Đặc biệt chức glycosylase protein MUTYH tăng cường phức hợp protein checkpoint Rad9-Rad1-Hus1(13) vùng kết nối chứa SNP Q324H có nhiệm vụ trì tương tác với phức hợp Rad9-Rad1-Hus1(11) SNP Q324H chứng minh làm giảm tương tác với phức hợp Rad9-Rad1-Hus1 đồng thời biểu cDNA Q324H dạng hoang dại dòng tế bào ngun bào sợi phơi chuột knock-out gen MUTYH dòng tế bào biểu Q324H nhạy cảm xử lý với yếu tố oxy hóa có tích lũy 8-oxo-dG, tốc độ loại bỏ base bị oxy hóa gen chậm dòng biểu MUTYH hoang dại(16) Về đột biến c.934-2A>G Về đột biến c.1453G>A Theo nghiên cứu Tao đột biến c.9342A>G nằm vùng intron 10 (IVS10-2A>G) Đột biến c.1453G>A xác định đột biến gen MUTYH chưa công bố Chúng nhận thấy đột biến p.Ala485Thr nằm vùng loop nối xoắn alpha domain NUDIX protein MUTYH không ảnh hưởng đến liên kết hydro protein Tuy nhiên amino acid alanine amino acid không phân cực, kị nước nên nằm lõi protein Threonine lại amino acid phân cực ưa nước thường nằm bề mặt protein thay đổi amino acid ảnh hưởng đến gấp cuộn protein MUTYH Theo kết kiểm tra số ổn định protein (Delta-Delta-G) Site Directed Mutator (http://wwwcryst.bioc.cam.ac.uk/~sdm/sdm.php) cho thấy số Delta-Delta-G đột biến p.Ala485Thr -0,6, làm protein ổn định nhẹ(18) BÀN LUẬN 186 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 sở liệu Leiden Open Variations Database (http://www.LOVD.nl) Đột biến thay đổi codon GCT thành ACT, làm thay đổi amino acid Alanine thành Threonine vị trí 485 (p.Ala485Thr) Đột biến nằm vùng NODIX domain protein MUTYH (amino acid 364 đến 495) NUDIX domain có chức thủy phân liên kết nucleosidediphosphate với phân tử X(3) NUDIX domain bảo tồn protein MutT E.coli hay hMTH1 người, protein MutY vi khuẩn protein MUTYH người chứa vùng domain Theo nghiên cứu Yasuhiro Ushijima cộng đột biến c.1187G>A (p.Gly396Asp) exon 13 nằm vùng NUDIX domain làm ảnh hưởng đến hoạt tính DNA glycosylase protein MUTYH hydroxyadenine (2-OH-A) bắt cặp với guanine 1,5% so với protein MUTYH bình thường nhiên hoạt tính DNA glycosylase adenine bắt cặp với 8oxoguanine (8-oxoG) khơng ảnh hưởng Điều cho thấy đột biết G396D làm giảm khả xử lý 2-OH-A bắt cặp với guanine làm tích lũy đột biến đảo chuyển G:C>T:A(17) Nghiên cứu Kairupan(6) phát đột biến c.1465G>A (p.Ala489Thr) nghiên cứu Dallosso(4) phát đột biến c.1465G>A (p.Thr477Met) bệnh nhân mắc bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH Trong báo cáo chúng tôi, bệnh nhân mắc bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH có đột biến dị hợp gen MUTYH Bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường nên trường hợp giải thích tượng dị hợp kép (compound heterozygous) đột biến nằm allele gen Trường hợp thường xuất nước phương Tây nơi đột biến c.536A>G (p.Tyr179Cys) c.1187G>A (p.Gly396Asp) phổ biến dân số(10) Đặc biệt đột biến dị hợp IVS10-2A>G tương tự bệnh nhân chúng tơi tìm thấy nghiên cứu Hàn Quốc Nhật Bản Điều Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học cho thấy thể đột biến đặc trưng người châu Á(8,12) Bên cạnh bệnh nhân dị hợp SNP Q324H đột biến p.Ala485Thr chưa công bố KẾT LUẬN Đây nghiên cứu gene MUTYH bệnh nhân mắc bệnh đa polyp đại trực tràng tiến hành Việt Nam Nghiên cứu phát ba đột biến gene MUTYH mắc bệnh đa polyp Đồng thời nghiên cứu dự đoán ảnh hưởng đột biến lên protein MUTYH Thành công mở triển vọng nghiên cứu đột biến gene MUTYH nhằm nâng cao lực chẩn đoán hỗ trợ điều trị bệnh nhân mắc bệnh đa polyp đại trực tràng TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 Ali M et al (2008), “Characterization of mutant MUTYH proteins associated with familial colorectal cancer”, Gastroenterology, 135: 499–507 Al-Tassan N, Chmiel NH, Maynard J, Fleming N, Livingston AL, Williams GT, Hodges AK, Davies DR, David SS, Sampson JR, Cheadle JP (2002), “Inherited variants of MYH associated with somatic G:C >T:A mutations in colorectal tumors”, Nat Genet, 30:227–232 Bessman MJ, Frick DN, and O'Handley SF (1996), “The MutT proteins or “Nudix” hydrolases, a family of versatile, widely distributed, “housecleaning” enzymes,” The Journal of Biological Chemistry, 271(41): 25059–25062 Dallosso AR, Dolwani S, Jones N, et al (2008), “Inherited predisposition to colorectal adenomas caused by multiple rare alleles of MUTYH but not OGG1, NUDT1, NTH1 or NEIL 1, or 3”, Gut, 57(9): 1252-1255 Jones S, Emmerson P, Maynard J, Best JM, Jordan S, Williams GT, et al (2002), “Biallelic germline mutations in MYH predispose to multiple colorectal adenoma and somatic G:C– >T:A mutations”, Hum Mol Genet, 11:2961–7 Kairupan CF, Meldrum CJ, Crooks R, et al (2005), “Mutation analysis of the MYH gene in an Australian series of colorectal polyposis patients with or without germline APC mutations”, Int J Cancer, 116(1):73-7 Kasahara M et al (2008), “Association of MUTYH Gln324His and APEX1 Asp148Glu with colorectal cancer and smoking in a Japanese population”, J Exp Clin Cancer Res, 27: 49 Kim DW, Kim IJ, Kang HC, et al (2007), “Germline mutations of the MYH gene in Korean patients with multiplecolorectal adenomas”, Int J Colorectal Dis, 22:1173–8 Luncsford PJ et al (2010), “A structural hinge in eukaryotic MutY homologues mediates catalytic activity and Rad9-Rad1Hus1 checkpoint complex interactions”, J Mol Biol, 403(3): 351–370 Nielsen M, Morreau H, Vasen HF, et al (2011), “MUTYHassociated polyposis (MAP)” Crit Rev Oncol Hematol, 79 (1): 1-16 187 Nghiên cứu Y học 11 12 13 14 15 188 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Shi G, et al (2006), “Physical and functional interactions between MutY glycosylase homologue (MYH) and checkpoint proteins Rad9-Rad1-Hus”, Biochem J, 400:53–62 Shinmura K, Goto M, Tao H, et al (2014), “Impaired 8Hydroxyguanine Repair Activity of MUTYH Variant p.Arg109Trp Found in a Japanese Patient with Early-Onset Colorectal Cancer”, Oxid Med Cell Longev, 2014: 617351 Sieber OM, Lipton L, Crabtree M, et al (2003), “Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations in MYH”, N Engl J Med, 348(9):791–799 Tao H, Shinmura K, Hanaoka T, et al (2004), “A novel splicesite variant of the base excision repair gene MYH is associated with production of an aberrant mRNA transcript encoding a truncated MYH protein not localized in the nucleus”, Carcinogenesis, 25(10):1859-66 Tao H et al (2008), “Association between genetic polymorphisms of the base excision repair gene MUTYH and increased colorectal cancer risk in a Japanese population”, Cancer Sci, 99: 355–360 16 17 18 Turco E et al (2013), “Understanding the role of the Q338H MUTYH variant in oxidative damage repair”, Nucleic Acids Research , 41(7): 4093–4103 Ushijima Y, Tominaga Y, Miura T, et al (2005), “A functional analysis of the DNA glycosylase activity of mouse MUTYH protein excising 2-hydroxyadenine opposite guanine in DNA”, Nucleic Acids Res, 33(2):672-82 Worth CL, Preissner R, Blundell TL (2011), “SDM—a server for predicting effects of mutations on protein stability and malfunction”, Nucleic Acids Res, 39(Web Server issue): W215– W222 Ngày nhận báo: 17/8/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 16/9/2015 Ngày báo đăng: 20/10/2015 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học ... bệnh nhân mắc bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH Trong báo cáo chúng tôi, bệnh nhân mắc bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH có đột biến dị hợp gen MUTYH Bệnh đa polyp liên quan đến gen MUTYH. .. tràng gây bệnh người Việt Nam Chúng xin báo 43 - 100%(8) Tuy nhiên triệu chứng bệnh cáo trường hợp bệnh nhân mắc bệnh đa giống với bệnh đa polyp tuyến gia đình đột polyp liên quan đến gen MUTYH biến... Nam, chưa có đề tài nhân gây bệnh đặt tên bệnh bệnh đa nghiên cứu gen MUTYH bệnh polyp liên quan đến gen MUTYH (MUTYHlý đột biến gen Vì chúng tơi tiến associated polyposis - MAP, OMIM #608456)