rhodozyma is one of the new natural astaxanthin sources of biomass product of the Phaffia yeast is used as a color additive in aquaculture feeds to increase pink color of salmonid fles[r]
(1)82
29(1): 82-88 T¹p chÝ Sinh häc 3-2007
Xác định hàm l−ợng sắc tố a-xta-xan-tin tế bào của chủng nấm men Phaffia rhodozyma NT5 c s dng
làm thức ăn bổ sung nuôi trồng thuỷ sản
Tống Kim Thuần, Trần Thanh Thủy Viện Công nghệ sinh häc
A-xta-xan-tin có nhiều chức sinh học sinh vật: khả chống oxy hóa, chống ung th−… Ngồi ra, hợp chất cịn có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp ni trồng thuỷ sản Nếu thiếu a-xta-xan-tin, sản l−ợng độ sống sót cá động vật giáp xác ni trang trại giảm đáng kể Hơn nữa, đặc tính tạo màu a-xta-xan-tincịn làm cho thịt cá hồi vỏ động vật giáp xác có màu đỏ hồng Màu đỏ hồng thuộc tính cảm quan, liên quan chặt chẽ tới chất l−ợng giá trị sản phẩm Cá hồi động vật giáp xác không tự tổng hợp đ−ợc a-xta-xan-tin mà chúng phải lấy a-xta-xan-tin từ nguồn thức ăn [1]
Hiện nay, Phaffia rhodozyma loài nấm men đ−ợc biết đến có khả sinh chất màu a-xta-xan-tin[2] Theo lý thuyết, loài nấm men P rhodozyma sinh số carotenoit, a-xta-xan-tinchiếm tới 83-87%, β-caroten 2-2,5%, echinenon 2-4% phoenicoxanthin 5-7% Tuy nhiên, thực tế tỷ lệ a-xta-xan-tin chiếm khoảng 50-80% tổng số l−ợng carotenoit tế bào A-xta-xan-tin đ−ợc tổng hợp bên tế bào nấm men Vì vậy, để tách chiết a-xta-xan-tincần phải phá vỡ tế bào, sau dùng dung môi hữu khác để tách chiết A-xta-xan-tinphân cực nên tan n−ớc, nh−ng dễ tan dung mơi hữu có độ phân cực thấp hay trung bình nh−: clơ-rơ-phc, a-xtơn, mta-nol, ê-tyl a-xê-tát, ê-ta-nol, đi-ê-ê-tyl ê-te, he-xan, ê-te dầu mỏ… Để tách chiết a-xta-xan-tin từ mẫu sinh khối t−ơi, ng−ời ta th−ờng dùng dung mơi có khả trộn lẫn với n−ớc nh−: a-xê-tôn, mê-ta-nol ê-ta-nol … Các dung mơi vừa có tác dụng làm khan mẫu, vừa hịa tan a-xta-xan-tin Dịch chiết sau đ−ợc chuyển sang dung môi không trộn lẫn với n−ớc nh−
he-xan ê-te dầu mỏ để loại bỏ tạp chất tan n−ớc Sau đó, cho bay dung môi để cô đặc dịch chiết xác định hàm l−ợng xan-tin có mẫu [3, 4] Hàm l−ợng a-xta-xan-tin chủng nấm men P rhodozyma khác khác nhau; phụ thuộc vào chủng giống, điều kiện nuôi cấy, ph−ơng pháp tách chiết dung môi sử dụng Để xác định đ−ợc xác hàm l−ợng a-xta-xan-tin sinh khối nấm men P rhodozyma chúng tiến hành nghiên cứu lựa chọn dung môi ph−ơng pháp tách chiết a-xta-xan-tin phù hợp với iu kin ca Vit Nam
I Phơng pháp nghiªn cøu 1. Nguyªn liƯu
Chđng nÊm men P rhodozyma NT5 đợc phân lập Việt Nam, đợc lu giữ Bộ su tập chủng giống vi sinh vật Phòng Các chất hoạt tính sinh häc tõ vi sinh vËt, ViƯn C«ng nghƯ sinh häc
2 Phơng pháp
a Môi trờng nuôi cấy
Chủng nấm men P rhodozyma NT5 đợc nuôi cấy môi trờng Phaffia [2, 5] cải tiến bao gåm (g/l): ®−êng kÝnh: 20; cao nÊm men: 2; (NH4)2SO4: 2; KH2PO4: 1; MgCl2.6H2O: 0,5; CaCl2.2H2O: 0,1; n−íc cÊt: 1000 ml; pH = chØnh b»ng H2SO4 vµ NH4OH, dịch giống ban đầu 4%
b Nu«i cÊy
(2)83 c Xác định trọng l−ợng khô
Bằng ph−ơng pháp xấy 105oC đến trọng l−ợng không đổi
d Tách chiết phân tích hàm lợng a-xta-xan-tin
- Phá vỡ tế bào:
+ Phỏ v t bào cát thủy tinh: cân 0,1 g sinh khối khô 0,7 g sinh khối t−ơi + g cát thủy tinh Trộn nghiền cối sứ Cứ sau phút lại lấy mẫu soi kính quan sát số l−ợng tế bào bị phá vỡ
+ Phá vỡ tế bào bi thủy tinh: cân 0,1 g sinh khối khô 0,7 g sinh khối t−ơi + g bi thủy tinh có đ−ờng kính 0,2 cm Trộn lắc máy Vortex Cứ sau phút lại lấy mẫu soi d−ới kính hiển vi quan sát số tế bo b phỏ v
+ Phá vỡ tế bào áp lực: tế bào nấm men đợc phá vỡ áp lực 30.000 psi máy phá tế bào Cứ sau phút lại lấy mẫu soi dới kính hiển vi quan sát số tế bào bị phá vỡ
- Tách chiết a-xta-xan-tin: A-xta-xan-tin đợc tách chiết trực tiếp từ 0,7 g sinh khối t−¬i
của nấm men đv đ−ợc phá vỡ thành tế bào dung môi khác nhau: a-xê-tôn, cồn tuyệt đối, cồn 90° + n: he-xan, a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ (PE) theo ph−ơng pháp đv đ−ợc cấp phát minh sáng chế (patent) công nghệ sinh học (1994) [4], ph−ơng pháp Johnson M J (1979) [5] Kelly C E - Harmon A W (1972) [8]
- Xác định hàm l−ợng a-xta-xan-tin: ph−ơng pháp đo độ hấp thụ A máy quang phổ UV-VIS (Spectrophotometer) [7,8] hàm l−ợng a-xta-xan-tinđ−ợc tính theo cụng thc ca Kelly-Harmon 1972 [8]
II.Kết thảo luận
1. Nghiên cứu khả sinh trởng sinh tổng hợp a-xta-xan-tin chủng nấm
men P rhodozyma NT5
Chủng nấm men NT5 đ−ợc ni cấy bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml mơi tr−ờng, lắc 200 vịng/phút nhiệt độ 22°C Tỷ lệ tiếp giống ban đầu 4% Lấy mẫu để xác định khả sinh tr−ởng sinh tổng hợp a-xta-xan-tin sau 0, 16, 24, 42, 72, 96 120 ni cấy
B¶ng
Khả sinh trởng sinh tổng hỵp a-xta-xan-tin cđa chđng nÊm men P rhodozyma NT5 Thêi
gian (h)
Sinh khèi tơi (g/l)
Sinh khối khô (g/l)
§é hÊp thơ a-xta-xan-tin (467 nm)
Hàm lợng a-xta-xan-tin (àg/g SKK)
0 KXĐ KXĐ KX§ KX§
16 26,2 6,55 KX§ KX§
24 41,6 10,37 0,082 33,32
42 42,6 10,4 0,139 125,2
72 43,6 10,9 0,182 172,3
96 44,6 11,15 0,244 225,8
120 45,7 11,42 0,386 296,4
Ghi chú: tách chiết a-xta-xan-tinbằng dung môi a-xê-tôn; KXĐ không xác định; SKK sinh khối khô Từ bảng cho thấy sinh khối nấm men tăng
mạnh từ đến 24 ni cấy, sau tăng chậm dần từ 42 đến 96 đạt cực đại sau 120 (11,42 g/l) Hàm l−ợng a-xta-xan-tin cũngtăng theo thời gian đạt cực đại sau 120 nuôi cấy (296,4 àg/g sinh khối khô) 2. Nghiên cứu khả phá vỡ tế bào
chñng nÊm men P rhodozyma NT5 Hiện nay, có nhiều phơng pháp phá vỡ
(3)84
Bảng
Khả phá vỡ tế bào khô chủng nấm men P rhodozyma NT5 bằng phơng pháp học
Số tế bào bị phá vỡ (%) Thời gian phá vỡ
tế bào (phút) C¸t thđy tinh Bi thđy tinh M¸y ph¸ ¸p lùc
0 0
5 15 20 28
10 20 27 35
15 35 50 80
20 50 70 100
25 60 83 100
30 75 92 100
35 78 93 100
40 84 95 100
45 85 100 100
Kết bảng cho thấy: phá vỡ tế bào máy áp lực cao cho kết tốt Chỉ sau 20 phút, số l−ợng tế bào bị phá vỡ hoàn toàn đạt tới 100% Trong đó, phá vỡ tế bào bi thủy tinh, kết đạt đ−ợc sau 45 phút Phá vỡ tế bào cát thuỷ tinh cho kết thấp (sau 45 phút, có 85% tế bào bị phá vỡ) Dùng ph−ơng pháp phá vỡ tế bào máy phá áp lực cho kết cao, tốn thời gian ph−ơng pháp cịn lại nh−ng chúng tơi khơng thể chọn ph−ơng pháp cho thí nghiệm tiếp sau đ−ợc ph−ơng pháp phá vỡ tế bào áp lực thao tác phức tạp phá vỡ l−ợng sinh khối nấm men lớn Do đó, thí nghiệm chúng
tơi sử dụng ph−ơng pháp phá tế bào bi thủy tinh Ph−ơng pháp tiến hành vừa đơn giản lại cho hiệu không so với ph−ơng pháp phá vỡ tế bào máy phá áp lực Nh−ng ph−ơng pháp phá tế bào bi thủy tinh lại nhiều thời gian Do đó, chúng tơi cần phải nghiên cứu để rút ngắn thời gian lại Để rút ngắn thời gian phá vỡ thành tế bào nâng cao hiệu xuất tế bào bị phá vỡ từ l−ợng sinh khối nh− nhau, tiến hành nghiên cứu khả phá vỡ tế bào từ nguồn nguyên liệu sinh khối nấm men khô sinh khối t−ơi bi thuỷ tinh Kết thể bảng đ−ợc minh hoạ hình 1,
Bảng
Khả phá vỡ tÕ bµo nÊm men P rhodozyma NT5 tõ sinh khèi khô tơi bằng phơng pháp nghiền với bi thuỷ tinh
Số tế bào bị phá vỡ (%) Thời gian phá vỡ
tế bào (phút) Sinh khối khô Sinh khối tơi
0 0
5 20 26
10 27 50
15 50 67
20 70 80
25 83 93
30 92 100
40 95 100
(4)85 H×nh TÕ bào P rhodozyma NT5 trớc bị
phá vỡ bi thủy tinh
Hình Tế bào P rhodozyma NT5 sau 30 phút bị phá vỡ bi thủy tinh Từ kết bảng h×nh 1, cho
thấy: hiệu phá vỡ tế bào từ sinh khối t−ơi nấm men tốt sinh khối khô nhiều Chỉ sau 30 phút, toàn tế bào từ sinh khối t−ơi hầu nh− đv bị phá vỡ hồn tồn Trong đó, có 92% tế bào từ sinh khối khơ bị phá vỡ Từ kết nghiên cứu này, thí nghiệm sau, chúng tơi sử dụng bi thủy tinh để phá vỡ tế bào từ sinh khối t−ơi
3. Nghiên cứu ảnh h−ởng dung môi tới trình tách chiết a-xta-xan-tin A-xta-xan-tinlà hợp chất dễ bị oxy hoá bị phá huỷ nhiệt độ cao Bên cạnh đó,
hợp chất nhạy cảm với axit bazơ Vì vậy, để ngăn ngừa tác nhân ảnh h−ởng đến a-xta-xan-tin, trình tách chiết phải đ−ợc thực nhiệt độ thấp thiết phải bổ sung vào dung mơi tách chiết chất chống oxi hố nh−: butyl hydroxytoluen (BHT), butyl hydroxyanisol (BHA).…
Trong thí nghiệm này, trình tách chiết a-xta-xan-tinđ−ợc thực 20°C A-xta-xan-tin đ−ợc tách chiết trực tiếp dung môi: cồn tuyệt đối, cồn 90° + n: he-xan, a-xê-tôn, a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ (PE) nh− đv nêu phần ph−ơng pháp Kết đ−ợc thể bảng
Bảng ảnh h−ởng loại dung mơi tới q trình xác định hàm l−ợng
a-xta-xan-tin tõ sinh khèi t−¬i cđa nÊm men P rhodozyma NT5 Dung môi Hàm lợng a-xta-xan-tin
(ààààg/g) tính theo TLT
Hàm lợng a-xta-xan-tin (µµµµg/g) tÝnh theo TLK
Cồn tuyệt đối 29,74 118,96
Cån 90° + n: he-xan 72,5 290,00
A-xê-tôn 74,1 296,40
A-xê-tôn + PE 81,75 327,00
Ghi chú: TLT trọng l−ợng t−ơi; TLK trọng l−ợng khô Bảng cho thấy: sử dụng dung môi a-xê-tôn + PE cho hàm l−ợng a-xta-xan-tin cao nhất, đạt 327,0 àg/g trọng l−ợng khô Sử dụng dung môi a-xê-tôn, cồn 90° + n: hexane để tách chiết a-xta-xan-tin cho hàm l−ợng thấp (290-296,4 àg/g) Hàm l−ợng a-xta-xan-tin sinh khối nấm men thấp sử dụng dung môi
tách chiết cồn tuyệt đối (118,96 àg/g) Kết hoàn toàn phù hợp với lý thuyết a-xê-tơn có độ phân cực thấp ê-ta-nol Do đó, a-xê-tơn thích hợp cho việc chiết phân tử a-xta-xan-tin phân cực [3]
(5)86
men P rhodozyma NT5 gần với hàm l−ợng a-xta-xan-tin(303,3 àg/g) chủng nấm men hoang dại P rhodozyma ATCC24202 lên men mẻ (Pulsed fed batch fermentation) nghiên cứu Danilo Gomes Moriel et al., 2005 [9] thấp hàm l−ợng a-xta-xan-tin sinh khối chủng vi khuẩn cổ −a mặn Halobacterium sp BCC 12460 phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống Thái Lan (555 àg/g) [10] Hàm l−ợng a-xta-xan-tin sinh khối chủng nấm men P rhodozyma NT5 cao nhiều so với hàm l−ợng a-xta-xan-tin (59,4 àg/g) tách chiết đ−ợc từ phế liệu vỏ tôm t−ơi nghiên cứu Hoàng Thị Huệ An (2002) [6] 4. Mơ tả quy trình xác định hàm l−ợng
a-xta-xan-tin tõ chñng nÊm men P
rhodozyma NT5
Cân xác 0,7 g sinh khối t−ơi cho vào ống Hatch 10 ml Thêm 2ml a-xê-tôn (có chứa 200 mg BHT/lít), đậy kín, lắc 30 phút Tách lấy dịch chiết a-xê-tơn Bv cịn lại đ−ợc chiết thêm lần với a-xê-tôn sau chiết thêm lần với ê-te dầu mỏ (PE) Bv chiết lúc gần nh− không màu Gộp tất dịch chiết a-xê-tôn PE lại, cho vào ống ly tâm, thêm n−ớc cất vào, lắc Sau ly tâm 3000 vòng/phút
trong phút 4°C Tách lấy pha PE Lớp a-xê-tôn d−ới lại tiếp tục chiết 1-2 lần PE dịch chiết không màu Gộp tất dịch chiết PE lại rửa lần n−ớc cất Sau đó, dịch chiết PE đ−ợc cho vào bình sẫm màu, lắc kỹ với Na2SO4 khan để hút hết n−ớc cịn lại Thu tồn dịch chiết a-xta-xan-tin đv đ−ợc hoà tan PE định l−ợng đến thể tích xác (D ml)
- Đo độ hấp thụ (A) dung dịch thu đ−ợc máy quang phổ UV-VIS với b−ớc sóng 467 nm, cuvette cm (dung dịch đối chứng ê-te dầu mỏ)
- Hàm lợng a-xta-xan-tin tổng số mẫu đợc tÝnh theo c«ng thøc cđa Kelly-Harmon (1972) [7, 8]:
G d E
D A Y
cm. .
10 . .
% 1
4
=
Ghi chú: Y àg/g a-xta-xan-tin/g trọng l−ợng t−ơi; A độ hấp thụ dung dịch 467 nm; D thể tích pha lovng (ml); G trọng l−ợng t−ơi sinh khối nấm men (gram); d bề dày cuvette (d = cm); E hệ số tắt xtxan-tin (tức độ hấp thụ dung dịch a-xta-xan-tin 1% với cuvette cm) dung mơi PE
H×nh 3. Quy trình tách chiết a-xta-xan-tintừ sinh khối nấm men P rhodozyma NT5 Chñng nÊm men Phaffia rhodozyma NT5 sau
ngày nu«i ë 22°C, lóc 200v/ph
Thu sinh khối tơi
Ly tâm 5000v/ph phút
Chiết xuất a-xta-xan-tin - Nhiệt độ 20- a-xê-tôn chứa 200 mg BHT °C - PE, Na2SO4
DÞch chøa a-xta-xan-tin
Xác định độ hấp thụ a-xta-xan-tin máy quang
(6)87 III KÕt luËn
1 Nuôi cấy lắc chủng nấm men P rhodozyma NT5 môi tr−ờng dịch thể chứa 2% đ−ờng kính, pH = 5; tỷ lệ giống ban đầu 4%, nhiệt độ 22oC cho sinh khối khô hàm l−ợng a-xta-xan-tin tế bào cao sau 120 nuôi cấy
2 Ph−ơng pháp học phá vỡ tế bào nghiền với bi thủy tinh cho kết cao so với ph−ơng pháp nghiền với cát thuỷ tinh Ph−ơng pháp đơn giản, dễ ỏp dng
3 Phơng pháp phá vỡ tế bào cña chñng nÊm men P rhodozyma NT5 tõ sinh khèi t−¬i b»ng bi thủ tinh cho hiƯu xt cao h¬n từ sinh khối khô
4 Dung môi a-xê-tôn + ê-te dầu mỏ cho hàm lợng a-xta-xan-tin hiệu tách chiết cao
5 Đv đa qui trình tách chiết a-xta-xan-tin từ sinh khối chủng nÊm men P rhodozyma NT5 cho hiÖu xuÊt cao
Tài liệu tham khảo
1. http://aqsc.com/astax.html
2 Andrewes A G. and Starr M P., 1976: Phytochemistry, No 15: 1009-1012
3 Schiedt K. and Liaaen-Jensen S., 1995: Carotenoids, Vol I A: Isolation and Analysis., Birkhauser Verlag Basel, Switzerland, 81-108
4 http://www.nal.usda.gov/bic/Biotech_Patent s/1994patents/05356810.html
5 Johnson E A. and Lewis M J., 1979: J Gen Microbiol., 115: 173-183
6 Hoàng Thị Huệ An, 2002: Bớc đầu nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm. Luận văn Thạc sỹ Hóa học
7 Meyers S P. and Thibodeaux P., 1983: J Aquariculture & Aquatic Sciences, Vol III, No 4, 64-70
8 Kelly C E. and Harmon A W., 1972: Fish Bull, 70: 111-113
9 Danilo Gomes Moriel et al., 2005: ISSN 1516-8913 printed in Brazil, 48(3): 397-401 10 Thithiwat B May et al., 2004: J Aquariculture & Aquatic Sciences, II 5: 45-52
Determination of the pigment carotenoid astaxanthin content in the cells of the yeast strain Phaffia rhodozyma
NT5 used as additive foods in aquaculture
Tong Kim Thuan, Tran Thanh Thuy
Summary
Astaxanthin is the main carotenoid pigment found in aquatic animals salmonid, sea breams and shrimps cannot synthesize astaxanthin, therefore, dietary astaxanthin is the only source of body astaxanthin
The yeast P rhodozyma is one of the new natural astaxanthin sources of biomass product of the Phaffia yeast is used as a color additive in aquaculture feeds to increase pink color of salmonid flesh
The culture conditions, the astaxanthin content of the yeast P rhodozyma NT5 isolated from Vietnam and the influence of astaxanthin extracting methods were studied The results showed that:
(7)88
2 The mechanical method of the cell wall rupture with glass balls having a diameter of 2mm showed the best results After 30 minutes, 92% of yeast cells were ruptured compared with 75% ones by glass powders The rupture of the fresh cell walls gave better result (100% compared with 92% of dry cells)
3 The extract of the pigment astaxanthin from fresh yeast mass with acetone + petroleum ether (PE) gave the highest effect; the astaxanthin content reached 327 µg/g dry mater At the time, astaxanthin content extracted with acetone or ethanol reached only 296.4 µg/g and 118.96 µg/g, respectively