Bài viết xác định hàm lượng sắc tố A-xta-xan-tin trong tế bào của chủng nấm men Phaffia Rhodozyma NT5 được sử dụng làm thức ăn bổ sung trong nuôi trồng thủy sản thông qua nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp; khả năng phá vỡ tế bào; xác định hàm lượng A-xta-xan-tin.
29(1): 82-88 3-2007 Tạp chí Sinh học Xác định hàm lợng sắc tố a-xta-xan-tin tế bào chủng nấm men Phaffia rhodozyma NT5 đợc sử dụng làm thức ăn bổ sung nuôi trồng thuỷ sản Tống Kim Thuần, Trần Thanh Thủy Viện Công nghệ sinh học A-xta-xan-tin có nhiều chức sinh học sinh vật: khả chống oxy hóa, chống ung th Ngoài ra, hợp chất có vai trò quan trọng ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản Nếu thiếu a-xta-xan-tin, sản lợng độ sống sót cá động vật giáp xác nuôi trang trại giảm đáng kể Hơn nữa, đặc tính tạo màu a-xta-xan-tin làm cho thịt cá hồi vỏ động vật giáp xác có màu đỏ hồng Màu đỏ hồng thuộc tính cảm quan, liên quan chặt chẽ tới chất lợng giá trị sản phẩm Cá hồi động vật giáp xác không tự tổng hợp đợc a-xta-xan-tin mà chúng phải lấy a-xta-xan-tin từ nguồn thức ăn [1] Hiện nay, Phaffia rhodozyma loài nấm men đợc biết đến có khả sinh chất màu a-xta-xan-tin [2] Theo lý thuyÕt, loµi nÊm men P rhodozyma sinh mét sè carotenoit, a-xta-xan-tin chiếm tới 8387%, -caroten 2-2,5%, echinenon 2-4% phoenicoxanthin 5-7% Tuy nhiên, thực tế tỷ lệ a-xta-xan-tin chiếm khoảng 50-80% tổng số lợng carotenoit tế bào A-xtaxan-tin đợc tổng hợp bên tế bào nấm men Vì vậy, để tách chiết a-xta-xan-tin cần phải phá vỡ tế bào, sau dùng dung môi hữu khác để tách chiết A-xta-xan-tin phân cực nên tan nớc, nhng dễ tan dung môi hữu có độ phân cực thấp hay trung bình nh: clô-rô-phoóc, a-xê-tôn, mê-ta-nol, êtyl a-xê-tát, ê-ta-nol, đi-ê-tyl ê-te, he-xan, ê-te dầu mỏ Để tách chiết a-xta-xan-tin từ mẫu sinh khối tơi, ngời ta thờng dùng dung môi có khả trộn lẫn với nớc nh: axê-tôn, mê-ta-nol ê-ta-nol Các dung môi vừa có tác dụng làm khan mẫu, vừa hòa tan a-xta-xan-tin Dịch chiết sau đợc chuyển sang dung m«i kh«ng trén lÉn víi n−íc nh− 82 he-xan ê-te dầu mỏ để loại bỏ tạp chất tan nớc Sau đó, cho bay dung môi để cô đặc dịch chiết xác định hàm lợng a-xtaxan-tin có mẫu [3, 4] Hàm lợng a-xtaxan-tin chủng nấm men P rhodozyma khác khác nhau; phụ thuộc vào chủng giống, điều kiện nuôi cấy, phơng pháp tách chiết dung môi sử dụng Để xác định đợc xác hàm lợng a-xta-xan-tin sinh khèi cđa nÊm men P rhodozyma chóng t«i tiến hành nghiên cứu lựa chọn dung môi phơng pháp tách chiết a-xta-xan-tin phù hợp với điều kiện Việt Nam I Phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Chủng nấm men P rhodozyma NT5 đợc phân lập Việt Nam, đợc lu giữ Bộ su tập chủng giống vi sinh vật Phòng Các chÊt ho¹t tÝnh sinh häc tõ vi sinh vËt, ViƯn Công nghệ sinh học Phơng pháp a Môi trờng nuôi cấy Chủng nấm men P rhodozyma NT5 đợc nuôi cấy môi trờng Phaffia [2, 5] cải tiến bao gåm (g/l): ®−êng kÝnh: 20; cao nÊm men: 2; (NH4)2SO4: 2; KH2PO4: 1; MgCl2.6H2O: 0,5; CaCl2.2H2O: 0,1; n−íc cÊt: 1000 ml; pH = chỉnh H2SO4 NH4OH, dịch giống ban đầu 4% b Nuôi cấy Nuôi cấy lắc 200 vòng/phút bình tam giác 22oC Sau ngày, ly tâm dịch nuôi cấy 5000 vòng/phút 10 phút Sinh khối đợc sử dụng để xác định hàm lợng a-xta-xan-tin c Xác định trọng lợng khô Bằng phơng pháp xấy 105oC đến trọng lợng không đổi d Tách chiết phân tích hàm lợng a-xtaxan-tin - Phá vỡ tế bào: + Phá vỡ tế bào cát thủy tinh: cân 0,1 g sinh khối khô 0,7 g sinh khối tơi + g cát thủy tinh Trộn nghiền cối sứ Cứ sau phút lại lấy mẫu soi kính quan sát số lợng tế bào bị phá vỡ + Phá vỡ tế bào bi thủy tinh: cân 0,1 g sinh khối khô 0,7 g sinh khối tơi + g bi thđy tinh cã ®−êng kÝnh 0,2 cm Trộn lắc máy Vortex Cứ sau phút lại lấy mẫu soi dới kính hiển vi quan sát số tế bào bị phá vỡ + Phá vỡ tế bào áp lực: tế bào nấm men đợc phá vỡ áp lực 30.000 psi máy phá tế bào Cứ sau l¹i lÊy mÉu soi d−íi kÝnh hiĨn vi quan sát số tế bào bị phá vỡ - Tách chiết a-xta-xan-tin: A-xta-xan-tin đợc tách chiết trực tiếp từ 0,7 g sinh khối tơi nấm men đ đợc phá vỡ thành tế bào dung môi khác nhau: a-xê-tôn, cồn tuyệt đối, cồn 90 + n: he-xan, a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ (PE) theo phơng pháp đ đợc cấp phát minh sáng chế (patent) công nghệ sinh học (1994) [4], phơng pháp Johnson M J (1979) [5] vµ cđa Kelly C E - Harmon A W (1972) [8] - Xác định hàm lợng a-xta-xan-tin: phơng pháp đo độ hấp thụ A máy quang phổ UV-VIS (Spectrophotometer) [7,8] hàm lợng a-xta-xan-tin đợc tính theo công thức Kelly-Harmon 1972 [8] II Kết thảo luận Nghiên cứu khả sinh trởng sinh tổng hợp a-xta-xan-tin chủng nấm men P rhodozyma NT5 Chủng nấm men NT5 đợc nuôi cấy bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml môi trờng, lắc 200 vòng/phút nhiệt độ 22C Tỷ lệ tiếp giống ban đầu 4% Lấy mẫu để xác định khả sinh trởng sinh tỉng hỵp a-xta-xan-tin sau 0, 16, 24, 42, 72, 96 120 nuôi cấy Bảng Khả sinh trởng sinh tổng hợp a-xta-xan-tin chủng nấm men P rhodozyma NT5 Hàm lợng a-xta-xan-tin Thời Sinh khối Sinh khối Độ hấp thụ gian (h) tơi (g/l) khô (g/l) a-xta-xan-tin (467 nm) (àg/g SKK) KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ 16 26,2 6,55 KX§ KX§ 24 41,6 10,37 0,082 33,32 42 42,6 10,4 0,139 125,2 72 43,6 10,9 0,182 172,3 96 44,6 11,15 0,244 225,8 120 45,7 11,42 0,386 296,4 Ghi chú: tách chiết a-xta-xan-tin dung môi a-xê-tôn; KXĐ không xác định; SKK sinh khối khô Từ bảng cho thấy sinh khối nấm men tăng mạnh từ đến 24 nuôi cấy, sau tăng chậm dần từ 42 đến 96 đạt cực đại sau 120 (11,42 g/l) Hàm lợng a-xta-xan-tin tăng theo thời gian v đạt cực đại sau 120 nuôi cấy (296,4 àg/g sinh khối khô) Nghiên cứu khả phá vỡ tế bào chủng nấm men P rhodozyma NT5 Hiện nay, có nhiều phơng pháp phá vỡ tế bào nh: phơng pháp học, phơng pháp hóa học phơng pháp xử lý enzim[4] Trong thí nghiệm này, trình bày kết phá vỡ tế bào phơng pháp học Cụ thể tế bào nấm men khô đợc phá vỡ cát thủy tinh, bi thủy tinh kết đợc so sánh với phơng pháp phá vỡ tế bào máy phá áp lực cao Kết thí nghiệm đợc thể bảng 83 Bảng Khả phá vỡ tế bào khô chủng nấm men P rhodozyma NT5 phơng pháp học Thời gian phá vỡ tế bào (phút) 10 15 20 25 30 35 40 45 C¸t thđy tinh 15 20 35 50 60 75 78 84 85 KÕt qu¶ bảng cho thấy: phá vỡ tế bào máy áp lực cao cho kết tốt Chỉ sau 20 phút, số lợng tế bào bị phá vỡ hoàn toàn đạt tới 100% Trong đó, phá vỡ tế bào bi thủy tinh, kết đạt đợc sau 45 phút Phá vỡ tế bào cát thuỷ tinh cho kết thấp (sau 45 phút, có 85% tế bào bị phá vỡ) Dùng phơng pháp phá vỡ tế bào máy phá áp lực cho kết cao, tốn thời gian phơng pháp lại nhng chọn phơng pháp cho thí nghiệm tiếp sau đợc phơng pháp phá vỡ tế bào áp lực thao tác phức tạp phá vỡ lợng sinh khối nấm men lớn Do ®ã, c¸c thÝ nghiƯm tiÕp theo chóng Sè tÕ bào bị phá vỡ (%) Bi thủy tinh 20 27 50 70 83 92 93 95 100 M¸y ph¸ ¸p lùc 28 35 80 100 100 100 100 100 100 sử dụng phơng pháp phá tế bào bi thủy tinh Phơng pháp tiến hành vừa đơn giản lại cho hiệu không so với phơng pháp phá vỡ tế bào máy phá áp lực Nhng phơng pháp phá tế bào b»ng bi thđy tinh l¹i mÊt nhiỊu thêi gian Do đó, cần phải nghiên cứu để rút ngắn thời gian lại Để rút ngắn thời gian phá vỡ thành tế bào nâng cao hiệu xuất tế bào bị phá vỡ từ lợng sinh khối nh nhau, tiến hành nghiên cứu khả phá vỡ tế bào từ nguồn nguyên liệu sinh khối nấm men khô sinh khối tơi bi thuỷ tinh Kết thể bảng đợc minh hoạ hình 1, Bảng Khả phá vỡ tế bào nấm men P rhodozyma NT5 từ sinh khối khô tơi phơng pháp nghiền với bi thuỷ tinh Thời gian phá vỡ tế bào (phút) 10 15 20 25 30 40 45 84 Số tế bào bị phá vỡ (%) Sinh khối khô Sinh khèi t−¬i 0 20 26 27 50 50 67 70 80 83 93 92 100 95 100 100 100 Hình Tế bào P rhodozyma NT5 trớc bị phá vỡ bi thủy tinh Từ kết bảng hình 1, cho thấy: hiệu phá vỡ tế bào từ sinh khối tơi nấm men tốt sinh khối khô nhiều ChØ sau 30 phót, toµn bé tÕ bµo tõ sinh khối tơi hầu nh đ bị phá vỡ hoàn toàn Trong đó, có 92% tế bào từ sinh khối khô bị phá vỡ Từ kết nghiên cứu này, thí nghiệm sau, sử dụng bi thủy tinh để phá vỡ tế bào từ sinh khối tơi Nghiên cứu ảnh hởng dung môi tới trình tách chiết a-xta-xan-tin A-xta-xan-tin hợp chất dễ bị oxy hoá bị phá huỷ nhiệt độ cao Bên cạnh đó, Hình Tế bào P rhodozyma NT5 sau 30 phút bị phá vỡ bi thủy tinh hợp chất nhạy cảm với axit bazơ Vì vậy, để ngăn ngừa tác nhân ảnh hởng đến a-xta-xan-tin, trình tách chiết phải đợc thực nhiệt độ thấp thiết phải bổ sung vào dung môi tách chiết chất chống oxi hoá nh: butyl hydroxytoluen (BHT), butyl hydroxyanisol (BHA).… Trong thÝ nghiƯm nµy, trình tách chiết axta-xan-tin đợc thực 20C A-xta-xan-tin đợc tách chiết trực tiếp dung môi: cồn tuyệt đối, cồn 90 + n: he-xan, a-xê-tôn, a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ (PE) nh đ nêu phần phơng pháp Kết đợc thể bảng Bảng ảnh hởng loại dung môi tới trình xác định hàm lợng a-xta-xan-tin từ sinh khối tơi nấm men P rhodozyma NT5 Dung môi Cồn tuyệt đối Cồn 90 + n: he-xan A-xê-tôn A-xê-tôn + PE Hàm lợng a-xta-xan-tin (à àg/g) tính theo TLT 29,74 72,5 74,1 81,75 Hàm lợng a-xta-xan-tin (à àg/g) tính theo TLK 118,96 290,00 296,40 327,00 Ghi chó: TLT träng lợng tơi; TLK trọng lợng khô Bảng cho thấy: sử dụng dung môi a-xêtôn + PE cho hàm lợng a-xta-xan-tin cao nhất, đạt 327,0 àg/g trọng lợng khô Sử dụng dung môi a-xê-tôn, cồn 90 + n: hexane để tách chiết a-xta-xan-tin cho hàm lợng thấp (290296,4 àg/g) Hàm lợng a-xta-xan-tin sinh khối nấm men thấp sử dụng dung môi tách chiết cồn tuyệt đối (118,96 àg/g) Kết hoàn toàn phù hợp với lý thuyết a-xê-tôn có độ phân cực thấp ê-ta-nol Do đó, a-xê-tôn thích hợp cho việc chiết phân tử a-xtaxan-tin phân cực [3] Đồng thời, từ kết nghiên cứu cho thấy hàm lợng a-xta-xan-tin chủng nấm 85 men P rhodozyma NT5 gần với hàm lợng a-xta-xan-tin (303,3 àg/g) chủng nấm men hoang dại P rhodozyma ATCC24202 lên men mẻ (Pulsed fed batch fermentation) nghiªn cøu cđa Danilo Gomes Moriel et al., 2005 [9] thấp hàm lợng a-xta-xan-tin sinh khối chủng vi khuẩn cổ a mặn Halobacterium sp BCC 12460 phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống Thái Lan (555 àg/g) [10] Hàm lợng a-xta-xan-tin sinh khối chđng nÊm men P rhodozyma NT5 cao h¬n rÊt nhiỊu so với hàm lợng a-xta-xan-tin (59,4 àg/g) tách chiết đợc từ phế liệu vỏ tôm tơi nghiên cứu Hoàng Thị Huệ An (2002) [6] Mô tả quy trình xác định hàm lợng axta-xan-tin từ chủng nấm men P rhodozyma NT5 Cân xác 0,7 g sinh khối tơi cho vào ống Hatch 10 ml Thêm 2ml a-xê-tôn (có chứa 200 mg BHT/lít), đậy kín, lắc 30 phút Tách lấy dịch chiết a-xê-tôn B lại đợc chiết thêm lần với a-xê-tôn sau chiết thêm lần với ê-te dầu mỏ (PE) B chiết lúc gần nh không màu Gộp tất dịch chiết axê-tôn PE lại, cho vào ống ly tâm, thêm nớc cất vào, lắc Sau ly tâm 3000 vòng/phút phút 4C Tách lấy pha PE Lớp a-xê-tôn dới lại tiếp tục chiết 1-2 lần PE dịch chiết không màu Gộp tất dịch chiết PE lại rửa lần nớc cất Sau đó, dịch chiết PE đợc cho vào bình sẫm màu, lắc kỹ với Na2SO4 khan để hút hết nớc lại Thu toàn dịch chiết axta-xan-tin đ đợc hoà tan PE định lợng đến thể tích xác (D ml) - Đo độ hấp thụ (A) dung dịch thu đợc máy quang phỉ UV-VIS víi b−íc sãng 467 nm, cuvette cm (dung dịch đối chứng ê-te dầu mỏ) - Hàm lợng a-xta-xan-tin tổng số mẫu đợc tính theo công thøc cña KellyHarmon (1972) [7, 8]: A.D.104 Y = 1% E1cm d G Ghi chú: Y àg/g a-xta-xan-tin/g trọng lợng tơi; A độ hấp thụ dung dịch 467 nm; D thÓ tÝch pha lo ng (ml); G träng lợng tơi sinh khối nấm men (gram); d bề dày cuvette (d = cm); E hệ số tắt a-xta-xan-tin (tức độ hấp thụ dung dịch axta-xan-tin 1% víi cuvette cm) dung m«i PE Chđng nÊm men Phaffia rhodozyma NT5 sau ngày nu«i ë 22°C, lóc 200v/ph Ly t©m 5000v/ph Thu sinh khối tơi Chiết xuất a-xta-xan-tin - a-xê-tôn chứa 200 mg BHT - Nhiệt độ 20C - PE, Na2SO4 Dịch chứa a-xta-xan-tin Xác định độ hấp thụ a-xtaxan-tin máy quang phổ UV-VIS Hình Quy trình tách chiết a-xta-xan-tin tõ sinh khèi nÊm men P rhodozyma NT5 86 III Kết luận Nuôi cấy lắc chủng nấm men P rhodozyma NT5 môi trờng dịch thể chứa 2% đờng kính, pH = 5; tỷ lệ giống ban đầu 4%, nhiệt độ 22oC cho sinh khối khô hàm lợng a-xta-xan-tin tế bào cao sau 120 nuôi cấy Phơng pháp học phá vỡ tế bào b»ng nghiỊn víi bi thđy tinh cho kÕt qu¶ cao so với phơng pháp nghiền với cát thuỷ tinh Phơng pháp đơn giản, dễ áp dụng Phơng pháp phá vỡ tế bào chủng nấm men P rhodozyma NT5 tõ sinh khèi t−¬i b»ng bi thủ tinh cho hiệu xuất cao từ sinh khối khô Dung môi a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ cho hàm lợng a-xta-xan-tin hiệu tách chiết cao Đ đa qui trình tách chiết a-xta-xantin từ sinh khối chđng nÊm men P rhodozyma NT5 cho hiƯu xt cao Tài liệu tham khảo http://aqsc.com/astax.html Andrewes A G and Starr M P., 1976: Phytochemistry, No 15: 1009-1012 Schiedt K and Liaaen-Jensen S., 1995: Carotenoids, Vol I A: Isolation and Analysis., Birkhauser Verlag Basel, Switzerland, 81-108 http://www.nal.usda.gov/bic/Biotech_Patent s/1994patents/05356810.html Johnson E A and Lewis M J., 1979: J Gen Microbiol., 115: 173-183 Hoàng Thị Huệ An, 2002: Bớc đầu nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm Luận văn Thạc sỹ Hóa học Meyers S P and Thibodeaux P., 1983: J Aquariculture & Aquatic Sciences, Vol III, No 4, 64-70 Kelly C E and Harmon A W., 1972: Fish Bull, 70: 111-113 Danilo Gomes Moriel et al., 2005: ISSN 1516-8913 printed in Brazil, 48(3): 397-401 10 Thithiwat B May et al., 2004: J Aquariculture & Aquatic Sciences, II 5: 4552 Determination of the pigment carotenoid astaxanthin content in the cells of the yeast strain Phaffia rhodozyma NT5 used as additive foods in aquaculture Tong Kim Thuan, Tran Thanh Thuy Summary Astaxanthin is the main carotenoid pigment found in aquatic animals salmonid, sea breams and shrimps cannot synthesize astaxanthin, therefore, dietary astaxanthin is the only source of body astaxanthin The yeast P rhodozyma is one of the new natural astaxanthin sources of biomass product of the Phaffia yeast is used as a color additive in aquaculture feeds to increase pink color of salmonid flesh The culture conditions, the astaxanthin content of the yeast P rhodozyma NT5 isolated from Vietnam and the influence of astaxanthin extracting methods were studied The results showed that: The growth of the yeast strain P rhodozyma NT5 in shaked flasks under cultural conditions (concentration of sucrose 2%, pH = 5; temperature 220C ) reached its maximum value after 120 hours (11.42 g/l) The astaxanthin pigment formation began at 24 hours (33.32 µg/g) and the yield of the astaxanthin pigment reached its highest level (285.4 µg/g) after 120 hours The cell mass were not significantly different from day to day 87 The mechanical method of the cell wall rupture with glass balls having a diameter of 2mm showed the best results After 30 minutes, 92% of yeast cells were ruptured compared with 75% ones by glass powders The rupture of the fresh cell walls gave better result (100% compared with 92% of dry cells) The extract of the pigment astaxanthin from fresh yeast mass with acetone + petroleum ether (PE) gave the highest effect; the astaxanthin content reached 327 µg/g dry mater At the time, astaxanthin content extracted with acetone or ethanol reached only 296.4 µg/g and 118.96 µg/g, respectively Ngµy nhËn bµi: 5-10-2006 88 ... thấy hàm l−ỵng a-xta-xan-tin cđa chđng nÊm 85 men P rhodozyma NT5 gần với hàm lợng a-xta-xan-tin (303,3 àg/g) chủng nấm men hoang dại P rhodozyma ATCC24202 lên men mẻ (Pulsed fed batch fermentation)... vi quan sát số tế bào bị phá vỡ + Phá vỡ tế bào áp lực: tế bào nấm men đợc phá vỡ áp lực 30.000 psi máy phá tế bào Cứ sau phút lại lÊy mÉu soi d−íi kÝnh hiĨn vi vµ quan sát số tế bào bị phá vỡ... H×nh Tế bào P rhodozyma NT5 trớc bị phá vỡ b»ng bi thđy tinh Tõ kÕt qu¶ ë b¶ng hình 1, cho thấy: hiệu phá vỡ tế bào từ sinh khối tơi nấm men tốt sinh khối khô nhiều Chỉ sau 30 phút, toàn tế bào