Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ BÀO CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba) NUÔI CẤY IN VITRO Hoàng Ngọc Nhung1, Nguyễn Thị Quỳnh1*, Nguyễn Vũ Ngọc Anh1, Nguyễn Lê Anh Thư1, Toyoki Kozai2 (1) Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com (2) Trường đại học Chiba, Nhật Bản TÓM TẮT: Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao loài đương quy khác thuộc chi Angelica Bộ rễ sử dụng lâu đời việc chữa bệnh nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền nhiều nước châu Á Trong nghiên cứu này, phát sinh quan đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào chồi từ nuôi cấy phiến thực Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro ni cấy mơi trường MS có bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l) Số chồi lớn (8,9 chồi/mẫu) xuất phát từ lớp mỏng chồi ni cấy mơi trường có 0,1 mg/l NAA mg/l TDZ Khi thay vitamin Morel vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt Phiến đương quy Nhật Bản in vitro chứng minh nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ bất định Trên mơi trường MS có bổ sung kinetin (0 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến mở thứ (tính từ ngọn) ni cấy điều kiện tối có đáp ứng tạo rễ khác biệt Sự thay đổi thành phần khoáng vitamin ảnh hưởng rõ rệt đến hình thành rễ Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi khô rễ lớn phiến ni mơi trường khống Gamborg B5, vitamin Gamborg B5 Từ khóa: Angelica acutiloba, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, phát sinh quan, rễ bất định MỞ ĐẦU Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), loài thân thảo lớn, có chiều cao trung bình 40-80 cm, du nhập vào Việt Nam từ năm 1996 trồng tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội Rễ đương quy năm tuổi đào vào mùa thu, sấy than, cắt thành lát mỏng dùng làm thuốc Những non ăn sống làm trà tươi uống Trong y học cổ truyền Trung Quốc, đương quy thuốc đầu vị, dùng phổ biến thuốc chữa bệnh phụ nữ, thiếu máu, suy nhược thể, đồng thời định nhiều đơn thuốc bổ dựa vào hợp chất ligustilide, butylidenephthalide acid ferulic Các polysaccharide có mặt rễ đương quy Nhật Bản có khả kích thích hệ thống miễn dịch thể [6] Trong dân gian, đương quy thường trồng hạt, nhiên, hạt thu vào thời gian định năm, thường vào năm thứ sau trồng, sức nảy mầm giảm nhanh chóng sau thời gian ngắn Do nhu cầu giống ngày tăng, đồng thời đòi hỏi việc ni 196 trồng phải đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt, bảo đảm tính ổn định chất lượng hợp chất thứ cấp có cây, phương pháp ni cấy mô tế bào thực vật phương pháp nhân giống hữu hiệu để tạo lượng lớn đương quy đồng nhất, bệnh thời gian định không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết Trong này, chúng tơi trình bày kết tạo chồi rễ bất định từ nuôi cấy lớp mỏng chồi phiến đương quy Nhật Bản in vitro ảnh hưởng thành phần hóa học số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) bổ sung môi trường nuôi cấy, nhằm hướng đến việc xây dựng hệ thống nhân chồi rễ in vitro hữu hiệu để phục vụ cho nhu cầu dược liệu nước PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chồi in vitro phiến đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) lấy từ mầm phát triển từ hạt nuôi cấy môi trường MS [9] Ngoc Nhung Hoang et al Môi trường nuôi cấy in vitro Mơi trường khống MS khống Gamborg B5 [3], có bổ sung vitamin Morel Gamborg B5, 30 g/l đường sucrose (cơng ty Đường Biên Hòa), 7,3 g/l agar (công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long) pH môi trường trước khử trùng 5,8 Môi trường khử trùng nhiệt độ 121oC, atm 20 phút Các thí nghiệm lặp lại lần, thời gian thí nghiệm tuần (42 ngày) Phương pháp Ảnh hưởng NAA TDZ lên tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản Chồi (đã loại bỏ hết lá) cắt ngang thành lớp mỏng (chiều dày khoảng mm) đặt vào môi trường MS, vitamin Morel, bổ sung 30 g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, chất ĐHSTTV NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) TDZ (0,1; 0,5; mg/l) Thí nghiệm gồm cơng thức, cơng thức bình (V = 130 ml), bình có chồi cắt thành lớp chứa 20 ml mơi trường Thí nghiệm đặt tủ vi khí hậu (cơng ty Sanyo, Japan) cường độ ánh sáng 50 µmol m-2 s-1 (30 µmol m-2 s-1 tuần đầu), thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ ni cấy 25oC Thí nghiệm lặp lại lần Chỉ tiêu theo dõi số chồi/mẫu hình thành theo thời gian ni cấy (chồi ≥ mm) Vai trò vitamin, nước dừa adenine lên tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi Chồi sau loại bỏ cắt ngang thành lớp mỏng (chiều dày khoảng mm) đặt vào mơi trường thí nghiệm với thành phần khống đa lượng MS, vi lượng MS, bổ sung 30 g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, 0,1 mg/l NAA mg/l TDZ Thí nghiệm bố trí với cơng thức nhằm khảo sát ảnh hưởng vitamin Morel vitamin Gamborg B5 môi trường nuôi cấy lớp mỏng, bổ sung nước dừa (10%, v/v), khơng có bổ sung adenine sulphate (40 mg/l) Mỗi cơng thức có bình (V = 130 ml), bình có chồi cắt thành lớp chứa 20 ml mơi trường Thí nghiệm lặp lại lần Điều kiện nuôi cấy tiêu theo dõi kế thừa từ thí nghiệm Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tạo rễ từ phiến đương quy Nhật Bản in vitro Mẫu cấy phiến mở thứ từ chồi in vitro đương quy Nhật Bản, mẫu rạch đường ngẫu nhiên để tạo vết thương Mẫu ni cấy mơi trường khống MS, vitamin Morel, có bổ sung NAA IBA nồng độ 4, 6, 8, 10, 12 mg/l kinetin nồng độ mg/l Mỗi công thức có bình (V = 130 ml), bình có mẫu chứa 20 ml môi trường Mẫu nuôi cấy đặt hồn tồn tối, nhiệt độ phòng ni 25oC Thí nghiệm lặp lại lần Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo tạo rễ xác định sau 42 ngày nuôi cấy Ảnh hưởng loại mơi trường khống vitamin lên tạo rễ từ phiến đương quy Nhật Bản in vitro Phiến ni cấy mơi trường khống MS Gamborg B5, vitamin Morel Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l NAA Mỗi cơng thức có bình (V = 130 ml), bình có mẫu chứa 20 ml môi trường Điều kiện nuôi cấy thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại lần Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi, trọng lương khô rễ xác định ngày thứ 42 Các số liệu phân tích thống kê phần mềm MSTATC phiên 2.10 Đại học bang Michigan, Mỹ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng NAA TDZ lên tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản Số lượng chồi hình thành tăng dần cơng thức theo thời gian nuôi cấy (bảng 1) Ảnh hưởng NAA nồng độ thấp (0,1 mg/l) hay cao (0,2 mg/l) lên tạo chồi mẫu ban đầu chưa rõ rệt so với mẫu nuôi cấy môi trường NAA, cho dù nồng độ TDZ cao (1 mg/l) hay thấp (0,1 mg/l) Tuy nhiên, việc bổ sung 0,1 mg/l NAA mg/l TDZ (công thức L6) vào mơi trường kích thích mẫu cấy lớp mỏng chồi làm gia tăng số chồi hình thành/mẫu cấy so với công thức khác sau tuần ni cấy (bảng 1) 197 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 Bảng Ảnh hưởng NAA TDZ lên hình thành chồi đương quy Nhật Bản theo thời gian ni cấy Cơng thức thí nghiệm NAA (mg/l) TDZ (mg/l) 0,1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,5 0,1 0,2 0,1 0,2 0,5 0,2 Ký hiệu L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 ANOVAy Nồng độ NAA (A) Nồng độ TDZ (B) A×B CV (%) Tuần 1,4 bcx 1,4 bc 0,9 c 1,4 bc 1,6 d 4,1 a 1,1 bc 0,9 c 1,4 bc ** ** ** 14,28 Số chồi (chồi/mẫu cấy) Tuần Tuần 1,7 e 2,2 f 2,7 d 3,9 cd 1,4 e 2,0 f 3,3 bc 4,3 c 2,1 de 4,3 c 6,3 a 8,9 a 1,7 e 3,2 e 2,7 cd 3,7 de 3,4 b 7,8 b ** ** ** 10,28 ** ** ** 5,86 y **: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test Sau tuần, số chồi hình thành cơng thức tiếp tục gia tăng khác biệt trở nên có ý nghĩa (bảng 1) Số lượng chồi cao công thức L6 (8,9 chồi/mẫu) thấp cơng thức L3 (1 mg/l TDZ khơng có NAA) (hình 1) Ngồi ra, chồi xuất tập trung lớp mỏng tính từ không thấy xuất lớp mỏng thứ Hình Cụm chồi đương quy Nhật sau tuần nuôi cấy (ký hiệu tên nghiệm thức theo bảng 1) 198 Ngoc Nhung Hoang et al TDZ biết đến cytokinin loại phenylurea sử dụng thay cho BA nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật thời gian gần Sự có mặt TDZ mơi trường, nồng độ thấp vừa phải, thúc đẩy sinh tổng hợp cytokinin nội sinh mô thực vật ni cấy [7] Bên cạnh đó, tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò quan trọng phát sinh hình thái quan ni cấy mơ tế bào thực vật Vì vậy, vắng mặt NAA mơi trường ni cấy gây nên cân tỷ lệ auxin cytokinin, dẫn đến dư thừa cytokinin tạo phản ứng ngược lên sinh tổng hợp cytokinin tế bào Tỷ lệ 1:10 0,1 mg/l NAA mg/l TDZ có lẽ đạt cân phù hợp cho hình thành chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi đương quy Vai trò vitamin, nước dừa adenine lên tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi Ảnh hưởng loại vitamin, nước dừa adenine lên tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng đương quy diễn chậm Số chồi hình thành cơng thức khơng có khác biệt mặt thống kê sau tuần nuôi cấy Tuy nhiên, tuần nuôi cấy thứ 4, thay đổi loại vitamin bổ sung thêm nước dừa adenine gây phản ứng khác mô nuôi cấy (bảng 2) Bảng Ảnh hưởng loại vitamin, nước dừa adenine lên hình thành chồi đương quy theo thời gian nuôi cấy Tên công thức thí nghiệm M (Vitamin Morel) MC (Vitamin Morel + 10% nước dừa) MCA (Vitamin Morel + 10% nước dừa + 40 mg/l adenine) B (Vitamin Gamborg B5 ) BC (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa) BCA (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa + 40 mg/l adenine) ANOVAy Vitamin (A) Nước dừa adenine (B) AxB CV(%) Số chồi (chồi/ mẫu cấy) Tuần Tuần Tuần 0,25 2,71 ex 9,83 d 0,08 3,67 c 10,67 c 0,42 1,92 f 7,17 f 0,13 1,08 3,42 d 6,08 b 7,96 e 14,29 b 1,21 9,88 a 16,33 a * * NS 89,5 ** ** ** 2,12 ** ** ** 0,65 y NS, *, **: không khác biệt khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 0,0; x Các số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test Khi thay vitamin Morel vitamin Gamborg B5, số chồi/mẫu gia tăng rõ rệt sau tuần nuôi cấy công thức B, BC BCA Số chồi/mẫu môi trường BC gần hai lần so với số chồi/mẫu môi trường MC (bảng 2) Ở tất công thức, sồ chồi gia tăng sau tuần nuôi cấy Số chồi/mẫu lớn thu nhận công thức BCA (16,33 chồi/mẫu) nhỏ nghiệm thức MCA (7,17 chồi/mẫu) Sự diện nước dừa làm gia tăng đáng kể số chồi/mẫu, nhiên, bổ sung thêm adenine có ảnh hưởng rõ rệt vitamin môi trường Gamborg B5 sử dụng (bảng 2) Vai trò kích thích tăng trưởng nước dừa đề cập đến nhiều cơng trình vi nhân giống lan Nước dừa có chứa nhiều loại cytokinin kinetin, trans-zeatin số chất kích thích tố sinh trưởng thực vật khác chưa định danh thuộc nhóm gibberellin auxin [13] Ngồi ra, nước dừa có vi lượng sắt vitamin, acic amin, đường đưa vào hệ thống antioxidant thể người Trong ni cấy 199 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 tạo chồi oliu, nước dừa thành công việc thay zeatin môi trường nuôi cấy giai đoạn quy trình nhân giống [11] Ảnh hưởng adenine lên tăng sinh chồi mô tả thí nghiệm mơi trường khống MS kết hợp với vitamin Gamborg B5 Nandagopal & Kumari (2006) [10] chứng minh Cichorium intybus hình thành mô sẹo tái sinh chồi đạt hiệu cao bổ sung 1,36 µM adenine vào mơi trường MS có vitamin Gamborg B5 Ảnh hưởng chất ĐHSTTV lên tạo rễ từ phiến đương quy Nhật Bản Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ cơng thức vào ngày thứ 42 có khác biệt ý nghĩa kết hợp yếu tố Khi khảo sát ảnh hưởng NAA có khơng có kết hợp với kinetin, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao mẫu nuôi cấy môi trường có NAA nồng độ 6, 8, 10 12 mg/l (bảng 3A) Khi khảo sát ảnh hưởng IBA có khơng có kết hợp với kinetin, mơi trường có hay mg/l IBA, môi trường IBA kết hợp với mg/l kinetin, nồng độ 10 hay 12 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao nghiệm thức lại (bảng 3B) Bảng (A) Ảnh hưởng NAA, kinetin (B) IBA, kinetin lên % mẫu tạo mô sẹo, % mẫu tạo rễ từ phiến đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ngày thứ 42 Tên công thứcz N4K1 N4K0 N6K1 N6K0 N8K1 N8K0 N10K1 N10K0 N12K1 N12K0 ANOVAy NAA (A) KINETIN (B) AxB CV (%) A % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ 88,89 77,78 66,67 55,56 55,56 33,33 100 77,77 83,33 72,22 33,33 cx 33,33 c 77,78 ab 66,67 ab 55,56 bc 88,89 a 0d 77,77 ab 0d 72,22 ab ** ** NS 19,61 ** ** ** 24,82 Tên công thứcz I4K1 I4K0 I6K1 I6K0 I8K1 I8K0 I10K1 I10K0 I12K1 I12K0 ANOVAy IBA (A) KINETIN (B) AxB CV (%) B % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ 77,78 ab 22,21 d 66,67 abc 66,67 abc 66,67 abc 33,33 cd 100 a 33,33 cd 53,33 bcd 44,44 bcd 55,56 abcx 55,56 abc 66,67 abc 88,89 a 33,33 c 66,67 abc 77,77 ab 33,33 c 55,56 abc 44,44 bc * ** ** 28,5 * NS ** 24,14 z N tượng trưng NAA, I tượng trưng IBA; K tượng trưng cho kinetin; số kèm với N K I nồng độ NAA IBA kinetin sử dụng nghiệm thức; y NS, *, **: không khác biệt khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,05 0,01; x Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test Các loại tế bào khác đáp ứng với chất ĐHSTTV khác Các tế bào vùng nhu mô tế bào có chức hồn chỉnh Do đó, bị thương tác động tổ hợp chất ĐHSTTV, tế bào vùng nhu mô đáp 200 ứng lại cách phản biệt hóa tạo khối mơ sẹo Tuy nhiên, mơ sẹo hình thành khối có dạng tròn, xốp, màu nâu nhạt, khả tái biệt hóa thấp Khác với tế bào vùng nhu mô, tế bào vùng tượng tầng libe-mộc Ngoc Nhung Hoang et al tế bào mô phân sinh cấp hai Vì vậy, tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tế bào khơng trải qua q trình phản biệt hóa mà hoạt hóa trực tiếp để hình thành vùng tế bào mơ phân sinh, tạo sơ khởi rễ (hình 2a) Hình Sự hình thành rễ bất định từ phiến đương quy Nhật a Sơ khởi rễ hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc (thanh ngang = 10 µm); b Rễ bất định hình thành mơi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (thanh ngang = mm) Auxin làm giảm tích lũy cytokinin ngược lại cytokinin ức chế số hoạt tính auxin [4] Chẳng hạn như, nồng độ 10 mg/l NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ 77,77% (nghiệm thức N10K0) Tuy nhiên, bổ sung mg/l kinetin, mẫu không đáp ứng tạo rễ (nghiệm thức N10K1), tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo lại tăng (bảng 3a) Yang & Chuang (1995) [12] khảo sát tạo rễ từ nuôi cấy tạo mô sẹo đương quy Trung Quốc - Angelica sinensis chứng minh, vật liệu cuống ex vitro, mô sẹo hình thành mơi trường MS có chứa 15 mg/l NAA mg/l kinetin, môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA mg/l kinetin lại thích hợp cho hình thành rễ Bên cạnh đó, loại auxin khác tác động lên mẫu cấy khác Mẫu ni cấy mơi trường có bổ sung IBA nồng độ mg/l IBA nồng độ 10 mg/l , mg/l kinetin cho kết tạo rễ cao, rễ tạo lại mảnh, ngắn so với rễ tạo từ phiến môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (hình 2b) Phản ứng khác mẫu cấy phiến hai loại auxin nhận biết tín hiệu dẫn đến đáp ứng mẫu cấy hai loại auxin khác Ảnh hưởng loại mơi trường khống vitamin lên tạo mô sẹo rễ từ phiến nuôi cấy in vitro đương quy Nhật Bản Ở ngày thứ 42, tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo tạo rễ cơng thức ni cấy có khác biệt ý nghĩa xét hai yếu tố loại mơi trường vitamin (hình 3) Hình Mơ sẹo, rễ hình thành từ phiến đương quy Nhật Bản ảnh hưởng môi trường khoáng MS, Gamborg B5 vitamin Morel, vitamin Gamborg B5 ngày thứ 42 (thanh ngang = mm) M hay B bên trái tượng trưng cho mơi trường khống MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B bên phải tượng trưng cho vitamin Morel hay Gamborg B5 201 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 Mẫu nuôi cấy môi trường khống vitamin Gamborg B5 (cơng thức BB) có tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo rễ đạt cao (100%) (bảng 4) Nghiệm thức BB có số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi khối lượng khơ cao nhất, nghiệm thức MB có số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi khối lượng khô rễ thấp (bảng 4) Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, mơi trường khống MS sử dụng phổ biến cho hầu hết loại giàu cân mặt hàm lượng khống Tuy nhiên, mơi trường Gamborg B5 sử dụng nuôi cấy tạo mô sẹo rễ số loại sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [7] Quá trình phiến tạo rễ bất định chia làm hai giai đoạn: giai đoạn đầu tế bào tượng tầng libe-mộc cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giai đoạn sau phát triển thành quan rễ hoàn chỉnh Dưới tác động nồng độ 10 mg/l NAA, sơ khởi rễ hình thành Bảng Ảnh hưởng thành phần mơi trường khống loại vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi (KLT), khối lượng khô (KLK) rễ từ phiến đương quy Nhật Bản ngày thứ 42 % mẫu tạo mơ Số rễ hình KLT KLK Tên cơng thứcz % mẫu tạo rễ sẹo thành/mẫu (mg/mẫu) (mg/mẫu) MM 57,1 cx 57,1 c 8c 19,7 c 2,8 c MB 33,4 d 33,4 d 2d 5,7 c 0,9 d BM 71,4 b 71,4 b 17 b 44,3 b 4,7 b BB 100,0 a 100,0 a 31 a 86,5 a 9,9 a ANOVAy KHOÁNG (A) ** ** ** ** ** VITAMIN (B) NS NS ** ** ** AxB ** ** ** ** ** CV (%) 6,3 6,3 3,5 14,8 13,9 z M hay B (bên trái): mơi trường khống MS hay khống Gamborg B5; M hay B (bên phải): vitamin Morel hay Gamborg B5; y NS, **: không khác biệt khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng LSD Test Tùy vào giai đoạn phát triển, nhu cầu dinh dưỡng loại tế bào khác Theo George & Davies (2003) [5], phát triển tế bào rễ bị kìm hãm mơi trường chứa nhiều amonium (NH4+), ngược lại rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-) Điều liên quan mật thiết đến đồng hóa đạm rễ Giai đoạn đồng hóa đạm khử nitrate, thường xảy rễ, tối Tiếp theo tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng tổng hợp protein tế bào Đặc biệt, đồng hóa đạm có đặc điểm sau: mơ non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+ Do dùng NH4+ nhiều gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ [1] Ở mơi trường khống MS, có tỷ lệ KNO3/NH4NO3 = 1,15; mơi trường Gamborg B5 tỷ lệ KNO3/(NH4)2SO4 = 18,65 Như vậy, nồng độ NH4+ thành phần khoáng MS cao gấp 10 202 lần thành phần khống Gamborg B5, gây cản trở đồng hóa đạm rễ hấp thu ion K+, Ca2+ hay Mg2+ Trong NO3- giúp cho thấm cation, K+ có vai trò cân ion (điều hòa thẩm thấu tế bào), đóng mở khí khổng, hoạt hóa enzyme tổng hợp protein Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy, nồng độ khống đa lượng mơi trường Gamborg B5 thích hợp cho việc tạo rễ từ nuôi cấy phiến đương quy Nhật Bản Vitamin tác động rõ rệt lên số rễ/mẫu khối lượng tươi, khối lượng khô rễ (bảng 4) Vitamin hợp chất cần thiết cho nhiều phản ứng sinh hóa, thiamine (B1), nicotinic acid (B3), myo-inositol, pyridoxine (B6) vitamin thường dùng nuôi cấy mô thực vật Trong thành phần vitamin Gamborg Ngoc Nhung Hoang et al B5 nồng độ thiamine cao gấp 10 lần so với nồng độ thiamine vitamin Morel Thiamine xem chất cần thiết cho trình cảm ứng tạo rễ bất định Taxus sp [2] Cơ chế chưa biết rõ đương quy Nhật Bản, số lượng rễ hình thành mẫu ni mơi trường khống vitamin Gamborg B5 cao so với công thức khác tác động thiamine KẾT LUẬN Sự tạo chồi trực tiếp đương quy Nhật Bản thực phương pháp ni cấy lớp mỏng chồi mơi trường khống MS, vitamin Gamborg B5, bổ sung 0,1 mg/l NAA, mg/1 TDZ, 30 g/l đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa 40 mg/l adenine Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng khô rễ cao phiến ni cấy mơi trường khống vitamin Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l NAA Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác nghiên cứu Trường đại học Chiba, Nhật Bản phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Avilla A., Pereira M and Arguello A., 1998 Nitrogen concentration and proportion of NH4+-N affect potato cultivar response in solid and liquid media Hort Sci., 33: 336-338 Chee P., 1995 Stimulation of adventitious rooting of Taxus species by thiamine Plant Cell Rep., 14: 753-757 Gamborg L., Miller A and Ojima K., 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res., 50: 151-158 Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M and Thrope A., 1996 Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture In Vitro Cell Dev Biol Plant, 32: 272-289 George E F., Davies W., 2003 Effects of the Physical Environment Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition 1: The Background George EF, Hall MA, Klerk GJ De (eds.) Springer, Dordrecht, Netherlands: 245-246 Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y., 1982 Immunostimultaing polysacchride separated from hot water extract of Angelica acutiloba Kitagawa (Yamato tohki) Pub Med Immunology, 47(1): 75-83 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành Nguyễn Văn Kết, 2010 Nghiên cứu khả tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ni cấy in vitro Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học tự nhiên Công Nghệ, 27: 30-36 Mok C., Mok S., Turner E., Mujer V., 1987 Biological and biochemical effects of cytokinin-active phenylurea derivatives in tissue culture systems Hort Sci., 22: 11941197 Murashige T., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant, 15(3): 473-497 10 Nandagopal S and Kumari D., 2006 Adenine sulphate induced high frequency shoot organogenesis in callus and in vitro flowering of Cichorium intybus L cv Focus - a potent medicinal plant Acta agriculturae Slovenica, 87(2): 415-425 11 Peixe A., Raposo A., Lourenỗo R., Cardoso H and Macedo E., 2007 Coconut water and BAP successfully replaced zeatin in olive (Olea europaea L.) micropropagation Scientia Horticulturae, 113: 1-7 12 Yang J S and Chuang S H., 1995 Callus formation and plant regeneration from petiole - derived calli of Angelica sinensis Plant Tis Cul Lett., 12(1): 91-93 13 Yong H., Ge L., Yan N., Tan N., 2009 The chemical composition and biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water Molecules, 14: 5144-5164 203 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 A STUDY ON ORGANOGENESIS FROM THIN CELL LAYER CULTURE OF Angelica acutiloba Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Thi Quynh1, Nguyen Vu Ngoc Anh1, Nguyen Le Anh Thu1, Toyoki Kozai2 (1) Institute of Tropical Biology, VAST (2) Chiba University, Japan SUMMARY Angelica (Angelica acutiloba) plants originating in Japan were considered as of higher value than other varieties of the genus Angelica Angelica’s roots have been used historically to treat health disorders and in many supplemental remedies in Asian traditional medicine In this study, organogenesis from thin cell layer culture of japanese Angelica shoot tips and leaf blades was shown Thin layers (1-1.5 mm thick) of shoot tips of Angelica were cultured on MS medium supplemented with NAA (0, 0.1, or 0.2 mg/l) and/or TDZ (0.1, 0.5 or mg/l) The numbe of shoots was the largest (8.9 shoots/explant) when explants were cultured on the medium supplemented with 0.1 mg/l NAA and mg/l TDZ When Morel vitamins were replaced by Gamborg’s B5 vitamins together with the addition of 10% (v/v) coconut water and 40 mg/l adenine to the culture medium, the number of shoots per explants was remarkably increased after weeks of culture In vitro Angelica leaves also proved a potential source for adventitious root production On MS medium supplemented with kinetin (0 or mg/l), NAA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), the first open leaves from the shoot tip, when cultured in dark period, had a different response to the root formation The root formation from japanese Angelica’s leaf culture significantly varied with the change of medium elements (minerals and vitamins) Percent of leaf explants having roots, number of roots per explant, root fresh and dry weights were the largest when leaf blades were cultured on the medium containing minerals and vitamins of Gamborg’s B5 Keywords: Angelica acutiloba, Adventitios root, organogenesis, plant growth substances Ngày nhận bài: 21-6-2012 204 ... auxin cytokinin đóng vai trò quan trọng phát sinh hình thái quan ni cấy mơ tế bào thực vật Vì vậy, vắng mặt NAA mơi trường ni cấy gây nên cân tỷ lệ auxin cytokinin, dẫn đến dư thừa cytokinin... sinh tổng hợp cytokinin tế bào Tỷ lệ 1:10 0,1 mg/l NAA mg/l TDZ có lẽ đạt cân phù hợp cho hình thành chồi từ ni cấy lớp mỏng chồi đương quy Vai trò vitamin, nước dừa adenine lên tạo chồi từ nuôi. .. thay cho BA nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật thời gian gần Sự có mặt TDZ mơi trường, nồng độ thấp vừa phải, thúc đẩy sinh tổng hợp cytokinin nội sinh mô thực vật nuôi cấy [7] Bên cạnh