Nghiên cứu này nhằm mô tả phản ứng của quần thể tế bào Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg dương với các tình trạng tổn thương gan khác nhau.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO TREG VÀ TH17 Ở BỆNH NHÂN NHIỄM HBV MẠN HBEAG DƯƠNG:MÔ TẢ HÀNG LOẠT CA Lê Thị Thúy Hằng*, Phan Vĩnh Thọ**, Lương Bắc An***, Nguyễn Thị Tuyết****, Đường Thị Hồng Diệp***, Đỗ Thị Thanh Thủy***, Phạm Thị Lệ Hoa* TÓM TẮT Mở đầu: Hậu thời điểm kết cục nhiễm viêm gan siêu vi B (HBV) mạn kết tương tác hoạt tính siêu vi phản ứng miễn dịch thể Hiện nay, nghiên cứu miễn dịch tế bào cho thấy hai phản ứng ngược chiều diện trình Phản ứng ức chế tế bào Treg xem bảo vệ ký chủ với tổn thương mức gây dung nạp HBV Phản ứng kích hoạt miễn dịch tế bào Th17 xem có vai trò thải trừ siêu vi chấm dứt nhiễm trùng gây nguy hiểm phản ứng đà Trong trình nhiễm HBV, phản ứng miễn dịch diễn chưa tìm hiểu nhiều Nghiên cứu nhằm mô tả phản ứng quần thể tế bào Treg Th17 bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg dương với tình trạng tổn thương gan khác Thiết kế: mô tả hàng loạt ca thực 57 bệnh nhân nhiễm HBV mạn khám ngoại trú phòng viêm gan BV ĐHYD điều trị nội trú BV Bệnh Nhiệt đới TP HCM, thuộc ba nhóm ALT (2-5ULN >10ULN) Phản ứng tế bào Treg Th17 đo kĩ thuật Flowcytometry máy FACS, tính đơn vị tỷ lệ % quẩn thể CD4+ Trung tâm Y Sinh học Phân Tử ĐHYD TP HCM Kết quả: Tỉ lệ tế bào Treg Th17 nhóm ALT theo 1,12% 1,13%, 0,65% 1,08%, 3,52% 2,71% Tỉ lệ Treg/Th17 nhóm tương ứng 1, 0,95 1,75 Nhóm ALT >10ULN có phản ứng tế bào Treg Th17 cao nhóm ALT khơng tăng hay tăng ít; đồng thời phản ứng Treg ghi nhận tăng nhiều so với phản ứng Th17 Nhóm có ALT tăng mạnh ln kèm theo phản ứng Treg mạnh ½ số trường hợp có ALT khơng tăng có phản ứng Treg mạnh Vai trò gây dung nạp Treg với HBV cần tiếp tục khảo sát Kết luận: Phản ứng quần thể Th17 Treg cao rõ nhóm ALT>10 ULN Phản ứng tế bào Treg Th17 thấp (2 to ULN and >10 ALT) Treg and Th17 proportion were measured using Flow Cytometry at Ho Chi Minh City Center for Molecular Bio-Medicine Results: The proprotion of Treg and Th17 cells among CD4+ counts in patients groups of ALT (PNALT, >2 to ULN and >10 ULN) were 1.12% and 1.13%; 0.65% and 1.08%; and 3.52% and 2.71% respectively The ratio of Treg / Th17 were 1, 0.95 and 1.75 The extreme ALT group (>10ULN) had both of highest Treg and Th17 as compared to other groups with predominately higher on Treg than Th17 All of patients in the group with extremed ALT had also higher Treg response Otherwise, half of the PNALT group had high Treg response Conclusion: The Treg and Th17 responses were highest in the group with extreme ALT Cases with PNALT who had high Treg responses need to be further investigate Keyword: Treg, Th17 and immune ĐẶT VẤN ĐỀ Mặc dù siêu vi viêm gan siêu vi B (HBV) không gây tổn thương gan trực tiếp hậu bệnh lý nhiễm HBV phản ứng miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu với tồn vi rút kháng nguyên vi rút gan Các nghiên cứu miễn dịch tế bào cho thấy quần thể tế bào lympho TCD4 có vai trò nhận diện kháng ngun vi rút trợ giúp phản ứng miễn dịch Trong nhiễm HBV mạn, tế bào quần thể TCD4 nhìn nhận thành nhóm hoạt tính gồm nhóm tế bào Th17 có hoạt tính kích thích miễn dịch nhóm tế bào Treg có vai trò ức chế miễn dịch tế bào Treg Hoạt động kích thích miễn dịch Th17 dẫn đến tổn thương tế bào mang kháng nguyên, giúp thải trừ siêu vi dẫn đến kết cục khỏi bệnh Tuy nhiên cá thể có phản ứng Th17 mức khơng kiểm sốt kịp hệ thống kìm hãm miễn dịch diễn biến gây suy gan cấp tử vong Hoạt tính ức chế miễn dịch bảo vệ thể tránh tổn thương mô mức phản ứng viêm thải trừ diễn mạnh lại nguyên nhân quan trọng gây dung nạp miễn dịch với HBV Trong nhiễm HBV mạn, quan hệ Chuyên Đề Nội Khoa nhóm hoạt tính điều khiển q trình diễn biến qua giai đoạn nhiễm HBV Sự cân cần thiết q trình kích thích ức chế miễn dịch giúp cho việc thải trừ siêu vi diễn dần mà không gây hậu tổn thương mô mức, dẫn đến khỏi bệnh Khi có thay đổi cân trình, thể diễn đợt diễn biến cấp, trạng thái bùng phát viêm gan dung nạp HBV kéo dài Vì nhiều bệnh nhân tự khỏi bệnh hay diễn biến nhiễm HBV ổn định lâu dài mà không cần điều trị Việc điều trị viêm gan B mạn cần thiết cho bệnh nhân khơng tự kiểm sốt siêu vi (có hoạt tính chép, HBeAg dương, HBVDNA cao) có chứng tổn thương gan thể tăng ALT hay có thay đổi mơ học(4,7) Thêm vào đó, ngưỡng bình thường ALT thay đổi theo quốc gia khu vực khơng phản ánh đầy đủ tổn thương gan(6) Một số nghiên cứu cho diện kháng nguyên HBeAg cao kéo dài gây tải kháng nguyên kiệt quệ phản ứng miễn dịch(1) Tuy vậy, HBeAg dương, HBVDNA cao kéo dài gặp số bệnh nhân người lớn người 40 tuổi xem yếu tố nguy xơ gan ung thư gan Nghiên cứu 131 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 nhằm khảo sát mô tả ban đầu phản ứng hai tiểu quần thể TCD4 Treg Th17 bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg dương có mức tăng ALT khác Tỷ lệ (%) Th17: Tỷ lệ % tế bào Th17 quần thể tế bào TCD4 máu ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU ALT thực máy sinh hóa tự động; xét nghiệm HBeAg định tính (S/CO HBeAg >1), định lượng HBVDNA thực kỹ thuật in-house real time PCR máy Cobas, (ngưỡng phát >300 cps/ml) bệnh viện ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP HCM Thiết kế Mô tả hàng loạt ca Dân số nghiên cứu Bệnh nhân nhiễm HBV mạn khám ngoại trú Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh bệnh nhân viêm gan B mạn đợt bùng phát điều trị nội trú khoa Nhiễm A, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh Thời gian nghiên cứu Khoa nhiễm A Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Phòng viêm gan Bệnh viện ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh từ 3/2018 đến 11/2018 Tiêu chuẩn chọn bệnh Bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg dương kéo dài > tháng chưa điều trị đồng ý tham gia nghiên cứu Thuộc nhóm ALT: Nhóm ALT bình thường kéo dài > tháng (PNALT) Nhóm ALT > đến < ULN Nhóm ALT > 10 ULN Tiêu chuẩn loại trừ Khơng có bệnh gan khác: viêm gan C, HIV, bệnh gan chuyển hóa, Bệnh có bệnh kèm theo khác: xơ gan, K gan, tiểu đường, bệnh lí khớp, Khơng có bệnh lý liên quan với rối loạn miễn dịch, Khơng có bệnh nhiễm trùng cấp gây sốt hay phản ứng bạch cầu bất thường, Phụ nữ có thai, địa dị ứng Biến số Nhóm ALT: gồm nhóm: 2-5 ULN, >10 ULN với ULN =40U/L Tỷ lệ (%) Treg: Tỷ lệ % Treg quần thể tế bào TCD4 máu 132 Tỷ số tỷ lệ Treg/Th17 Kỹ thuật Phân lập xác định tỉ lệ % tế bào Treg Th17 thực máy Flowcytometry FACS Trung Tâm Y Sinh học Phân Tử ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Trình tự thực kỹ thuật Phân lập tế bào: Thu nhận ml máu toàn phần từ bệnh nhân vào ống lấy máu có EDTA, để 40C Xử lý mẫu vòng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Ficoll Paque (Sigma Aldrich, USA) Tóm tắt sau: pha lỗng ml máu với ml PBS (-) 1X, đảo nhẹ ống máu -4 lần, sau nhẹ nhàng chuyển toàn 8ml lên bề mặt 6ml Ficoll fancol sạch, tránh làm xáo trộn bề mặt Ly tâm 400g, 150C 30 phút Thu nhận lớp tế bào trắng đục nằm lớp huyết tương lớp Ficoll Pha loãng lớp tế bào vừa thu nhận với PBS (-) 1X với tỷ lệ 1:1, ly tâm với tốc độ 0,5g phút Rửa pellet tế bào ml PBS (-) 1X, ly tâm với tốc độ 0,5g phút Tại giai đoạn này, pellet tế bào có chứa quần thể tế bào Th17 Treg Xác định tỷ lệ quần thể tế bào Th17/Treg: Tỷ lệ quần thể tế bào Th17 Treg xác định Kit Human Th17/Treg Phenotyping BD PharMingen (San Diego, CA) Bộ Kit BD PharMingen dạng cocktail chứa ba kháng thể CD4 PerCP, FoxP3 APC IL 17A PE Quần thể tế bào Th17 Treg sau thu nhận ủ với PMA/ Ionomycin (50ng/ml: 1mg/ml 106 tế bào) mơi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FCS, ủ tủ nuôi với điều kiện 5% CO2 370C vòng đồng hồ Sau đó, Chun Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học rửa tế bào với PBS (-) 1X hai lần thu nhận pellet tế bào Huyền phù pellet tế bào 200 ul PBS (-) 1X Cố định tế bào paraformaldehyde 10%, vortex nhẹ, ủ vòng - 10 phút nhiệt độ phòng Rửa tế bào PBS (-) 1X lần Ủ tế bào với Buffer B 1X 30 phút nhiệt độ phòng, tối Rửa tế bào PBS (-) 1X lần Huyền phù nhẹ lớp tế bào 150 ul PBS (-) 1X Bổ sung 10 ul cocktail BD PharMingen, huyền phù với dung dịch tế bào, ủ tối 45 phút Sau đó, rửa tế bào PBS (-) 1X lần, ly tâm 0,5g phút, thực điều kiện tránh sáng Huyền phù pellet tế bào 300 ul PBS (-) 1X Phát quần thể tế bào Th17 Treg máy flow cytometry FACS Calibur (BD biosciences, CA, USA), kết phân tích phần mềm FACS Diva (BD biosciences, CA, USA) Biểu đồ 1: Tỷ lệ tế bào Treg nhóm ALT(n=57) Phân tích trình bày số liệu: kết trình bày bảng biểu đồ so sánh phần mềm SPSS16.0, p2% 9%) tỷ lệ Th17 phân bố giá trị trung bình hay khơng cao Biểu đồ 3: Tỉ lệ Treg/Th17 nhóm ALT (n=57) điều hòa phản ứng miễn dịch Quần thể Treg có vai trò kìm hãm phản ứng miễn dịch q mức nhằm hạn chế tổn thương phản ứng miễn dịch, bảo vệ thể trước phản ứng tổn thương mức Phản ứng ưu kéo dài Treg gây dung nạp miễn dịch Ngược lại, quần thể tế bào Th17 có tác dụng kích thích phản ứng miễn dịch thải trừ siêu vi, gây tổn thương tế bào chấm dứt tình trạng nhiễm bệnh Trong nghiên cứu ban đầu này, khảo sát phản ứng hai quần thể tế bào TCD4+ gồm Treg Th17 nhóm 29 bệnh nhân có men gan bình thường (PNALT), nhóm men gan tăng < ULN (8 bệnh nhân) nhóm ALT > 10 ULN gọi viêm gan bùng phát (20 bệnh nhân) Kết (hình 2) cho thấy phản ứng quần thể Treg Th17 tăng nhẹ với mức độ phản ứng quẩn thể tế bào tương đương nhóm khơng có tổn thương gan hay tổn thương gan không đáng kể (PNALT ALT < ULN, tỷ lệ tương ứng 1,12% 0,65%) Phản ứng kích thích miễn dịch ức chế miễn dịch (Treg 3,52% Th17 2,71%) tăng nhiều nhóm ALT >10 ULN Về cân quần thể Treg Th17 viêm gan B mạn Biểu đồ 4: Ma trận phân bố Treg Th17 theo nhóm ALT (n=57) BÀN LUẬN Treg Th17 tiểu quần thể tế bào lympho T trợ giúp TCD4+ phản ứng miễn dịch không đặc hiệu Trong miễn dịch với viêm gan B, hai quần thể có vai trò quan trọng tác động nghịch chiều việc 134 Trong công bố nghiên cứu trước đây, phản ứng tế bào Treg Th17 quan sát thấy tăng nhiều nhóm viêm gan bùng phát so với nhóm men gan bình thường kéo dài nhóm viêm gan với men gan tăng < ULN, đồng thời tác giả nhận thấy phản ứng Th17 nhóm viêm gan bùng phát tăng ưu phản ứng tế bào Treg, tỷ lệ Treg/Th17 10 ULN, phản ứng tế bào Treg ghi nhận tăng nhiều hơn, gấp 1,75 so với Th17, phù hợp giả định phản ứng ức chế miễn dịch huy động mãnh liệt nhằm hạn chế tổn thương gan thêm cá thể có tổn thương gan nghiêm trọng Có lý giải cho khác biệt này: (1) nhóm tổn thương gan diễn rầm rộ (ALT >10 ULN), phản ứng Treg đáp ứng thứ phát Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 diễn sau cần thiết đủ mạnh để đủ khống chế phản ứng gây tổn thương mức tế bào Th17 nhằm đạt hiệu bảo vệ phản ứng viêm nặng nề Điều phù hợp với kết cục tất 20 bệnh nhân nhóm viêm gan bùng phát hồi phục hoàn toàn (2) Các bệnh nhân nghiên cứu chúng tơi khơng có xơ gan, bệnh nhân nhóm bùng phát báo cáo Xue gồm bệnh nhân có khơng có xơ gan Phản ứng hai quần thể tế bào Treg Th17 cá thể có xơ gan với mức độ xơ gan khác có khác hay khơng với nhóm khỏe mạnh chưa xơ gan, có làm thay đổi kết cục đo lường cần quan sát tiếp(2,3) Ngoài ra, Biểu đồ cho thấy có kiểu phản ứng miễn dịch TCD4+ khác nhau: hai phản ứng Treg Th17 mức ơn hòa, phản ứng Treg ưu thế, phản ứng Th17 ưu hai phản ứng mức cao Nhóm có tăng ALT>10 ULN (biểu tượng hình sao) có phản ứng Th17 phản ứng Treg phân bố mức cao (> 2-10%) Khi hai phản ứng Treg Th17 mức thấp (nhóm ALT < ULN) cho thấy kiểu phản ứng an tồn khơng hứa hẹn thải trừ tốt siêu vi Thật vậy, lâm sàng kết cục chuyển huyết HBeAg dễ diễn sau đợt bùng phát viêm gan nặng khó diễn bệnh nhân đợt cấp viêm gan B mạn Ngồi gần ½ trường hợp nhóm PNALT có phản ứng tế bào Treg mức cao (2-8%) tế bào Th17 mức cao (2-9%) Tiếp tục theo dõi dọc so sánh kết cục dung nạp miễn dịch kéo dài hay thải trừ siêu vi hiệu với chuyển huyết HBeAg nhóm phản ứng Treg ưu thế, Th17 ưu hay hai ưu cho hiểu biết quan trọng chế miễn Chuyên Đề Nội Khoa Nghiên cứu Y học dịch nhiễm HBV có hướng dẫn thích hợp trị liệu viêm gan B mạn KẾT LUẬN Trong khảo sát ban đầu này, quan sát nhiều kiểu phản ứng cân hai quần thể tế bào miễn dịch Treg Th17 nhóm ALT Phản ứng miễn dịch nhẹ nhàng nhóm ALT 10ULN Thú vị nữa, nhóm men gan khơng tăng, có nhiều trường hợp có phản ứng Treg Th17 Các khảo sát tiếp nhiều nhóm bệnh hứa hẹn nhiều hiểu biết bệnh sinh bệnh lý viêm gan B mạn TÀI LIỆU THAM KHẢO Bertoletti A, Ferrari C (2016) “Adaptive immunity in HBV infection” J Hepatol, (64): S71–83 Chen Y, Fang J, Chen X et al (2015) “Effects of the Treg/Th17 cell balance and their associated cytokines in patients with hepatitis B infection” Exp Ther Med, 9(2): 573-578 Cuiping W, Xuejun D, Qian Y, Zhaoxia S (2018) “Influence of Th17/Treg balance on progression of liver cirrhosis in patients with chronic hepatitis B” Int J Clin Exp Med, 11(4): 3793-3799 Guidotti LG, Ishikawa T, Hobbs MV et al (1996) “Intracellular inactivation of the hepatitis B virus by cytotoxic T lymphocytes” Immunity, (4): 25–36 Niu YH, Yin DL, Liu HL et al (2013) “Restoring the Treg cell to Th17 cell ratio may alleviate HBV- related acute-on-chronic liver failure” World J Gastroenterol, 19(26): 4146-4154 Prati D, Taioli E, Zanella A, Della Torre E et al (2002) “Updated definitions of healthy ranges for serum alanine aminotransferase levels” Ann Intern Med, (137): 1–9 Seto WK, Lai CL, Ip PPC et al (2012) “A large population histology study showing the lack of association between ALT elevation and significant fibrosis in chronic hepatitis B“ PLoS One, 7(2): e32622 Xue-Song L, Cheng-Zhong L, Ying Z, Mo-Bin W (2012) “Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection” BMC Gastroenterol, (12): 43 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: 08/11/2018 10/12/2018 Ngày báo đăng: 10/03/2019 135 ... kiểu phản ứng miễn dịch TCD4+ khác nhau: hai phản ứng Treg Th17 mức ơn hòa, phản ứng Treg ưu thế, phản ứng Th17 ưu hai phản ứng mức cao Nhóm có tăng ALT>10 ULN (biểu tượng hình sao) có phản ứng Th17. .. nhằm khảo sát mô tả ban đầu phản ứng hai tiểu quần thể TCD4 Treg Th17 bệnh nhân nhiễm HBV mạn có HBeAg dương có mức tăng ALT khác Tỷ lệ (%) Th17: Tỷ lệ % tế bào Th17 quần thể tế bào TCD4 máu ĐỐITƯỢNG-... hòa phản ứng miễn dịch Quần thể Treg có vai trò kìm hãm phản ứng miễn dịch q mức nhằm hạn chế tổn thương phản ứng miễn dịch, bảo vệ thể trước phản ứng tổn thương mức Phản ứng ưu kéo dài Treg