Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sinh tổng hợp Anthocyanin trong nuôi cấy tế bào dâu tây

Bài viết khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng lên sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ lá và cuống của cây dâu tây in vitro; huyền phù tế bào dâu tây; sự sinh tổng hợp Anthocyanin của huyền phù tế bào dâu tây. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.

Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số - 2011 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HP ANTHOCYANIN TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO DÂU TÂY Phạm Thò Mỹ Trâm(1), Lê Thò Thuỷ Tiên(2) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một (2) Trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP.HCM TÓM TẮT Mô sẹo có nguồn gốc từ cuống dâu tây (Fragaria ananassa L.) in vitro nuôi cấy môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) bổ sung đường 30 g/l, 2,4-D 1,0 mg/l kinetin 0,3 mg/l Trong đó, mô sẹo phát sinh từ đặt điều kiện tối hình thành sớm cho sẹo có dạng bở Huyền phù tế bào tăng sinh tối tốt sáng Hàm lượng anthocyanin tế bào huyền phù đạt giá trò cao (7,52.10-3% FW) điều kiện chiếu sáng 4000 lux Từ khoá: anthocyanin, dâu tây, Fragaria ananassa L., huyền phù tế bào, mô sẹo * Giới thiệu khoảng 1% tổng hàm lượng chất có nó; việc nuôi cấy tế bào có Anthocyanin hợp chất màu hữu thể gia tăng hàm lượng chất flavonoid thiên nhiên, thuộc nhóm flavonoid, có màu lên tới 20 ‟ 30 % tổng thể tích [7] Vì vậy, đỏ, đỏ tía, xanh, diện số rau việc nghiên cứu tìm điều ngô, táo, dâu, nho, bắp cải [8], kiện môi trường thích hợp để gia tăng sinh sử dụng làm chất màu thực phẩm thay khối tế bào, qua tạo lượng lớn hợp cho chất màu tổng hợp hóa học nhờ vào chất anthocyanin nhà khoa giảm độc tố chúng Ngoài ra, học quan tâm anthocyanin có hoạt tính sinh học tốt người có khả giúp Phương pháp nuôi cấy tế bào thực thể chống chữa số bệnh như: tăng vậtcó nhiều tiềm để thu nhận huyết áp, oxi hoá, tổn thương gan, ngăn chặn anthocyanin với sản lượng cao Nhiều phát triển tế bào ung thư [9] công trình công bố sản xuất anthocyanin nuôi cấy mô hay nuôi Mặc dù vậy, lượng anthocyanin thực cấy tế bào huyền phù loài thực vật vật tổng hợp không đáp ứng đủ nhu cầu cho khác (như Catharanthus roseus [2], người, trình tách chiết Vitis sp [3], Fragaria ananassa [12]) phức tạp Theo nghiên cứu Kandil F cộng (2000), hàm lượng Ở báo này, bổ sung thêm flavonoid trái chiếm kết khảo sát ảnh hưởng ánh saùng 51 Journal of Thu Dau Mot university, No2 – 2011 lên tạo sẹo, huyền phù tế bào sinh 2.3 Khảo sát ảnh hưởng điều tổng hợp anthocyanin tế bào huyền phù kiện chiếu sáng lên tăng trưởng dâu tây Fragaria ananassa L huyền phù tế bào dâu tây Vật liệu, phương pháp Huyền phù tế bào dâu tây cấy chuyền 2.1 Khảo sát ảnh hưởng điều vào môi trường MS lỏng đặt kiện chiếu sáng lên hình thành sáng với cường độ chiếu sáng 2800 + 200 tăng trưởng mô sẹo từ cuống lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày dâu tây in vitro tối Vật liệu dùng để tạo mô sẹo Sự thay đổi thể tích tế bào lắng (SCV) mảnh non (5 x mm) cuống (0,8 ‟ huyền phù tế bào xác đònh sau 1,0 cm) dâu tây Fragaria ananassa tuần nuôi cấy L in vitro tuần tuổi Môi trường tạo sẹo 2.4 Khảo sát ảnh hưởng điều môi trường MS bổ sung inositol 100 mg/l, kiện chiếu sáng lên sinh tổng hợp đường (saccharose) 30 g/l, agar 7,5 g/l, 2,4-D anthocyanin huyền phù tế bào 1,0 mg/l kinetin 0,3 mg/l Quá trình tạo dâu tây sẹo tiến hành hai điều kiện: Huyền phù tế bào dâu tây cấy chuyền - Điều kiện sáng: Cường độ chiếu sáng: vào môi trường MS lỏng cảm ứng với 2800 + 200 lux; Nhiệt độ: 25 + 20C; Ẩm độ: ánh sáng có cường độ: 70 + 2%; Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày - Điều kiện tối: Nhiệt độ: 25 + 20C; Ẩm độ: 70 + 2% Ghi nhận kết tuần nuôi cấy  lux (tối hoàn toàn)  2800 + 200 lux  4000 + 200 lux với tiêu theo dõi: hình thái mô sẹo Hàm lượng anthocyanin thô (% trọng (chắc hay bở), ngày hình thành mô sẹo, màu lượng tế bào tươi: %FW) huyền phù tế sắc mô sẹo tỉ lệ tạo sẹo bào đo phương pháp pH vi sai sau tuần nuôi cấy 2.2 Sự tạo huyền phù tế bào dâu tây g mô sẹo dâu tây qua lần cấy chuyền 2.5 Phương pháp xử lí số liệu (8 tuần tuổi) cấy vào 20 ml môi trường Các thí nghiệm lặp lại lần Số liệu MS lỏng có thành phần tương tự thành xử lí phần mềm Microsoft Excel phần môi trường tạo sẹo Hệ thống tế Kết thảo luận bào nuôi máy lắc vòng với tốc độ 3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu 100 vòng/phút điều kiện tối với nhiệt sáng lên hình thành tăng trưởng độ 25 + 20C, độ ẩm 70 + 2% mô sẹo từ cuống dâu Huyền phù tế bào nuôi tuần tây in vitro sau chuyển sang môi trường Huyền phù tế bào cấy chuyền sau tuần Kết thí nghiệm khảo sát vai trò Hình thái tế bào dâu tây quan sát ánh sáng tác động lên hình thành mô kính hiển vi quang học sẹo trình bày bảng 3.1 52 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số - 2011 Bảng 3.1: Ảnh hưởng ánh sáng đến thời gian tạo sẹo hình thái mô seïo Điều kiện chiếu sáng Sáng Tối Ngày bắt đầu Hình thái Tỉ lệ tạo sẹo sau Mẫu cấy hình thành sẹo mô sẹo tuần nuôi cấy Lá 13 - 14 Chắc 64% Cuống 15 - 16 Chắc 59% Lá 10 - 11 Bở 93% Cuống 10 – 11 Chắc 94% Mô sẹo bắt đầu hình thành vò trí vết thương sau ngày thứ 10 ‟ 11 mẫu cuống đặt tối, ngày thứ 13 ‟ 14 mẫu ngày thứ 15 ‟ 16 mẫu cuống đặt sáng Ảnh 3.1 Mô sẹo từ cuống sau tuần nuôi cấy a) Mô sẹo từ cuống điều kiện sáng b) Mô sẹo từ cuống điều kiện tối c) Mô sẹo từ điều kiện sáng d) Mô sẹo từ điều kiện tối Đầu tiên, mô sẹo xuất vò trí vết Sẹo phát sinh từ cuống nhỏ, có thương, sau lan khắp bề mặt mẫu màu vàng nhạt Một số cuống không cấy Mô sẹo từ đặt điều kiện hình thành sẹo bò đen (ảnh 3.1.a) Đối sáng hình thành chậm, có màu vàng nhạt với mẫu cuống đặt điều Sau tuần nuôi cấy, kiện tối thời gian hình thành sẹo ngắn màu xanh mô sẹo chưa phủ hết mẫu tỉ lệ tạo sẹo cao (93 ‟ 94%) Sẹo hình cấy (ảnh 3.1.c) Tương tự, cuống đặt thành từ cuống có màu trắng vàng sáng hình thành sẹo chậm nhạt, có dạng (ảnh 3.1.b) Sẹo hình 53 Journal of Thu Dau Mot university, No2 – 2011 thành từ đặt tối có màu vàng Theo kết báo cáo Giang cộng cánh gián Sau tuần, sẹo phát triển (2009) ảnh hưởng số yếu tố khắp bề mặt lá, kích thước lớn có dạng lên sản xuất anthocyanin mô sẹo bở (ảnh 3.1.d) Sau lần cấy chuyền đầu huyền phù tế bào dâu tây Lâm Đồng, mô tiên, tế bào mô sẹo hình thành từ sẹo dâu tây phát sinh từ hình thành đặt tối tách rời nhau, mô sẹo khoảng ngày thứ ‟ trình trở nên xốp, thích hợp cho việc tạo nuôi cấy [5] huyền phù tế bào (ảnh 3.2) Mori cộng (1993) ghi nhận mô sẹo có nguồn gốc từ dâu tây phát triển tốt hàm lượng anthocyanin cao phận khác [13] 3.2 Sự tạo huyền phù tế bào dâu tây Mô sẹo đặt vào môi trường MS lỏng máy lắc vòng Sau 14 ngày nuôi Ảnh 3.2: Mô sẹo từ đặt tối sau cấy, huyền phù tế bào hình thành bao lần cấy chuyền gồm tế bào đơn, cụm tế bào nhỏ, màu vàng đậm đến nâu nhạt (ảnh 3.3) Ảnh 3.3: Tế bào huyền phù dâu tây Fragaria ananassa L sau 14 ngày a) Huyền phù tế bào (quan sát mắt b) Huyền phù tế bào kính hiển vi thường) quang học vật kính 40 3.3 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên tăng trưởng huyền phù tế bào dâu tây Kết khảo sát tăng trưởng huyền phù tế bào hai điều kiện sáng tối trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Sự gia tăng SCV huyền phù tế bào sáng toái Điều kiện chiếu sáng Sự gia tăng SCV (ml) Ngoài sáng 0,18 ± 0,03 Trong tối 0,33 ± 0,03 54 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số - 2011 Huyền phù tế bào tăng sinh lượng anthocyanin đạt 6,01.10-3% FW tối mạnh sáng Huyền phù tế cường độ ánh sáng 2800 lux thấp bào điều kiện tối phóng thích nhiều mẫu đặt điều kiện tối hoàn tế bào nhỏ, môi trường nuôi cấy có màu toàn với hàm lượng anthocyanin đạt vàng Trong đó, huyền phù tế bào 5,06.10-3% FW (bảng 3.3) điều kiện chiếu sáng có phóng thích Bảng 3.3: Hàm lượng anthocyanin tích tế bào Sự gia tăng SCV huyền phù luỹ tế bào huyền phù tối tuần thứ đạt 0,33 ml ở điều kiện chiếu sáng khác sáng đạt 0,18 ml (bảng 3.2) Đối với nhiều loài thực vật, tác Cường độ ánh sáng động lên hình thành tăng sinh (lux) mô sẹo trình nuôi cấy, ánh sáng Hàm lượng anthocyanin (% FW x 10-3) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp (tối hồn tồn) 5,06 + 0,63 hợp chất thứ cấp tế bào liên 2800 6,01 + 0,63 4000 7,52 + 1,44 quan đến hoạt động số enzyme nội bào [4] Thành phần môi trường yếu tố Theo nghiên cứu Tiên đồng tác vật lí có ảnh hưởng lớn đến tăng giả (2010), tăng trưởng mô sẹo trưởng, phát triển tế bào huyền phù tế bào từ thân non thông đường sản xuất hợp chất thứ cấp đỏ Lâm Đồng bò cản mạnh đặt Trong đó, ánh sáng yếu tố quan sáng hoạt tính taxol lại trọng kích thích sản xuất sản cao so với tối [1] phẩm bậc kể anthocyanin Tương tự, Sato cộng (1996) khảo nhiều loài thực vật [10] Dưới điều kiện sát số yếu tố ảnh hưởng đến tăng chiếu sáng, anthocyanin tổng hợp trưởng huyền phù tế bào dâu tây bao gồm tế bào thực vật để giảm mức độ ảnh cường độ chiếu sáng Theo tác giả, hưởng nghiêm trọng xạ ánh sáng, tăng trưởng huyền phù tế bào không phụ thúc đẩy nhanh chóng phục thuộc vào cường độ chiếu sáng [14] hồi hoạt động quang hợp [6] Như vậy, 3.4 Ảnh hưởng điều kiện chiếu việc tăng cường độ ánh sáng kích thích sáng lên sinh tổng hợp anthocyanin sản sinh anthocyanin tế bào huyền phù tế bào dâu tây mạnh Theo kết ghi nhận bảng 3.3, Kết thí nghiệm tương tự với hàm lượng anthocyanin tổng hợp kết nghiên cứu Sato cộng tế bào tăng lên tăng cường độ (1996) tế bào dâu tây Fragaria ánh sáng Hàm lượng anthocyanin cao ananassa Sự sinh tổng hợp anthocyanin nghiệm thức có cường độ ánh huyền phù tế bào dâu tây xảy sáng 4000 lux 7,52.10-3% FW, hàm cường độ chiếu sáng 0,8 klux Hàm 55 Journal of Thu Dau Mot university, No2 – 2011 lượng anthocyanin huyền phù tế bào xuất anthocyanin Ánh sáng ảnh nuôi cấy cường độ chiếu sáng 2,5 hưởng đến hoạt động enzyme sản xuất 8,0 klux tương ứng 0,04 0,19 mg/g anthocyanin Matsumoto cộng (1973) FW Vì thế, theo tác giả hàm cho hoạt động phenylalanine lượng anthocyanin tăng theo cường độ ammonia lyase (PAL) ‟ enzyme quan ánh sáng Khi quan sát kính hiển vi, trọng đường sinh tổng hợp tác giả nhận thấy tất tế anthocyanin, tăng cường tế bào sản xuất anthocyanin, tế bào bào tiếp xúc với xạ cao [11] chứa sắc tố không chứa sắc tố tồn Kết luận hệ thống nuôi cấy Sản lượng Trong nghiên cứu này, anthocyanin phụ thuộc vào khả sinh xác đònh số yếu tố thích hợp cho tổng hợp tế bào thành phần tăng sinh tế bào dâu tây Đà Lạt anthocyanin Khi cường độ ánh sáng tăng Fragaria ananassa L Điều kiện tối thích sản lượng anthocyanin tế bào huyền hợp cho hình thành tăng trưởng phù dâu tây tăng lên Tuy nhiên mô sẹo huyền phù tế bào Hàm tăng hàm lượng anthocyanin mà không ảnh lượng anthocyanin đạt giá trò tối đa hưởng đến phát triển tế bào tỉ lệ (7,52.10-3% FW) cường độ ánh sáng phần trăm tế bào chứa sắc tố [12] 4000 lux sau tuần nuôi cấy huyền phù tế Ánh sáng có chọn lọc ảnh bào dâu tây hưởng đến tế bào giai đoạn sản * EFFECT OF LIGHT ON CELL GROWTH AND ANTHOCYANIN BIOSYNTHESIS IN STRAWBERRY CELL CULTURES Pham Thi My Tram(1), Le Thi Thuy Tien(2) (1) Thu Dau Mot University, (2) University of Technology, VNU-HCM ABSTRACT Callus tisssues derived from the leaf and petiole of the strawberry (Fragaria ananassa L.) in vitro were cultured on MS medium (Murashige and Skoog, 1962) added sugars 30 g/l, 2,4-D 1.0 mg/l and kinetin 0.3 mg/l The calli derived from the leaves in dark condition were early induced and friable Suspension cells grew better in dark than in light Anthocyanin content in the suspension cells reached the highest value (7.52.10-3% FW) at 4000 lux.Key words: anthocyanin, callus, cell suspension, Fragaria ananassa L., strawberry Keywords: anthocyanin, callus, cell suspension, Fragaria ananassa L., strawberry TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Thò Thuỷ Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng, Khảo sát vài yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp taxol hệ thống tế bào Taxus wallichiana Zucc In vitro, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, tập 13, 2010 56 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số - 2011 [2] Carew DP and Krueger RJ., Anthocyanidins of Catharanthus roseus callus cultures, Phytochemistry 15, 1976, p 442 [3] Do CB, Cormier F., Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions, Plant Cell Rep 9, 1990, p 143-146 [4] Fett-Neto, A.G., Pennington, J.J and DiCosmo, F., Effect of white light on taxol and baccatin III accumulation in cell cultures of Taxus cuspidata Sieb and Zucc, J Plant Physiol, 146, 1995, p 584 ‟ 590 [5] Giang, P.T.H., Quynh, P.T and Tien, L.T.T, Effects of some factors on anthocyanin production in calli and cell suspension cultures of Lam Dong strawberry, Proceeding of the 11th conference on Science and Technology Biotechnology, VNU ‟ HCM, 2009 [6] Gould, K.S., Nature's Swiss army knife: the diverse protective roles of anthocyanins in leaves, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2004, p 314 ‟ 320 [7] Kandil, F., Song, L., Pezzuto, J., Seigler, D and Smith, M.A., Isolation of oligomeric proanthocyanidins from flavonoid - producing cell cultures, In Vitro Cell Dev Biol Plant Biol Plant, 36, 2000, p 492 ‟ 500 [8] Konczak ‟ Islam, I and Zhang, W., Anthocyanins – More than nature’s colours, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 2004, p 239 ‟ 241 [9] Kong, J., Chia, L., Goh, N and Brouillard, R., Analysis and biological activities of anthocyanins, Photochemistry, 64, 2003, p 923 ‟ 933 [10] Matsumoto, H., Tanida, Y and Ishizuka, K., Porphyrin intermediate involved in herbicidal action of a aminolevulinic acid on duckweed (Lemna paucicostata Hegelm), Journal of Pesticide Biochemistry and Physiology, 48, 1994, p 214 ‟ 221 [11] Matsumoto, T., Nishida, K., Noguchi, M and Tamaki, E., Some factors affecting the anthocyanin formation by Popuius cells in suspension culture, Agric, Biol Chem, 37, 1973, p 561 ‟ 567 [12] Mori, T and Sakurai, M., Effects of riboflavin and increased sucrose on anthocyanin production in suspended strawberry cell cultures, Plant Science, 113, 1996, 91 ‟ 98 [13] Mori, T., Sakurai, M., Shigeta, J., Yoshida, K and Kondo, T., Formation of anthocyanins from cells cultured from different parts of strawberry phants, J Sci Food Agric., 58, 1993, p 788 ‟ 792 [14] Sato, K., Nakayama, M and Shigeta, J., Culturing conditions affecting the production of anthocyanin in suspended cell cultures of strawberry, Plant Sci, 113, 1996, p 91 ‟ 98 57 ... cộng tế bào tăng lên tăng cường độ (1996) tế bào dâu tây Fragaria ánh sáng Hàm lượng anthocyanin cao ananassa Sự sinh tổng hợp anthocyanin nghiệm thức có cường độ ánh huyền phù tế bào dâu tây. .. tạo sẹo, huyền phù tế bào sinh 2.3 Khảo sát ảnh hưởng điều tổng hợp anthocyanin tế bào huyền phù kiện chiếu sáng lên tăng trưởng dâu tây Fragaria ananassa L huyền phù tế bào dâu tây Vật liệu, phương... đến tăng chiếu sáng, anthocyanin tổng hợp trưởng huyền phù tế bào dâu tây bao gồm tế bào thực vật để giảm mức độ ảnh cường độ chiếu sáng Theo tác giả, hưởng nghiêm trọng xạ ánh sáng, tăng trưởng